曹 芳，段 萍，王洪平，張友波，譚 輝，楊秀偉△

(1.黔南州民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，貴州都勻 558000； 2.黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州都勻 558000；3.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；4.黔南州中醫(yī)醫(yī)院普外科，貴州都勻 558000)

高效液相色譜法測定頭花蓼凍干粉中槲皮素和槲皮苷的含量*

曹 芳1，段 萍2，王洪平3，張友波3，譚 輝4，楊秀偉3△

(1.黔南州民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，貴州都勻 558000； 2.黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州都勻 558000；3.北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；4.黔南州中醫(yī)醫(yī)院普外科，貴州都勻 558000)

目的 建立測定頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的含量測定方法。方法 采用高效液相色譜(HPLC)法測定頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的含量。結(jié)果 槲皮素在0.020 9～0.157 0 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=1.000 0，平均回收率為101.49%，RSD為1.93%；槲皮苷在0.368～2.760 μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 9；平均回收率為98.87%，RSD為2.46%。結(jié)論 該方法測定頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的含量,結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性較好。

蓼科；色譜法，高壓液相；頭花蓼；槲皮素；槲皮苷；高效液相色譜

頭花蓼又名石莽草、四季紅、紅酸桿等，屬于蓼科、蓼屬、頭狀蓼組多年生草本植物，全草入藥[1]。多用于治療泌尿系統(tǒng)疾病[2]。有關(guān)頭花蓼的化學(xué)成分主要有黃酮類、酚酸類、揮發(fā)油、有機(jī)酸等[3-9]。自李勇軍等[3]從頭花蓼中分離鑒定了槲皮素、槲皮苷、陸地棉苷、槲皮素-3-o-(2′′-沒食子?；?-鼠李糖苷后，多位學(xué)者相繼從頭花蓼中也分離得到了黃酮類化合物[4-6]。其中黃酮類化合物是蓼屬植物中普遍存在的一種成分，具有各種生物活性[10]。本研究旨在通過建立同一條件下同時(shí)分離頭花蓼藥材中兩種黃酮類化合物槲皮素、槲皮苷的高效液相色譜(HPLC)法，并測定其在藥材中的含量，為今后研究其在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 島津2401紫外分光光度計(jì)，HPLC儀(Agilent1260，島津LC-2010A)，SK250LHC超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)儀器有限公司)，電子天平(梅特勒AG135、AL204)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 乙腈(色譜純)，水為娃哈哈純凈水；槲皮苷(對照品批號為111538-201105，含量92.7%)、槲皮素對照品(批號為111538-200301，含量97.3%)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。頭花蓼凍干粉由頭花蓼全草的70%的醇提液冷凍干燥而得，作為供試樣品。頭花蓼全草采于貴州省黔東南州施秉縣，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物與仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊秀偉教授鑒定為頭花蓼(polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don)。

1.2 方法

1.2.1 色譜柱 Agilent ODS C18(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)；迪馬Diamonsil ODS C18(250.0 mm×4.6 mm，5 μm) ，流動(dòng)相為0.3%醋酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫， 0～5 min，92%～90% A；5～20 min，90%～75% A；20～40 min，75%～50% A，40～41 min，50%～92% A，41～50 min，92%A。檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL，流 速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。理論板數(shù)以槲皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

1.2.2 對照品溶液 精密稱取槲皮苷、槲皮素適量，加甲醇制成每毫升約含槲皮素8 μg,槲皮苷0.18 mg的溶液。

1.2.3 混合對照品溶液 精密稱取槲皮素對照品10.32 mg，置50 mL量瓶中，精密量取5 mL置200 mL量瓶中，另精密稱取槲皮苷對照品15.23 mg置同1個(gè)200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度,制得槲皮素、槲皮苷混合對照品溶液(5.020 7、70.591 1 μg/mL)。

1.2.4 供試品溶液 取樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，玻璃珠數(shù)粒，稱質(zhì)量，超聲0.5 h，再加熱回流1.0 h，放冷，再稱質(zhì)量，減失的重量用甲醇補(bǔ)足，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性考察 槲皮苷、槲皮素的紫外掃描圖均在254 nm處有最大吸收。取供試品、對照品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，按色譜條件測定，結(jié)果見圖1。供試品圖譜中，槲皮苷、槲皮素的保留時(shí)間與對照品圖譜一致，與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

2.2 線性關(guān)系的實(shí)驗(yàn) 精密吸取槲皮苷、槲皮素混合對照品溶液2、5、8、10、15 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，槲皮素、槲皮苷線性回歸方程為：槲皮素 A=4 247.968C+2.680，r=1.000 0；槲皮苷 A=2 981.723C+44.992，r=0.999 9。結(jié)果表明槲皮苷在0.368～2.760 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系；槲皮素在0.020 9～0.157 0 μg內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，槲皮素、槲皮苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.74%、0.35%，結(jié)果表明此法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，槲皮素、槲皮苷峰面積的RSD分別為1.02%、0.71%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

A：槲皮苷；B：槲皮苷、槲皮素混合對照品溶液；C：供試品溶液。1：槲皮苷；2：槲皮素。

圖1 頭花蓼凍干粉中槲皮苷、槲皮素的HPLC圖譜

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按供試品溶液制備法制備6份供試品溶液，精密吸取槲皮素、槲皮苷混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按色譜條件分別測定峰面積。槲皮素、槲皮苷的平均含量分別為0.401 5、8.856 3 mg/g，RSD分別為2.75%、0.91%。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取0.25 g樣品(槲皮素、槲皮苷的平均含量分別為0.401 5、8.856 3 mg/g)6份，置具塞錐形瓶中，精密加入槲皮素、槲皮苷混合對照品溶液25 mL，玻璃珠數(shù)粒，稱質(zhì)量，超聲0.5 h，再水浴回流1.0 h，放冷，再稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，進(jìn)樣10 μL；另取槲皮素、槲皮苷混合對照品溶液10 μL,同法測定。平均回收率分別為101.50%、98.87%；RSD分別為1.93%、2.46%，見表1。

表1 頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品含量測定 取不同采擇時(shí)間制備的頭花蓼凍干粉，編號分別為20130321、20130518，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，精密吸取槲皮素、槲皮苷對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按色譜條件進(jìn)行測定，分別記錄峰面積。結(jié)果，20130321的樣品中槲皮素、槲皮苷的含量分別為0.401 5、8.856 3 mg/g(n=3)；20130518的樣品中槲皮素、槲皮苷的含量分別為0.387 7、8.825 8mg/g(n=3)。

3 討 論

頭花蓼化學(xué)成分中含黃酮類化合物，黃酮類化合物有各種生物活性，它們在蓼屬植物中是普遍存在的一種成分[10]。國內(nèi)多位學(xué)者采用不同的方法對頭花蓼中黃酮類化合物的含量進(jìn)行了測定[11]。本課題組以頭花蓼中的槲皮素、槲皮苷兩種黃酮類化合物為指標(biāo)，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了同一條件下分離測定這兩種化合物含量的HPLC法。

本研究以0.3%醋酸溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相梯度洗脫，使槲皮素、槲皮苷與其他組分、槲皮素、槲皮苷兩者之間色譜峰均分離良好。

比較甲醇作溶劑，加熱回流1.0 h、超聲1.0 h及先超聲0.5 h，再加熱回流1.0 h，以超聲0.5 h，再加熱回流1.0 h所測槲皮素、槲皮苷的含量較高。

此方法的建立，對今后開展頭花蓼中部分黃酮類化合物對動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)的研究有重要意義。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.034

貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金資助(gzwkj2012-1-074)。 作者簡介：曹芳(1971-)，副教授，本科，主要從事中草藥藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)方面研究?！?/p>

，E-mail:xwyang@bjmu.edu.cn。

R917

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1671-8348(2017)14-1972-02

2016-11-27

2017-01-15)