曾 艷,張 穎,門 燕,孫媛霞

(中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津 300308)

羧甲基果聚糖的膠原肽修飾及其活性研究

曾 艷,張 穎,門 燕,孫媛霞*

(中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津 300308)

為考察羧甲基果聚糖及其衍生物在功能性食品、生物醫(yī)學(xué)及化妝品方面的應(yīng)用可行性,通過羧基與氨基的交聯(lián)反應(yīng)制備了膠原肽修飾的羧甲基果聚糖,并測試了產(chǎn)物的抗氧化、吸濕保濕活性以及其對人皮角質(zhì)HaCaT細(xì)胞生長增殖的影響。發(fā)現(xiàn)羧甲基果聚糖經(jīng)膠原肽修飾后抗氧化性明顯提高,25 mg/mL時(shí)的ABTS+·清除率為62.31%,比修飾前提高了6.11倍。盡管膠原肽的引入會(huì)對吸濕保濕性造成影響,修飾后的羧甲基果聚糖仍然保留良好的吸濕保濕性能。在相對濕度43%和81%中放置72 h的吸濕率分別為11.96%和21.54%,在干燥硅膠環(huán)境中放置72 h的保濕率為60.48%。此外,修飾產(chǎn)物在0～1 mg/mL的濃度范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性,可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖。HaCaT細(xì)胞在0.5 mg/mL修飾產(chǎn)物刺激下的存活率為124.2%。膠原肽修飾能提高羧甲基果聚糖的生物活性,拓展其在功能性食品、醫(yī)藥制品和化妝品上的應(yīng)用潛力。

羧甲基果聚糖,膠原肽,化學(xué)修飾,抗氧化性,吸濕保濕活性,細(xì)胞增殖

由于多糖的活性直接或間接地受其分子結(jié)構(gòu)影響,而化學(xué)官能團(tuán)在糖鏈上的引入,對多糖的生物活性與理化功能提升具有積極作用,因此,化學(xué)修飾是多糖構(gòu)效關(guān)系研究和多糖類藥物研制的重要手段[1]。其中,羧甲基化修飾不僅能有效改善多糖的水溶性、乳化性、抗氧化性和抗腫瘤能力等理化性質(zhì),還具有成本低、操作簡單及生成物毒性小等優(yōu)點(diǎn),在多糖的化學(xué)修飾中得到廣泛應(yīng)用,如羧甲基纖維素已作為增稠劑用于食品和藥劑配方中[2]。

作為膠原蛋白的酶解產(chǎn)物,膠原肽在保留膠原蛋白有關(guān)特性如參與細(xì)胞遷移分化增殖、生物相容性良好等的同時(shí),還兼具分子量小、更容易被人體吸收的優(yōu)點(diǎn)[3]。國外期刊報(bào)道表明,通過共價(jià)鍵在多糖骨架上引入膠原肽形成的交聯(lián)產(chǎn)物,其水溶性、抗氧化性、吸濕保濕性良好,能促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖,在保健食品、化妝品、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[4-6]。然而,關(guān)于膠原肽修飾多糖的國內(nèi)研究報(bào)道甚少,相關(guān)工作有待進(jìn)一步深入。

本實(shí)驗(yàn)以解淀粉芽孢桿菌PB6高產(chǎn)胞外果聚糖[7]為原料,通過羧基化修飾在果聚糖骨架上引入羧基后,進(jìn)一步借助羧基與氨基的交聯(lián)反應(yīng),制備膠原肽修飾的羧甲基果聚糖;并對膠原肽修飾的羧甲基果聚糖的抗氧化、保濕吸濕活性以及其對皮膚角質(zhì)細(xì)胞增殖影響進(jìn)行測試,探討其在功能性食品、醫(yī)藥制品和化妝品方面的應(yīng)用可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽(NHS)、2-嗎啉乙磺酸(MES) 分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氫氧化鈉、氯乙酸、碳酸鉀、硫酸銨、熒光素鈉、硫酸亞鐵二甲基亞砜(DMSO) 分析純,國藥試劑化學(xué)試劑有限公司;2,2-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2-Azinobis(3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnicAcid)Diammonium Salt,ABTS)、2,2′-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ) 分析純,美國Sigma-Aldirch公司;膠原肽 以鱈魚皮為原料實(shí)驗(yàn)室自制[8],分子量分布400～1500 Da;果聚糖 由實(shí)驗(yàn)室借助解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)自制[7];人皮膚永生化角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞;KCB200442YJ) 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;雙抗(Penicillin/Streptomycin)、0.25% 胰蛋白酶 美國Corning 公司;DMEM 高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS) 美國Gibco公司。

UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;Sorvall Evolution RC高速落地離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司;IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA集團(tuán);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 河南省予華儀器有限公司;FD-1-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羧甲基果聚糖的制備 參考Liu等的方法[9],取2 g果聚糖溶于80 mL異丙醇中,逐步滴入30 mL的20% NaOH溶液,常溫?cái)嚢? h后加入4 g氯乙酸,60 ℃下攪拌4 h,調(diào)pH至中性,將混合物轉(zhuǎn)移至8000～10000 Da的透析袋中,去離子水透析4 d 后,收集透析液,冷凍干燥后得到白色固體,即為羧甲基果聚糖。

1.2.2 羧甲基果聚糖的膠原肽修飾 取1.2 g羧甲基果聚糖溶于0.2 mol/L的MES緩沖液(100 mL,pH6.5)中,加入0.76 g的EDC試劑和0.24 g的NHS試劑,常溫?cái)嚢?0 h后,迅速加入0.9 g膠原肽,繼續(xù)攪拌10 min,調(diào)節(jié)體系pH到6,透析72 h,濃縮冷凍干燥。得到的白色固體即為膠原肽修飾的羧甲基果聚糖。

1.2.3 取代度測試 根據(jù)Fan等方法計(jì)算取代度,其中取代度定義為羧甲基果聚糖中每個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)單元中羧甲基被膠原肽取代的數(shù)目[10]。在1～30 mg/L濃度下,膠原肽在200 nm的紫外吸收值與其濃度成正比,其濃度-紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線見式(1)。以羧甲基果聚糖為空白對照,測定30 mg/L膠原肽修飾羧甲基果聚糖產(chǎn)物在200 nm的紫外吸收,通過式(1)計(jì)算折算其膠原肽的當(dāng)量濃度,再根據(jù)式(2)計(jì)算取代度DS。

A=38.03C-0.0007

式(1)

式(2)

1.2.4 紅外光譜檢測 稱取干燥后的樣品2 mg與150 mg 的KBr混合研磨后壓片,上機(jī)掃描分析,掃描范圍400～4000 cm-1。

1.2.5 抗氧化性測試 通過ABTS+·清除能力、氧自由基清除能力和鐵還原能力實(shí)驗(yàn)測試抗氧化性。

1.2.5.1 ABTS+·清除能力測定 采用張換等[11]的方法測定樣品對ABTS+·的清除能力。將ABTS+·(7 mmol/L,5 mL)和過硫酸鉀溶液(140 mmol/L,88 μL)混合,室溫避光反應(yīng)12～16 h,制備ABTS+·儲備液。使用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.4)將儲備液稀釋至其在734 nm波長處吸光度(A)為0.70±0.02。取100 μL不同質(zhì)量濃度(0～25 mg/mL)的待測樣品水溶液,加入3 mL 的ABTS+·溶液,避光反應(yīng)6 min,記錄其在734 nm波長處的吸光度為A樣品。以100 μL純水代替樣品,相同操作,記錄其在734 nm波長處的吸光度為A空白。按式(3)計(jì)算樣品清除ABTS+·的清除率。

式(3)

1.2.5.2 氧自由基清除能力測定(oxygen radical absorbance capacity,ORAC) 采用Yan Zeng等[12]的方法,使用Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測試。于96孔板微孔中加入熒光素鈉鹽(70 nmol/L,120 μL)和20 μL待測樣品,在37 ℃條件下孵育10 min,迅速加入AAPH(12.8 mmol/L,60 μL)后,每隔1 min測量樣品在485 nm激發(fā)條件下,528 nm處熒光發(fā)射的強(qiáng)度變化。以水溶性的VE衍生物Trolox(終濃度:1～8 μmol/L)替代不同質(zhì)量濃度(0.5～10 mg/mL)的樣品水溶液,同板同時(shí)操作,用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定時(shí)間為90 min,各樣品不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度分別記為F0、F1、F2…F90。其中,F0為0 min時(shí)的熒光值,Fn為第n min的熒光值。按式(4)計(jì)算樣品熒光變化零階矩曲線下面積(areaunder curve,AUC)。

式(4)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式(5)計(jì)算樣品對應(yīng)的Trolox濃度,即ORAC值,以mmol Trolox/g表示。

AUC=5.298C+30.291R2=0.9984

式(5)

式(5)中,C為Trolox濃度(μmol/L)。

1.2.5.3 鐵離子還原能力測定(ferric reducing antioxidant power,FRAP) 采用張穎等[1]的方法測試鐵離子還原能力。配制新鮮FRAP反應(yīng)液:300 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH3.6),10 mmol/L的TPTZ溶液(40 mmol/L HCl為溶劑)以及20 mmol/L的FeCl3溶液,三者以體積比10∶1∶1混合后,于37 ℃水浴保溫。取100 μL樣品溶液與3 mL鐵還原(FRAP)試劑混勻后于37 ℃水浴中反應(yīng)5 min,測定體系在593 nm的吸光值A(chǔ)。同時(shí)取濃度0～1.0 mmol/L的FeSO4溶液替代樣品反應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式(6)計(jì)算樣品對應(yīng)的FeSO4濃度,即FRAP值,以μmol Fe2+/g表示。

A=0.4148C+0.0489R2=0.9995

式(6)

式(6)中,C為Fe2+濃度(mmol/L)。

1.2.6 吸濕保濕性測試 參考Ping Shao等[13]的方法,在室溫20 ℃下進(jìn)行吸濕保濕性測定。

1.2.6.1 吸濕性測試 準(zhǔn)確稱取0.5 g在100 ℃下干燥4 h的樣品,分別置于以碳酸鉀飽和溶液維持相對濕度43%和以硫酸銨飽和溶液維持相對濕度81%的干燥器中,間隔一定時(shí)間稱量放置前的樣品質(zhì)量(W0)和放置后的樣品質(zhì)量(Wn),根據(jù)式(7)計(jì)算吸濕率:

式(7)

1.2.6.2 保濕性測試 準(zhǔn)確稱取0.5g在100 ℃下干燥4h的樣品,加入樣品10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的水分,置于裝有干燥變色硅膠的干燥器中,間隔一定時(shí)間稱量樣品放置前的水分質(zhì)量(H0)和放置后的水分質(zhì)量(Hn),根據(jù)式(8)計(jì)算保濕率:

式(8)

1.2.7 皮膚成纖維細(xì)胞生長增殖測試 參考陳俊等[14]的方法,進(jìn)行皮膚成纖維細(xì)胞生長和增殖測試實(shí)驗(yàn)。

1.2.7.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人皮角質(zhì)HaCaT細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS與1%雙抗)中,于37 ℃、5%CO2飽和濕度孵育箱培養(yǎng),每隔2～3d換一次培養(yǎng)液,待細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化,并進(jìn)行傳代培養(yǎng),取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力測試。

1.2.7.2 細(xì)胞活力測試HaCaT細(xì)胞以6×103個(gè)/孔密度接種于96孔板,于37 ℃、5%CO2飽和濕度孵育箱培養(yǎng)24h后,使用含0、0.05、0.1、0.5、1.0mg/mL樣品的DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS與1%雙抗)等體積地取代原培養(yǎng)液(200μL),繼續(xù)培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)液,每孔加入10μL的MTT溶液(終濃度為0.5mg/mL),繼續(xù)孵育4h后,4500r/min離心10min,棄去上清,加入150μLDMSO,溶解活細(xì)胞與MTT生成的甲臜,震蕩10min,利用酶標(biāo)儀測試各孔在490nm的吸光值A(chǔ)。按式(9)計(jì)算細(xì)胞活力:

式(9)

1.2.8 數(shù)據(jù)處理方法 測試結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,并采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差兩兩比較分析,p<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)表征

膠原肽(COP)、羧甲基果聚糖(CP)和膠原肽修飾的羧甲基果聚糖(COP-CP)的紅外光譜見圖1。羧甲基果聚糖CP除具有多糖類的紅外特征吸收峰(如3421 cm-1的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰與2937 cm-1的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰)外,還在1601 cm-1出現(xiàn)羧基基團(tuán)的C-O 伸縮振動(dòng)吸收峰,在1412 cm-1處出現(xiàn)與羧基相連的-CH2-的剪式振動(dòng)吸收峰,說明-CH2COO-基團(tuán)被成功引入到果聚糖上[15]。而膠原肽修飾羧甲基果聚糖的產(chǎn)物,在保有羧甲基果聚糖的紅外特征吸收峰外,還出現(xiàn)了可在膠原肽紅外光譜中觀察到的1654 cm-1與1546 cm-1處酰胺基和伯胺基伸展振動(dòng)峰,這一結(jié)果與Fan等報(bào)道一致[10],說明羧甲基果聚糖被膠原肽成功修飾。

圖1 膠原肽修飾羧甲基果聚糖的傅里葉紅外光譜表征Fig.1 FT-IR analysis of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides

電位滴定實(shí)驗(yàn)[16]測定羧甲基果聚糖中的羧甲基取代度為0.289。通過測試羧甲基果聚糖在膠原肽修飾前后的200 nm紫外吸收變化,計(jì)算出膠原肽在羧甲基果聚糖修飾中的取代度為0.0374,這說明有12.94%的羧甲基官能團(tuán)被膠原肽完全取代?？紤]到不同多糖在同一反應(yīng)條件下的化學(xué)修飾程度不同,雖然實(shí)驗(yàn)中的羧甲基果聚糖制備及后續(xù)的膠原肽修飾均參考相關(guān)文獻(xiàn)的最優(yōu)條件進(jìn)行,推測反應(yīng)參數(shù)的后期優(yōu)化仍然可以調(diào)整修飾產(chǎn)物中膠原肽取代羧甲基的比例,從而對修飾后的羧甲基果聚糖的功能活性造成影響。

2.2 抗氧化性

作為多糖的重要生物學(xué)活性之一,多糖的抗氧化性及其作用機(jī)理在功能食品與藥品開發(fā)上倍受關(guān)注,相關(guān)研究日趨廣泛和深入。有研究表明羧甲基化修飾不能確保多糖的抗氧化性提高,甚至可能造成相反效果[17]。與此報(bào)道結(jié)果類似,本實(shí)驗(yàn)中的解淀粉芽孢桿菌果聚糖經(jīng)羧甲基化修飾后,抗氧化能力基本沒有變化(果聚糖數(shù)據(jù)未給出)。而膠原肽的引入會(huì)明顯提高羧甲基果聚糖的抗氧化能力。

如圖2所示,隨樣品濃度的增加,膠原肽修飾的羧甲基果聚糖對ABTS+·的清除能力也在不斷增強(qiáng),兩者呈劑量關(guān)系。在25 mg/mL下,膠原肽修飾的羧甲基果聚糖對ABTS+·的清除率為62.31%,比修飾前提高了6.11倍。除ABTS+·的清除能力有顯著提高(p<0.05)外,膠原肽修飾后的羧甲基果聚糖氧自由基清除能力ORAC值與鐵離子還原能力FRAP值也顯著提高,分別增長了3.02倍和40%(p<0.05)。不同來源膠原肽的抗氧化活性有所不同。如賈建萍等報(bào)道鱈魚皮膠原肽具有較強(qiáng)的清除ABTS+·的能力,而驢皮膠原肽具有較強(qiáng)的還原力[18]。由于本實(shí)驗(yàn)中的膠原肽來源于鱈魚皮,因此其提高羧甲基果聚糖的鐵還原能力效果有限。后期可以針對羧甲基果聚糖修飾產(chǎn)物的抗氧化性具體要求,對不同來源的膠原肽進(jìn)行篩選,從中選擇合適的原料修飾羧甲基果聚糖。

圖2 膠原肽修飾羧甲基果聚糖產(chǎn)物對ABTS+·的清除率Fig.2 ABTS+·radical scavenging ability of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides 注:使用不同小寫字母標(biāo)記同一濃度下不同樣品測試值的顯著差異(p<0.05),圖4同。

表1 膠原肽修飾羧甲基果聚糖的氧自由基清除能力ORAC值與鐵離子還原能力FRAP值

注：使用不同字母標(biāo)記測試值的顯著差異(p<0.05)。

2.3 吸濕保濕性

由于吸濕保濕劑具有防止水分損失的作用,經(jīng)常用于果餞和焙烤食品中。除此之外,吸濕保濕劑還有助于皮膚角質(zhì)層在干燥的空氣中保持正常水分(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:10%～20%),防止皮膚因水分不足而產(chǎn)生皺裂、粗糙等。本實(shí)驗(yàn)以甘油(glycerol)為對照,測試了膠原肽(COP)、羧甲基果聚糖(CP)和膠原肽修飾的羧甲基果聚糖(CP-COP)的吸濕和保濕能力。

如圖3a所示,在飽和K2CO3(相對濕度43%)低濕環(huán)境下,COP、CP-COP、CP和glycerol在實(shí)驗(yàn)24 h的吸濕率分別為9.37%、11.03%、14.24%和15.71%,各樣品吸濕率的差異顯著(p<0.05)。之后,除對照glycerol的吸濕能力隨時(shí)間延長繼續(xù)增強(qiáng)外,其余樣品的吸濕率幾乎保持不變。樣品的吸濕性大小順序?yàn)?glycerol>CP>CP-COP>COP，其中CP-CPO在放置72 h的吸濕率為11.96%。但值得注意的是,在測試前期12 h內(nèi)CP的吸濕速率和效果均要優(yōu)于glycerol,而CP-COP的吸濕速效與glycerol持衡。樣品在飽和(NH4)2SO4(相對濕度81%)高濕環(huán)境中的吸濕率變化如圖3b所示,隨時(shí)間延長,COP、CP和CP-COP的吸濕率增大,在36 h基本達(dá)到平臺期。而對照glycerol的吸濕率在測試時(shí)間內(nèi)一直保持穩(wěn)定增加。樣品在36 h的吸濕性大小順序依舊為:glycerol(36.16%)>CP(24.08%)>CP-COP(21.35%)>COP(21.22%)。然而CP-COP與CP、COP在吸濕率上的差異并不顯著(p>0.05)，其中CP-COP在放置72 h的吸濕率為21.54%。說明與低濕環(huán)境相比,CP、CP-COP和COP三者在高濕環(huán)境中的吸濕能力差異變小。此外,COP、CP和CP-COP的在低濕與高濕環(huán)境下的吸濕能力均高于報(bào)道的擬目烏賊生殖腺堿提多糖以及常規(guī)保濕劑聚乙二醇6000、殼聚糖[19]。

圖3 膠原肽修飾羧甲基果聚糖產(chǎn)物在不同濕度環(huán)境下的吸濕保濕性能Fig.3 The moisture absorption and moisture retention abilities of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides under different humidity environment注:(a)RH 43%濕度環(huán)境,(b)RH 81%濕度環(huán)境,(c)干燥環(huán)境;使用不同小寫字母標(biāo)記同一時(shí)間下不同樣品測試值的顯著差異(p<0.05)。

在變色硅膠維持的無水干燥條件下,各樣品的保濕率均有減小(圖3c)。其中,COP、CP和CP-COP的保濕率下降趨勢在36 h后趨于飽和,而對照glycerol的保濕率仍隨時(shí)間延長明顯降低。在72 h時(shí)glycerol、COP、CP-COP和CP的保濕率分別為32.09%、47.76%、60.48%和66.55%,其中,CP-COP與CP的保濕率無顯著差異(p>0.05)。這說明膠原肽(COP)、羧甲基果聚糖(CP)和膠原肽修飾的羧甲基果聚糖(CP-COP)均具有較強(qiáng)的保濕能力,其保濕效果不僅優(yōu)于對照甘油,也高于報(bào)道的羅耳阿太菌胞外多糖[20]和紅棗水解多糖[21]。

羧甲基果聚糖經(jīng)膠原肽修飾后,雖然抗氧化能力明顯提高,但吸濕、保濕性能有所下降。這是因?yàn)楸荒z原肽修飾后,羧甲基果聚糖中能與水形成氫鍵、穩(wěn)定結(jié)合的極性羧基官能團(tuán)的數(shù)目在減少。實(shí)驗(yàn)中膠原肽對羧甲基官能團(tuán)的取代度為12.94%,其相應(yīng)修飾產(chǎn)物在吸濕、保濕性能上的變化明顯小于在抗氧化性上的變化。說明膠原肽修飾對羧甲基果聚糖的影響主要表現(xiàn)在抗氧化性上,而通過控制膠原肽修飾的反應(yīng)條件,可以調(diào)控羧甲基果聚糖衍生產(chǎn)物在抗氧化性與吸濕、保濕性能之間的協(xié)衡關(guān)系。

2.4 對皮膚成纖維細(xì)胞生長和增殖影響

角質(zhì)細(xì)胞作為真皮內(nèi)主要的修復(fù)細(xì)胞,對皮膚適度的自我代謝有重要作用,其增殖生長對于維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和生理功能具有重要意義。如白曉智等發(fā)現(xiàn),白芷活性提取物濃度為0.05～0.5 mg/mL時(shí),均能促進(jìn)人角質(zhì)形成HaCaT細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,有利于皮膚創(chuàng)面愈合[22]。本實(shí)驗(yàn)使用MTT法考察膠原肽(COP)、羧甲基果聚糖(CP)和膠原肽修飾的羧甲基果聚糖(CP-COP)對人皮膚角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)生長影響,結(jié)果如圖4所示。在0～1 mg/mL濃度范圍內(nèi),COP、CP和CP-COP不僅無明顯毒性,還可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖,具有較好的生物相容性。其中,COP與CP-COP在0～0.5 mg/mL的促進(jìn)細(xì)胞增殖能力與其濃度呈劑量關(guān)系。在0.5 mg/mL下,COP、CP-COP兩者與CP的促增殖效果存在顯著差異(p<0.05),三者作用下的HaCaT細(xì)胞存活率分別為128.7%、124.2%與111.9%。說明膠原肽修飾能增強(qiáng)羧甲基果聚糖促進(jìn)人皮膚角質(zhì)細(xì)胞增殖的效果,更有利于其在皮膚修復(fù)方面的生物活性提升。此外,本實(shí)驗(yàn)中膠原肽修飾羧甲基果聚糖對HaCaT細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果與張鑫等報(bào)道類似。其發(fā)現(xiàn)林蛙皮多肽質(zhì)量濃度為50～3000 mg/L時(shí),對HaCaT細(xì)胞均有顯著性促進(jìn)增殖的作用。在50～800 mg/L范圍內(nèi),隨著多肽質(zhì)量濃度的升高,活性多肽對HaCaT細(xì)胞的促進(jìn)增殖作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)[23]。

圖4 膠原肽修飾羧甲基果聚糖產(chǎn)物對HaCat細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides on theproliferation of HaCat cells

3 結(jié)論

膠原肽對羧甲基果聚糖的修飾,能大幅度提高羧甲基果聚糖的抗氧化性。不僅如此,修飾產(chǎn)物還保留了良好的保濕吸濕活性,與皮膚親合性好,對細(xì)胞無毒性,能有效促進(jìn)人皮角質(zhì)細(xì)胞增殖?；谏鲜鎏匦?膠原肽修飾能提高羧甲基果聚糖應(yīng)用于功能性食品、醫(yī)藥制品和化妝品上的潛力。

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Preparation and characterization of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides

ZENG Yan,ZHANG Ying,MEN Yan,SUN Yuan-xia*

(Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China)

To investigate the possible application of carboxymethylatedlevan and its derivative on functional food,cosmetics and medicine,collagen peptides were used to modify carboxymethylated levan through the cross-linking reaction between carboxyl group and amino group. Moreover,the antioxidant activity and the moisture absorption and retention capacities of the modified product,as well as its effect on the viability of human skin keratinocyte cells(HaCaT cells)were evaluated. After modified withcollagen peptides,the antioxidant activity of carboxymethylatedlevan was obviously improved. The scavenging rate of the product on ABTS+· was 6.11 times higher than that before modification,with the scavenging rate of 62.31% at 25 mg/mL. Though collagen peptides had some negative effect on the moisture absorption and retention capacities of the product,its modified carboxymethylatedlevan still had good moisture absorption and retention capacities. The moisture-absorbing rate of the product under the relative humidity of 43% and 81% was 11.96% and 21.54% at 72 h,respectively. The moisture retention capacity after desiccation in the silica gel chamber for 72 h was 60.48%. Furthermore,carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides showed no cytotoxicity in the concentration of 0～1 mg/mL and could promote the proliferation of HaCaT cells. Under the stimulation of the modified product at 0.5 mg/mL,the cell viability of HaCaT cells reached 124.2%. The results showed that the modification with collagen peptides could improve the bioactivity of carboxymethylatedlevan,and extend its potential application on functional food,medicine and cosmetics.

carboxymethylatedlevan;collagen peptides;chemical modification;antioxidant activity;moisture absorption and retention capacities;cell viability

2016-12-08

曾艷(1982-)，女，博士，副研究員，研究方向：天然功能活性物質(zhì)開發(fā)，E-mail：zeng_y@tib.cas.cn。

*通訊作者:孫媛霞(1963-)，女，博士，研究員，研究方向：功能糖與天然活性物質(zhì)，E-mail:sun_yx@tib.cas.cn。

863計(jì)劃(2013AA102105；2014AA022108)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)09-0049-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.001