劉錦 李亦晴 黃顯德 房樂+李向東+田延平

摘要：將黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）的外殼蛋白（coat protein，CP）基因克隆到原核表達(dá)載體pEHISTEV上獲得pEHISTEV-CGMMV-CP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出分子量為19.5 kD的CGMMV CP融合蛋白。切膠回收誘導(dǎo)表達(dá)的CGMMV CP免疫家兔，制備抗血清。Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，制備的抗血清能與CGMMV CP發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，與同屬的煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）無(wú)反應(yīng)。瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定，制備抗血清的效價(jià)為1∶16，ELISA測(cè)定效價(jià)為1∶1024。該血清特異性強(qiáng)、效價(jià)高，可用于CGMMV的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒；外殼蛋白基因；原核表達(dá)；抗血清

中圖分類號(hào)：S436.421.1：Q784文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）05-0010-04

Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of Cucumber

green mottle mosaic virus Coat Protein Gene

Liu Jin1， Li Yiqing2， Huang Xiande1， Fang Le1， Li Xiangdong1， Tian Yanping1

（1. Department of Plant Pathology， College of Plant Protection， Shandong Agricultural University，

Taian 271018， China； 2. College of Biological Science and Technology， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China）

AbstractThe coat protein （CP） gene of Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） was cloned into the prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce pEHISTEV-CGMMV-CP， which was transformed into competent cells of Escherichia coli Rosetta. Upon induction with IPTG， a fusion protein of 19.5 kD was expressed from the vector pEHISTEV-CGMMV-CP. The fusion protein was recovered from the gel and used to immunize rabbit for antiserum preparation. The resultant antiserum showed strong positive reaction with CP of CGMMV， but not with that of Tobacco mosaic virus， in Western Blotting assay. The titter of antiserum was 1∶16 in agarose immuno diffusion and 1∶1024 in ELISA. The antiserum prepared in this research had high titer and specificity and could be used in the detection of CGMMV.

KeywordsCucumber green mottle mosaic virus； CP gene； Prokaryotic expression； Antiserum

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）帚狀病毒科（Virgaviridae）[1]。該病毒主要侵染黃瓜（Cucumis sativus）、葫蘆（Lagenaria siceraria）、甜瓜（Cucumis melo）、絲瓜（Luffa cylindrica）、苦瓜（Momordica charantia）、西瓜（Citrullus lanatus）等葫蘆科作物，常造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，CGMMV還侵染莧色藜（Chenopodium amaranticolor）等藜科植物以及模式植物本氏煙（Nicotiana benthamiana）等[2-7]。CGMMV粒子呈直桿狀，約300 nm×18 nm，基因組為線性正單鏈RNA，全長(zhǎng)約6 400個(gè)核苷酸，主要由兩端的非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）和中間的4個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成，其中ORF4編碼17.3 kD的外殼蛋白（coat protein，CP）[8]。

CGMMV在田間主要通過(guò)汁液接觸傳播，也可通過(guò)種子攜帶傳播[9]。種植無(wú)病毒種苗及早期檢測(cè)是防治CGMMV的關(guān)鍵。血清學(xué)方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高和適合檢測(cè)大量樣品等特點(diǎn)，廣泛用于瓜類病毒病的檢測(cè)中。本研究選用質(zhì)粒pEHISTEV構(gòu)建CGMMV濟(jì)南分離物CP基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中高效表達(dá)CGMMV外殼蛋白，并以此為抗原制備抗血清，所得到的抗血清可用于CGMMV檢測(cè)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試西瓜葉片樣品（感染CGMMV）采自濟(jì)南市濟(jì)陽(yáng)縣[10]。純化后的CGMMV和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）分別在本氏煙和普通煙上保存。原核表達(dá)載體pEHISTEV由英國(guó)圣安德魯斯大學(xué)劉煥庭教授饋贈(zèng)；大腸桿菌菌株DH5α、大腸桿菌Rosetta均由本實(shí)驗(yàn)室保存；反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、 限制性內(nèi)切酶 （EcoRⅠ、XhoⅠ）、T4 DNA連接酶、dNTP、無(wú)RNase水等購(gòu)自TaKaRa公司；RNeasy Plant Mini Kit購(gòu)自Qiagen；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 Plus和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京全式金公司；其它生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體構(gòu)建

利用RNeasy Plant Mini Kit提取西瓜葉片總RNA，以CGMMV CP基因下游引物5′-CCCTCGAGCTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCCT-3′（下劃線部分為Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用CP基因上游引物5′-CGGAATTCATGGCTTACAATCCGATCACAC-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）和下游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增CGMMV CP基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后回收，用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后，與同樣酶處理的載體pEHISTEV在4℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物pEHISTEV-CGMMV-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)經(jīng) PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，以確保序列正確。

1.3蛋白表達(dá)和SDS-PAGE分析

將pEHISTEV-CGMMV-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta。挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 μg/mL卡那霉素），37℃活化過(guò)夜，次日按1∶100稀釋到20 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)3 h （OD600為0.4～0.6），加IPTG至終濃度0.2 mmol/L，繼續(xù)于25℃、220 r/min培養(yǎng)5 h。

離心收集菌體，加適量TE溶液（pH值8.0），振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，冰凍5 min，12 000 r/min離心10 min后進(jìn)行SDS-PAGE。

1.4抗血清制備

將原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12% SDS-PAGE電泳后，用預(yù)冷的0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT染色，切取含有目的蛋白的膠條，按1∶1比例（W/V）加入0.9%生理鹽水在預(yù)冷的研缽中研磨。將獲得的目的蛋白加入等體積的弗氏不完全佐劑乳化后，經(jīng)背部和皮下多點(diǎn)注射免疫家兔，共免疫3次。第一次免疫劑量為1 mg，之后每隔10天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量為0.6 mg，最后一次免疫后7天耳靜脈取血測(cè)定抗血清效價(jià)?？寡寮尤?.02%的疊氮化鈉于-20℃保存。

1.5抗血清特異性、效價(jià)和靈敏度分析

利用Western Blotting[11]測(cè)定制備的抗血清與CGMMV及同屬的TMV有無(wú)反應(yīng)，評(píng)價(jià)抗血清的特異性。利用瓊脂免疫雙擴(kuò)散和 ACP-ELISA測(cè)定抗血清的效價(jià)[12]。制備的抗血清按1∶20～1∶213進(jìn)行梯度稀釋。ELISA測(cè)定中，顯色后用酶標(biāo)儀讀取405 nm的OD值，I（待測(cè)樣品讀數(shù)-空白讀數(shù)）/H（陰性樣品的讀數(shù)-空白讀數(shù)）≥3判斷為陽(yáng)性反應(yīng)。將感染CGMMV的本氏煙葉片病汁液進(jìn)行梯度稀釋（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256），然后進(jìn)行Western Blotting分析，檢測(cè)抗血清的靈敏度。

2結(jié)果與分析

2.1CGMMV CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用CGMMV CP基因的上游和下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到486 bp的片段。將PCR產(chǎn)物回收純化后用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，與同樣酶處理的pEHISTEV載體連接，獲得重組質(zhì)粒pEHISTEV-CGMMV-CP。對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定（圖1），并通過(guò)測(cè)序證明其序列和閱讀框正確。

2.2CGMMV CP的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

將pEHISTEV-CGMMV-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，經(jīng)0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示，在19.5 kD附近有一條蛋白帶（圖2），這是CGMMV CP基因與載體pEHISTEV上的His-Tag、TEV蛋白酶酶切位點(diǎn)基因融合表達(dá)的蛋白。結(jié)果與預(yù)期相符，表明CGMMV CP在大腸桿菌中得到了正確的表達(dá)。

2.3抗血清特異性

經(jīng)Western Blotting分析，在用含pEHISTEV-CGMMV-CP的菌液上樣的泳道中出現(xiàn)一條分子量為19.5 kD的蛋白帶，而用含空載體pEHISTEV的菌液上樣的泳道中沒有出現(xiàn)（圖3），說(shuō)明制備的抗血清與原核表達(dá)載體pEHISTEV-CGMMV-CP表達(dá)的CGMMV CP有特異性免疫反應(yīng)。抗血清與CGMMV侵染的本氏煙葉片提取液有特異性免疫反應(yīng)（圖4），而與健康本氏煙葉片提取液及同屬的TMV均無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明制備的抗血清有非常好的特異性。

2.4抗血清效價(jià)及靈敏度

瓊脂免疫雙擴(kuò)散結(jié)果表明，抗血清的效價(jià)為1∶16；ACP-ELISA結(jié)果表明，抗血清效價(jià)為1∶1024。Western Blotting結(jié)果表明，在病汁液稀釋2～16倍時(shí)，NC膜上出現(xiàn)明顯的黑色條帶；在病汁液稀釋到128倍時(shí)，依然可以看到較為明顯的條帶，說(shuō)明該血清具有較高的靈敏度（圖5）。

M： 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～8：感病本氏煙葉片病汁液梯度稀釋（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256）；9∶健康本氏煙汁液。

3結(jié)論

利用提純病毒制備的抗血清中常含有寄主蛋白的抗體，容易導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)[13]。另外，有些病毒在病組織中的含量低，不易獲得大量高純度病毒。利用原核細(xì)胞表達(dá)病毒基因的產(chǎn)物作為抗原可以得到特異性強(qiáng)的抗血清，較好地解決以上問(wèn)題。TMV與CGMMV同屬煙草花葉病毒屬，彼此的血清間容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)[14]。本研究以在大腸桿菌中表達(dá)的CP為抗原制備了CGMMV的抗血清，該血清效價(jià)高、特異性強(qiáng)，可用于瓊脂免疫雙擴(kuò)散、ELISA和Western Blotting分析，為CGMMV的快速檢測(cè)及病毒的致病機(jī)理研究提供了條件。

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