徐 娜，李 鑫，孫甸甸，徐亞維，尹 銳

(吉林農(nóng)業(yè)科技學院 生物工程學院，吉林 吉林 132101)

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鹿中結(jié)核分枝桿菌最佳DNA提取方法探索

徐 娜，李 鑫，孫甸甸，徐亞維，尹 銳

(吉林農(nóng)業(yè)科技學院 生物工程學院，吉林 吉林 132101)

對樹脂法、改良CTAB法和國標法三種方法獲得的鹿中結(jié)核分枝桿菌DNA進行比較，通過核酸擴增鑒定和瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)改良CTAB法獲得的基因組DNA最佳，配合PCR技術(shù)檢測靈敏度達到100 fg，且能對低含量樣本進行快速檢測。

鹿；結(jié)核分枝桿菌；DNA提取

鹿結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的慢性、消耗性傳染病，主要由牛型和人型結(jié)核分枝桿菌引起，臨床癥狀為極度消瘦、呼吸困難，有的甚至癱瘓，死亡率高[1]。結(jié)核病一直以來也嚴重威脅著人類的生命健康，因此，快速診斷對預后和結(jié)核病疫情控制尤為重要[2]。

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種快速特異的結(jié)核分枝桿菌檢測方法，尤其適用于結(jié)核桿菌含量低的樣品檢測[3]。但PCR擴增診斷的高靈敏性和特異性要以高質(zhì)量的結(jié)核分枝桿菌DNA的提取為前提。本文對鹿中分枝桿菌DNA提取的三種方法進行比較研究，探討最佳提取方法，為從低含量結(jié)核分枝桿菌的樣品中提取高質(zhì)量DNA提供理論參考。

1 材料

1.1 試驗動物及菌株

牛結(jié)核分枝桿菌菌株ATCC27289(BCG)(購自北京中原經(jīng)貿(mào)公司ATCC菌種保存中心)。

1.2 主要試劑

聚合酶購于大連寶生物公司；溶菌酶、DNA分子量DL2000、DNTP購于上海生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

微量快速紫外可見分光光度計(型號為BioSpec-nano，島津)；電泳儀(型號為DYY-5，北京市六一)；凝膠成像儀(型號為Universal Hood Ⅱ型，BIO-RAD)；梯度PCR儀(型號為S1000，BIO-RAD)。

2 方法

2.1 DNA提取

培養(yǎng)后的BCG標準株菌落懸于PBS(pH 7.4)中，80℃滅活，12 000 r/min離心2 min，棄上清[4]。

2.2 改良CTAB法

樣品懸于400 μL 10 mmol/L Tris-HCL和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中滅活，加入10 μL 20 mg/mL蛋白酶K和30 μL 10% SDS，37 ℃孵育1 h，煮沸10 min[5]。加80 μL 1.8%高鹽CTAB，65 ℃孵育10 min，加等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，12 000 r/min離心5 min。上清加0.6倍異丙醇，靜止30 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，TE回溶。

2.3 國標法

樣品加100 μL提取液(pH 8.0 100 mmol/L Tris-HCL，0.01% Triton X-100) 和20 μL 10 mg/mL 蛋白酶K，56 ℃溫浴30 min，98 ℃加熱10 min，加等體積三氯甲烷，13 000 r/min離心5 min，上清用于PCR[4]。

2.4 樹脂法

蒸餾水中加入玻璃球配制的含5% Chelex-100、1% Nonidet p-40和1% Tween-20的200 μL樹脂懸浮液。100 ℃中保持30 min。13 000 r/min離心10 min，上清用作PCR[3]。

2.5 PCR鑒定靈敏度

以結(jié)核分枝桿菌復合群基因IS6110設(shè)計引物(F：5′-GCCGGA TCAGCGATCGT -3′；R：5′-GCAAA GTGTGGCTAACCCTGAA-3′)，將DNA初始濃度調(diào)到1×109，10倍連續(xù)梯度稀釋至100 fg，分別擴增。 95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，2%瓊脂糖凝膠鑒定[4]。

3 結(jié)果分析

3.1 紫外分光光度計鑒定

改良CTAB法其A260/A280的比值為1.83，接近純DNA的光度比值(1.8～1.9)，且濃度也最高，達87.8 ng/μL；而國標法為1.38，樹脂法為1.34，因此，CTAB法效果較好。

3.2 PCR鑒定

改良CTAB法檢出信號隨濃度降低呈均勻遞減趨勢(圖1)，且最低檢出限100 fg時的靈敏度也較高，說明改良CTAB法獲取的DNA其PCR鑒定靈敏度較好。國標法隨濃度降低檢出信號急劇降低；樹脂法檢出信號不穩(wěn)定且無濃度遞減趨勢，檢出限只有1 pg，這與文獻報道一致[5]。因此，改良CTAB法更好。

A：CTAB法；B：國標法；C：樹脂法 M. DL 2000；1.10 ng；2.1 ng；3.100 pg；4.10 pg；5.1 pg；6.100 fg；7.control圖1 三種方法提取的結(jié)核分枝桿菌DNA靈敏度的PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of DNA sensitivity of mycobacterium tuberculosis extracted by three methods

4 結(jié)論

本研究將三種DNA提取方法的效率和運用于常規(guī)PCR檢測的能力進行比較，結(jié)果只有改良CTAB法其A260/A280的比值介于1.8～1.9純DNA的光度比值，且結(jié)合常規(guī)PCR鑒定表明，改良CTAB法更具有優(yōu)勢，更適合于標本量較小和含量較低的臨床樣本檢測。

[1] Amin I，Idrees M，Awan Z，et al. PCR could be a method of choice for identification of both pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis[J]. BMC Research Notes，2011，(04)：332-337.

[2] 方梅，陸巧榮，洪志強.分子信標熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌方法建立及其臨床應用[J]. 四川大學學報(醫(yī)學版)，2010，41(1)：162-165.

[3] Al-Mutairi NM，Ahmad S，Mokkadas E. Performance comparison of four methods for detecting multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains[J]. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease，2011，15(1)：110-115.

[4] Soolingen DV，Haas PE，Hermans PW，et al. Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，1993，31(8)：1987-1995.

[5] Almeida IN，Carvalho WS，Rossetti ML，et al. Evaluation of six different DNA extraction methods for detection of Mycobacterium tuberculosis by means of PCR IS6110:preliminary study[J]. BMC Research Notes，2013，(06)：561-567.

Study on optimum DNA extraction of mycobacterium tuberculosis in deer

XU Na,LI Xin,SUN Dian-dian,XU Ya-wei,YIN Rui

(Jilin Agricultural Science and Technology University,School of Bioengineering,Jilin 132101,China)

Three DNA extraction methods including resin method,improved CTAB method and national standard method were employed in obtaining DNA of mycobacterium tuberculosis in the deer respectively,followed the appraisal of amplification and agarose gel electrophoresis analysis. The results show that improved CTAB method can gain the highest result and quickly identify mycobacterium tuberculosis of the samples with low content along with the detection sensitivity of 100 fg.

Deer; Mycobacterium tuberculosis; DNA extraction

2017-01-19

吉林省科技廳自然科學基金項目(20140101021JC)；國家級大學生科技創(chuàng)新科研項目(吉農(nóng)院合字2016第049號)

徐娜(1995-)，女，本科。

尹銳(1981-)，男，講師，碩士，e-mail：542977965@qq.com。

R450

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1674-8646(2017)06-0172-02