趙麗君，田勇麗，楊躍紅，寇敏

(山西省兒童醫(yī)院，山西 太原 030013)

1 例兒童靜脈畸形骨肥大綜合征的臨床與基因突變分析

趙麗君，田勇麗，楊躍紅，寇敏

(山西省兒童醫(yī)院，山西 太原 030013)

目的：探討1 例靜脈畸形骨肥大綜合征(KTS)患兒的臨床表現(xiàn)及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法：收集患者的臨床資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，聚合酶鏈反應(yīng)，測(cè)序確定突變情況。結(jié)果：患者臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查符合KTS診斷?；蛲蛔兎治鲲@示，患者AGGF1基因第6號(hào)外顯子發(fā)生錯(cuò)義突變，為c.923A>G雜合突變，造成第923 位氨基酸由天冬酰胺改變?yōu)榻z氨酸。蛋白序列的保守性分析及突變蛋白的功能分析，均支持該突變?yōu)橹虏⊥蛔?。結(jié)論：通過(guò)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查，確診1 例KTS患者，通過(guò)AGGF1基因突變分析，從分子遺傳學(xué)方面證實(shí)患者KTS的診斷。

靜脈畸形骨肥大綜合征；基因突變；兒童

靜脈畸形骨肥大綜合征(KTS)是一種少見(jiàn)的先天性靜脈畸形病變，1900年由法國(guó)醫(yī)師Klippel和Trenaunay首次報(bào)道，其以血管畸形、骨肥大和軟組織增生為主要臨床表現(xiàn)[1]。本病好發(fā)于兒童及青少年，病程進(jìn)展緩慢，病情復(fù)雜，并隨年齡增長(zhǎng)而加重，部分患者可伴有多趾、巨趾、并趾畸形及淋巴系統(tǒng)異常，下肢多見(jiàn)。目前本病的遺傳方式不明確，多數(shù)認(rèn)為AGGF1基因的變異與KTS相關(guān)[1]。本研究分析1 例KTS患者的臨床、實(shí)驗(yàn)室檢查和AGGF1基因突變情況，旨在探討KTS患者的臨床表現(xiàn)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)，以提高對(duì)本病的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患兒，女，7 歲，因血尿8 d于2016年7月就診于山西省兒童醫(yī)院?；純? d前無(wú)誘因出現(xiàn)肉眼血尿，尿液呈醬油色，無(wú)泡沫、少尿，無(wú)水腫，病初1 d伴低熱，體溫37.5 ℃左右，有輕咳，無(wú)痰，無(wú)皮疹、關(guān)節(jié)腫痛，無(wú)頭痛、頭暈，無(wú)惡心、嘔吐、尿頻、尿急、尿痛等癥狀，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷“急性腎小球腎炎”，輸液治療7 d(具體用藥不詳)病情無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，為求進(jìn)一步診治入住我科。既往史、個(gè)人史、家族史無(wú)特殊。入院查體：體溫37 ℃，脈搏92 次/min，呼吸20 次/min，血壓121/54 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，神清，反應(yīng)可，四肢、頸部、背部、臀部均可見(jiàn)大片狀紅色斑疹，淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，咽充血，雙肺呼吸音粗，未聞及干濕啰音，心音有力，律齊，腹軟，肝脾肋下未及，雙腎區(qū)叩痛陰性，移動(dòng)性濁音陰性，腸鳴音正常。右手拇指背面可見(jiàn)一花生大小突起皮面的贅生物，右手中指、食指粗大，中指外翻(見(jiàn)圖1)。入院診斷：血尿原因待查，急性腎小球腎炎？上呼吸道感染。經(jīng)皮膚科會(huì)診，補(bǔ)充診斷：骨肥大靜脈曲張痣綜合征。

經(jīng)患者知情同意，山西省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，抽取外周血，提取基因組DNA進(jìn)行基因分析。

1.2 基因分析方法

1.2.1 基因組DNA提取

圖11 例靜脈畸形骨肥大綜合征患兒的臨床表現(xiàn)

采集患兒靜脈血2 mL，置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，用DNA提取試劑盒(康維世紀(jì)，北京)提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)

使用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)查找AGGF1基因序列，試用Primer3.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)完成后進(jìn)行序列合成，擴(kuò)增AGGF1基因的14 個(gè)外顯子及其與內(nèi)含子的交界處，引物由北京邁基諾基因科技股份有限公司合成。AGGF1基因擴(kuò)增引物(見(jiàn)表1)。

表1 AGGF1基因擴(kuò)增引物

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增條件

95 ℃預(yù)變性60 s，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35 次；后72℃延伸5 min，循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后取4 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物片段大小。

1.2.3 DNA測(cè)序

采用DNA純化回收試劑盒(北京邁基諾基因科技股份有限公司)純化回收PCR產(chǎn)物。再進(jìn)行上機(jī)前PCR，采用之前設(shè)計(jì)好的引物，PCR反應(yīng)條件為：96 ℃預(yù)變性1 min 30 s；96 ℃變性12 s，50 ℃退火6 s，60 ℃延伸3 min 20 s，循環(huán)25 次。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物，送北京邁基諾基因科技股份有限公司用ABI3130熒光自動(dòng)測(cè)序儀(ABI，美國(guó))測(cè)序。

1.2.4 測(cè)序結(jié)果分析

測(cè)序結(jié)果與人類參考基因組(hg19)進(jìn)行比對(duì)分析，確定突變位點(diǎn)及突變堿基。然后通過(guò)ANNOVER軟件對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行注釋，注釋內(nèi)容包括dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)和正常人數(shù)據(jù)庫(kù)1 000 Genomes、ESP6 500和ExAC等。根據(jù)注釋信息排除多態(tài)性位點(diǎn)，確定其是否為已報(bào)道致病突變或新發(fā)突變位點(diǎn)。

1.2.5 對(duì)突變蛋白的功能預(yù)測(cè)

首先分析突變位點(diǎn)在不同物種中的保守性，其次使用非同義突變功能預(yù)測(cè)軟件SIFT[2]、Polyphen-2[3]、Mutation Taster[4]對(duì)含錯(cuò)義突變的AGGF1蛋白進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查結(jié)果

血系列：白細(xì)胞計(jì)數(shù)4.15×109/L，中性粒細(xì)胞0.436，淋巴細(xì)胞0.388，單核細(xì)胞0.145，嗜酸性粒細(xì)胞0.029，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)4.0×1012/L，血紅蛋白濃度122 g/L，血小板計(jì)數(shù)222×109/L，C反應(yīng)蛋白0.5 mg/L。生化：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶12 U/L，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶31 U/L，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶10 U/L，白蛋白31.7 g/L，球蛋白25.8 g/L，尿素氮3.1 mmol/L，肌酐53 μmol/L，總膽固醇3.66 mmol/L，電解質(zhì)正常。凝血功能：凝血酶原時(shí)間14.0s，纖維蛋白原3.94 g/L，活化部分凝血活酶時(shí)間31.7 s，凝血酶時(shí)間18.9 s。免疫球蛋白G(IgG)10.4 g/L，免疫球蛋白A(IgA)3.63 g/L，免疫球蛋白M(IgM)1.08 g/L，總免疫球蛋白E(IgE)26.9kIU/L，補(bǔ)體C31.06 g/L，補(bǔ)體C40.234 g/L。淋巴細(xì)胞亞群：T細(xì)胞68.9%，輔助性T細(xì)胞(Th)35.1%，抑制性T細(xì)胞(Ts)29.0%，Th/Ts 1.21，自然殺傷(NK)細(xì)胞4.8%，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞2.4%，B細(xì)胞23.0%。血沉45 mm/h。肺炎支原體抗體陰性，院感九項(xiàng)正常。尿常規(guī)為：酸堿度6.56，蛋白質(zhì)陰性，紅細(xì)胞200.00個(gè)/μL，尿紅細(xì)胞位相：蛋白(+-)，紅細(xì)胞數(shù)目>100個(gè)/HPF，變形60%，形狀草莓、面包圈、穿孔，24 h尿蛋白定量0.34 g/24 h。腎早期損傷檢測(cè)：尿IgG 14.5 mg/L，尿微量白蛋白87.4 mg/L，尿轉(zhuǎn)鐵蛋白4.58 mg/L，尿α1微球蛋白5.59 mg/L，便常規(guī)正常。胸片：雙肺紋理粗多紊亂。腹部彩超：雙腎大，與原發(fā)病有關(guān)。胃腸道彩超：腹腔內(nèi)未見(jiàn)明顯異?；芈?。

2.2 基因突變分析結(jié)果

2.2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

以患者DNA為模板，分別用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳EB染色后，均見(jiàn)一條清晰條帶，且與預(yù)期片段大小相符(見(jiàn)圖2)。

圖2 AGGF1擴(kuò)增后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.2.2 基因突變分析

測(cè)序結(jié)果顯示，患者的AGGF1基因第6號(hào)外顯子發(fā)生錯(cuò)義突變，為c.923A>G雜合突變，造成第923位氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸，即p.N308S(見(jiàn)圖3)，測(cè)序結(jié)果與人類參考基因組(hg19)比對(duì)，再通過(guò)ANNOVER軟件對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行注釋，表明c.923A>G不是多態(tài)性位點(diǎn)，確定其為未報(bào)道過(guò)的新突變。突變蛋白的功能預(yù)測(cè)：AGGF1蛋白923位的天冬酰胺在人，大鼠，小鼠，兔，牛，馬，荷蘭豬，恒河猴，狗中高度保守，同時(shí)SIFT、Polyphen-2和Mutation Taster對(duì)錯(cuò)義突變的功能影響預(yù)測(cè)結(jié)果：該突變可能影響AGGF1蛋白的功能，是致病性突變。SIFT、Polyphen-2和Mutation Taster評(píng)分分別為1、0.001和1。

3 討 論

KTS是一種以靜脈畸形合并其他多器官畸形的先天性疾病，在起病早期由于癥狀不典型，常被誤診為“胎記”“血管瘤”“靜脈曲張”等疾病，延誤了正常的診治，導(dǎo)致患兒成長(zhǎng)后殘疾，因此目前已引起學(xué)者們的高度重視。在KTS三聯(lián)征中，一般以血管瘤(痣)最先出現(xiàn)者為多，多在出生時(shí)即有或在出生后不久出現(xiàn)，以后隨年齡增長(zhǎng)，逐漸出現(xiàn)淺靜脈曲張和骨、軟組織增生。本病累及內(nèi)臟及顱內(nèi)血管時(shí)，還可出現(xiàn)膀胱、脾、結(jié)腸、肝臟等內(nèi)臟血管畸形，可表現(xiàn)為消化道出血、泌尿道出血、腦出血。Husmann等[5]報(bào)道KTS患者中30%泌尿生殖系統(tǒng)受累，其中7%累及生殖器皮膚，7%累及泌尿生殖內(nèi)臟器官，16%二者均累及。9%的KTS患者出現(xiàn)肉眼血尿，分別來(lái)自膀胱、尿道及腎臟。本例患兒急性起病，以肉眼血尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)，伴輕度蛋白尿，化驗(yàn)?zāi)蚣t細(xì)胞位相：紅細(xì)胞>100個(gè)/HPF，變形60%，24 h尿蛋白定量0.34 g/24 h，診斷急性腎小球腎炎。本病易合并血管畸形，故未行腎活檢。給予阿魏酸哌嗪、卡托普利、百令膠囊治療后，肉眼血尿明顯減輕，出院后2 個(gè)月復(fù)查尿常規(guī)、腎早期損傷檢測(cè)等均正常。KTS的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚[6]，多數(shù)認(rèn)為與先天性中胚層血管發(fā)育異常、遺傳及基因突變有關(guān)。由于胎兒時(shí)期發(fā)育成血管和軟組織的中胚層發(fā)育異常，導(dǎo)致相應(yīng)部位的肢體淺靜脈數(shù)量增多，管徑擴(kuò)大和血流增加；深靜脈發(fā)育細(xì)小、閉塞或瓣膜缺如[7]，進(jìn)而肢體血容量持續(xù)增多造成骨骼和軟組織過(guò)度生長(zhǎng)[8]，引起患肢一系列臨床表現(xiàn)。研究表明AGGF1基因的變異與KTS相關(guān)，AGGFl基因全長(zhǎng)34 kb，由14 個(gè)外顯子組成，編碼714 個(gè)氨基酸，所表達(dá)的蛋白相對(duì)分子量為81 kD，AGGF1基因編碼一個(gè)強(qiáng)效血管生成因子，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。KTS相關(guān)的基因突變導(dǎo)致血管生成因子活性增強(qiáng)，這是形成KTS病理改變的分子基礎(chǔ)[7]。本例患者行基因檢測(cè)明確為AGGF1基因第6號(hào)外顯子發(fā)生錯(cuò)義突變，為c.923A>G雜合突變，造成第923 位氨基酸由天冬酰胺改變?yōu)榻z氨酸。通過(guò)對(duì)不同種屬該位點(diǎn)的蛋白序列的保守性分析及多種點(diǎn)突變功能預(yù)測(cè)軟件分析，均支持該突變?yōu)橹虏⊥蛔?。本例患者的突變屬于新突變，其父母均檢測(cè)到AGGF1基因的雜合突變，但未發(fā)病，結(jié)合類似研究報(bào)道，我們認(rèn)為KTS是一類具有遺傳基礎(chǔ)的先天性疾病，AGGF1基因可能不是該例病患發(fā)病的唯一突變基因，KTS發(fā)病可能有其他基因作為致病基因，也可能在整個(gè)血管母細(xì)胞分化和血管的發(fā)生形成通路中存在其他基因的影響，需要做進(jìn)一步的研究。

A為患兒AGGF1基因第6外顯子序列；B為患兒父親AGGF1基因第6外顯子

綜上所述，KTS是一類以血管發(fā)育異常為主的少見(jiàn)疾病，其病因與發(fā)病機(jī)制仍在不斷研究探索中，若小兒時(shí)期能夠早期發(fā)現(xiàn)，明確病變類型和程度，可盡早施行正確、有效的個(gè)體化治療方案。

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(本文編輯：張紅)

Clinical and genetic analysis of a child with klippel-trenaunay syndrome.

ZHAO Lijun，TIAN Yongli，YANG Yuehong，KOU min

( Shanxi Children′s Hospital，Tianyuan 030013，China)

Objective：To investigate the clinical manifestations and molecular basis of a child with Klippel-Trenaunay syndrome(KTS).Methods：Clinical features，and laboratory data were collected.Genomic DNA was extracted from leukocytes of peripheral blood of the patient，detected by polymerase chain reaction，and the mutations identified by direct sequencing.Results：KTS was diagnosed on the basis of comprehensive consideration of clinical presentations，and laboratory test results.This gene mutation test revealed a nucleotide substitution of guanine for adenine at the position 923 of exon 6 of AGGF1 gene (c.923A>G)，which caused a missense mutation of asparagine to serine at codon 923 (p.Asn923Ser).Loci conservation analysis and functional prediction of missense mutation of AGGF1 protein revealed that c.923A>G was a pathogenic mutation.Conclusion：One case of KTS was diagnosed by clinical and laboratory examinations.From the aspect of molecular genetics，AGGF1 gene mustation has confirmed the diagnosis of KTS in this patient.

klippel-trenaunay syndrome；gene mutation；child

王利榮(1965— )，女，山西省五臺(tái)縣人，學(xué)士學(xué)位，副主任醫(yī)師，主要從事心內(nèi)科工作。

1671-8631(2017)05-0354-05

R394

B

2016-12-27