周雙男, 張 寧, 劉振文, 李洪苓, 王 琳, 蘇海濱, 高銀杰, 周 霞, 張 敏

解放軍第302醫(yī)院 1.肝移植中心; 2.中西醫(yī)結(jié)合肝病中心,北京 100039

受體IL-28B基因多態(tài)性對肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)抗病毒治療及預后的影響

周雙男1, 張 寧2, 劉振文1, 李洪苓1, 王 琳1, 蘇海濱1, 高銀杰1, 周 霞1, 張 敏1

解放軍第302醫(yī)院 1.肝移植中心; 2.中西醫(yī)結(jié)合肝病中心,北京 100039

目的 探討受體白介素28B(interleukin-28B, IL-28B)基因多態(tài)性對肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)抗病毒治療及預后的影響。方法 對33例肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)患者進行干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療，并通過肝組織進行受體IL-28B rs12979860位點的基因多態(tài)性檢測，觀察病毒學應(yīng)答及預后情況。結(jié)果 33例患者獲得治療結(jié)束時病毒學應(yīng)答(end of treatment virologic response, ETVR) 24例(72.7%)，其中獲得持續(xù)性病毒學應(yīng)答(sustained virologic response, SVR)12例(36.4%)。受體的基因型分布：CC型25例(75.8%)、非CC型8例(24.2%)。CC型與非CC型患者中ETVR率分別為84.0%、37.5%，SVR率分別為44.0%、12.5%，二者比較,CC型獲得ETVR率較高(P<0.05)，SVR率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CC型及非CC型患者中抗病毒治療后移植肝硬化率分別為8.0%、50.0%，二者比較,CC型患者移植肝硬化率較低(P<0.05)。結(jié)論 受體IL-28B rs12979860位點CC基因型可能對移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)患者抗病毒治療效果及預后存在有利影響。

IL-28B基因多態(tài)性;肝移植;丙型肝炎;抗病毒治療

肝移植術(shù)是治療丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染相關(guān)終末期肝病的有效方法，但移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)十分普遍，且復發(fā)患者肝損傷的進展較非移植患者人群明顯增快[1-2]，5年內(nèi)移植物功能衰竭發(fā)生率約為10%[3]。有效的抗病毒治療可阻止或延緩疾病進展[4]。已有研究[5-6]證明白細胞介素-28B(interleukin-28B,IL-28B)基因多態(tài)性是HCV清除及應(yīng)用干擾素(interferon,IFN)治療獲得病毒學應(yīng)答的強有力預測因素，對肝移植術(shù)后患者來講，供受體的IL-28B基因背景可能在移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)及其抗病毒治療中扮演著重要角色。本文就2004年6月-2014年6月于解放軍302醫(yī)院行肝移植治療的33例肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)患者的抗病毒治療及其受體IL-28B rs12979860位點的基因多態(tài)性檢測進行分析研究，旨在了解其對肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)抗病毒治療及預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料2004年6月-2014年6月我中心共收治移植術(shù)后HCV復發(fā)患者59例，其中33例患者行抗病毒治療，男25例，女8例，年齡21～66歲，平均年齡(52.42±9.18)歲。33例HCV相關(guān)終末期肝病患者均行原位經(jīng)典肝移植術(shù)，術(shù)前患者均簽署知情同意書，符合醫(yī)學倫理學規(guī)定。移植術(shù)后HCV RNA陽性，肝臟穿刺病理組織檢查證實丙型肝炎復發(fā)，排除排斥反應(yīng)、膽管并發(fā)癥、藥物性肝損傷、合并其他病毒感染等常見移植術(shù)后并發(fā)癥。

1.2 抗病毒治療方案采用IFN聯(lián)合利巴韋林小劑量遞增方案進行抗病毒治療。根據(jù)患者耐受情況，IFN及利巴韋林由初始低用量(IFN初始劑量90萬單位/次、隔日1次，利巴韋林初始用量600 mg/d)，如患者能夠耐受治療，則每2周增加藥物劑量1次，逐漸過渡至標準劑量的長效干擾素(聚乙二醇干擾素α-2a)聯(lián)合利巴韋林治療，以達到患者最大耐受劑量或標準治療劑量。治療過程中，根據(jù)臨床需要給予粒細胞集落刺激因子及促紅細胞生成素對癥處理。如患者出現(xiàn)重度排斥反應(yīng)、嚴重感染、嚴重精神癥狀、貧血等不良反應(yīng)及其他不可控制的并發(fā)癥，則終止抗病毒治療。預期抗病毒療程：HCV RNA基因1b型為48周，基因2a型為24周。

1.3 抗病毒治療分組標準治療組：聚乙二醇干擾素α-2a增加至180 μg/周，利巴韋林900～1 200 mg/d，治療時間基因1型為48周，基因2型為24周。足療程組：干擾素及利巴韋林劑量未能達到標準治療劑量，但完成了24周或48周療程。不完全治療組：IFN及利巴韋林劑量未能達到標準治療劑量，且未能完成24周或48周療程。療程從應(yīng)用IFN之時間起算。

1.4 免疫抑制方案所有患者在移植術(shù)后早期給予皮質(zhì)激素+鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(他克莫司)+嗎替麥考酚酯三聯(lián)免疫抑制方案，激素在移植術(shù)后3個月內(nèi)停用。3個月后根據(jù)患者情況，單獨使用他克莫司或聯(lián)合使用嗎替麥考酚酯，根據(jù)他克莫司血藥濃度調(diào)整免疫抑制劑用量。

1.5 觀察指標采用RT-PCR檢測治療前后血清HCV RNA載量，HCV RNA最低檢測值為100 IU/ml；采用線性探針雜交法進行HCV基因型分析。觀察治療結(jié)束時病毒學應(yīng)答(end of treatment virologic response,ETVR,治療結(jié)束時HCV RNA低于可檢測水平)、持續(xù)病毒學應(yīng)答(sustained virologic response,SVR),抗病毒療程結(jié)束24周后血清HCV RNA低于可檢測水平)及治療后截止最后1次隨訪時患者有無移植肝硬化(移植后肝臟病理提示4期肝纖維化或出現(xiàn)伴有或不伴有外周水腫的腹水、胸腔積液、上消化道靜脈曲張出血、自發(fā)性腹膜炎、肝性腦病等失代償期肝硬化臨床表現(xiàn))。

1.6 主要試劑和儀器石蠟包埋組織基因組提取試劑盒(北京天根生物)；低溫臺式離心機(Eppendorf)；PTC-200 PCR儀(BIO-RAD)；DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)；UV-IV紫外分析儀(北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所)；真空抽濾泵(Millipore)。

1.7 受體IL-28B基因多態(tài)性測定采用石蠟包埋組織基因組提取試劑盒提取石蠟包埋組織基因組DNA，按照說明書進行操作。瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取基因組DNA。通過NCBI查找rs12979860的序列，并用Primer 5.0 引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計，PCR法擴增rs12979860。rs12979860上游引物為5′-GCTTATCGCATACGGCTAGG-3′，下游引物為5′-AGGCTCAGGGTCAATCACAG-3′。直接對PCR擴增產(chǎn)物進行測序?qū)ι鲜鑫稽c進行檢測。直接測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 一般情況抗病毒治療前HCV RNA載量為8.2×104～5.8×108IU/ml?；?b型28例，2a型5例?？共《局委熼_始時間為移植術(shù)后2～60個月，平均時間16.6個月。隨訪時間16～129個月,平均隨訪時間75.7個月。

2.2 抗病毒療效33例患者中共獲得ETVR 24例，其中12例獲得SVR。17例因不良反應(yīng)提前終止治療，未完成既定療程。提前終止抗病毒治療的原因包括：中性粒細胞嚴重減少4例，排斥反應(yīng)3例，膽管并發(fā)癥3例，中度以上貧血2例，感染2例，極度乏力1例，皮膚瘙癢1例，皮疹1例。

2.3 受體IL-28B rs12979860位點基因型分布及其與抗病毒療效及患者預后之間的關(guān)系33例患者受體的IL-28B基因型分布：CC型25例(75.8%)、非CC型8例(24.2%)。CC基因型患者ETVR率高于非CC基因型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);二者SVR率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CC型患者經(jīng)抗病毒治療后有2例出現(xiàn)移植肝硬化，而在非CC基因型患者中出現(xiàn)4例，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同基因型在患者年齡、性別、治療前病毒載量分布、病毒基因型分布、抗病毒治療分組、隨訪時間等比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05, 見表1)。

表1 IL-28B不同基因型分布特點與抗病毒療效及患者預后之間的比較

Tab 1 Comparison of the distribution characteristics of IL-28B genotypes and the antiviral efficacy and prognosis of the patients

注：治療前病毒載量按照≥或<1×106 IU/ml分組；抗病毒治療分組按照標準治療/足療程/不完全治療進行分組。

3 討論

不同研究對于肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)抗病毒治療的影響因素結(jié)論不同，有研究[7]表明獲得早期病毒學應(yīng)答(RVR)、治療前HCV RNA載量、HCV RNA基因型、抗病毒藥物的劑量及療程均是影響療效的重要因素[9-10]。針對IL-28B基因多態(tài)性對丙型肝炎抗病毒療效的預測作用也是近年興起的研究熱點之一。

IL-28B即IFN-λ3，是2003年國際人類基因組組織新發(fā)現(xiàn)的IFN家族的一員[8]。目前已經(jīng)明確IL-28B在體內(nèi)和體外都具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒效能，并且可以促進IFN-α的產(chǎn)生，在感染HCV患者的肝臟活組織樣本中能發(fā)現(xiàn)IL-28B mRNAs的存在[9]。目前已有報道IL-28B的基因多態(tài)性與抗HCV療效及病情進展有一定相關(guān)性，其中對位于染色體19的IL-28B 基因上游3 kb處的rs12979860位點研究較多，學者將不同的IL-28B相關(guān)的基因型稱為保護性和非保護性基因型，對于rs12979860來說，CC型為保護性基因型，CT型或TT型(非CC型)為非保護性基因型[10]，保護性基因型即CC型的患者可以獲得較好的干擾素抗病毒應(yīng)答率[5,11]。

相對于非移植人群，針對IL-28B的基因多態(tài)性在肝移植后人群中的作用目前研究較少。對于非移植丙型肝炎人群，St?ttermayer等[5,12]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-28B保護性基因型與較高的基線病毒載量水平相關(guān)。然而，Thompson等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，IL-28B基因型在不同HCV RNA載量組的分布沒有差別。在本組研究中CC基因型及非CC基因型在患者治療前病毒載量分布差異無統(tǒng)計學意義，但移植術(shù)后患者均長期應(yīng)用免疫抑制劑，藥物對病毒載量的影響是否會影響IL-28B基因型在不同病毒載量的分布仍需要進一步的研究。另外因不同的隨訪時間、HCV RNA基因型、抗病毒藥物的劑量及療程等均是可能影響療效及預后的因素[7]，故本組研究在不同IL-28B基因型組別中對上述指標進行分析，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學意義，提示數(shù)據(jù)具有可比性。

進一步對本組病例中CC基因型及非CC基因型患者的抗病毒療效及患者預后進行比較發(fā)現(xiàn)，CC基因型患者出現(xiàn)移植肝硬化率低于非CC基因型患者(8.0%vs50.0%)，提示與非CC基因型患者相比，CC基因型肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)患者預后較好，與其他報道結(jié)果相符[13-14]。歐美國家有研究[15-17]表明受體CC基因型患者可獲得較高SVR率，提示受體IL-28B的基因多態(tài)性對移植術(shù)后丙型肝炎抗病毒治療中有著較強的預測作用。本組研究結(jié)果顯示相對于非CC基因型，CC基因型患者獲得ETVR率較高，可能對抗病毒治療存在有利影響；但在獲得SVR率上，CC基因型患者雖高于非CC基因型患者，但二者差異無統(tǒng)計學意義，與上述研究結(jié)論不符，一方面考慮與肝移植術(shù)后患者對IFN聯(lián)合利巴韋林的抗病毒方案耐受性較差，有相當比例的患者不能完成標準劑量和療程的治療，導致總體抗病毒療效較差；另一方面考慮與rs12979860在中國人群中不同基因型分布與歐美人群分布特點不同或樣本量偏小有關(guān)，如果在后續(xù)的研究中進一步增大樣本量，提高檢驗效能，將有可能得出與歐美人群相同的結(jié)果。另外,遺憾的是本組研究未能獲得供體的IL-28B基因型信息，因此移植術(shù)后供受體IL-28B優(yōu)勢基因和劣勢基因的不同組合對于移植術(shù)后HCV復發(fā)轉(zhuǎn)歸和抗病毒療效的影響尚不能明確，如能在下一步研究中將供受體IL-28B基因多態(tài)性一起納入分析進行研究，將可能得出更令人信服的結(jié)論。

綜上所述，對于肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)患者，受體IL-28B CC基因型可獲得抗病毒治療更高的ETVR率，減少移植肝硬化發(fā)生率，可能對抗病毒治療效果及預后存在有利影響。針對IL-28B基因多態(tài)性在肝移植術(shù)后丙型肝炎復發(fā)患者中的作用仍需要進一步深入研究。

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(責任編輯：王全楚)

Influence of recipient IL-28B polymorphisms in recurrent hepatitis C patients after liver transplantation on the antiviral therapy and prognosis

ZHOU Shuangnan1, ZHANG Ning2, LIU Zhenwen1, LI Hongling1, WANG Lin1, SU Haibin1, GAO Yinjie1, ZHOU Xia1, ZHANG Min1

1.Liver Transplantation Center; 2.Liver Disease Center of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

Objective To investigate the influence of recipient interleukin-28B (IL-28B) polymorphisms on the antiviral therapy and prognosis in patients with hepatitis C recurrence after liver transplantation.Methods Thirty-three patients with hepatitis C recurrence after liver transplantation were treated with interferon combined with Ribavirin. IL-28B polymorphisms (rs12979860) was characterized using liver tissue from recipients. Virological response and prognosis were observed.Results Twenty-four (72.7%) patients achieved ETVR, in who 12 cases (36.4%) achieved SVR. The prevalence of CC genotype and non-CC genotype in recipient samples were 75.8% and 24.2%, respectively. The rate of ETVR (84.0%) in patients with CC genotype was higher than the rate in patients with non-CC genotype (37.5%) (P<0.05). The difference of SVR rates between the CC genotype (44.0%) and non-CC genotype (12.5%) was not statistically significant (P>0.05). The rate of transplanted liver cirrhosis after antiviral therapy in patients with genotype CC (8.0%) was lower than the rate in patients with non-CC genotype (50.0%) (P<0.05).Conclusion The recipient CC genotype of IL-28B (rs12979860) may have beneficial influence on antiviral therapy and prognosis in patients with hepatitis C recurrence after liver transplantation.

IL-28B polymorphisms; Liver transplantation; Hepatitis C; Antiviral therapy

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.020

2013年解放軍第302醫(yī)院院長創(chuàng)新基金(YNKT2013021)；2014年解放軍第302醫(yī)院院長創(chuàng)新基金(YNKT2014021)

周雙男，主治醫(yī)師，在讀博士研究生，研究方向：肝病及肝移植的臨床診療與研究。E-mail：13121690661@163.com

張敏，副主任醫(yī)師，博士，研究方向：肝病的臨床診療與研究。E-mail：13911517721@163.com

R575.1

A

1006-5709(2017)01-0074-04

2016-02-03