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        離子色譜安培法測定尿液中的胱氨酸

        2017-06-05 14:14:37石磊鐘春明林青峰劉慧潘廣文李仁勇
        化學(xué)分析計量 2017年3期
        關(guān)鍵詞:檢測

        石磊,鐘春明,林青峰,劉慧,潘廣文,李仁勇

        [1.煙臺毓璜頂醫(yī)院,山東煙臺 264000; 2.龍巖市公安局刑偵支隊,福建龍巖 364000;3.泉州市環(huán)境監(jiān)測站,福建泉州 362001; 4.賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海 201206]

        離子色譜安培法測定尿液中的胱氨酸

        石磊1,鐘春明2,林青峰3,劉慧4,潘廣文4,李仁勇4

        [1.煙臺毓璜頂醫(yī)院,山東煙臺 264000; 2.龍巖市公安局刑偵支隊,福建龍巖 364000;3.泉州市環(huán)境監(jiān)測站,福建泉州 362001; 4.賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海 201206]

        建立離子色譜安培法檢測尿液中胱氨酸的分析方法。將尿液稀釋處理后,過OnGuard ⅡRP前處理柱,去除尿液中的有機物,選用低容量陽離子交換柱IonPac CS17 進行分離,以甲烷磺酸梯度淋洗,柱后用300 mmol/L NaOH溶液衍生,離子色譜脈沖安培法檢測,外標(biāo)法定量。胱氨酸的質(zhì)量濃度在0.1~5.0 mg/L范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈良好的線性,線性相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9,檢出限為0.05 mg/L。測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.71%(n=6),樣品加標(biāo)回收率為94%~108%。該方法具有操作簡單,專屬性強,靈敏度高等優(yōu)點,可用于臨床快速檢測尿液中的胱氨酸。

        胱氨酸;尿液;安培檢測;離子色譜法

        胱氨酸是一種含硫氨基酸,在蛋白質(zhì)中有少量存在,可用于食品工業(yè)。胱氨酸是人和動物體中一種非常重要的氨基酸,它被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料以及藥物研究和制造業(yè)[1–3]。最近有研究表明,L-胱氨酸在鐵元素從肝臟到血液的傳輸過程中發(fā)揮著重要作用[4],而且人體內(nèi)胱氨酸含量對嚴(yán)重威脅患者生命的HIV病毒感染的治療非常重要。Gout的課題組研究表明,Nb2淋巴瘤細(xì)胞惡性增長過程與胱氨酸攝取能力的變化相關(guān)[5]。Martins等研究確信胱氨酸能夠促進人尿中草酸鈣晶體的生長和聚集,導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)結(jié)石癥[6]。根據(jù)結(jié)石成分的不同,結(jié)石可分草酸鈣結(jié)石、磷酸鈣結(jié)石、尿酸(尿酸鹽)結(jié)石、磷酸銨鎂結(jié)石、胱氨酸結(jié)石及嘌呤結(jié)石六類。大多數(shù)結(jié)石可混合兩種或兩種以上的成分。通過檢測尿液中各離子的組成,可以輔助判斷結(jié)石種類及碎石效果,對臨床診斷和治療具有重要意義[7]。胱氨酸作為胱氨酸結(jié)石的標(biāo)志物,已有分析方法為HPLC法[8–10]、間接原子吸收光譜法[11]、GC–MS法[12]、離子交換–脈沖安培檢測(IPAD)法[13–15]等。HPLC法和GC–MS法均需要衍生;間接原子吸收光譜法需要繁瑣的反應(yīng),用到的試劑較多;傳統(tǒng)的離子交換–IPAD法用強堿性洗脫液,胱氨酸在堿性條件下會水解為半胱氨酸,半胱氨酸為人體內(nèi)氨基酸,因此作為體內(nèi)胱氨酸的分析不能采用該方法。筆者采用陽離子交換柱,以酸性流動相洗脫,IPAD法用于結(jié)石病患者尿液中胱氨酸的檢測。該方法操作簡單方便,檢測靈敏度高,且可避免半胱氨酸的干擾。

        1 實驗部分

        1.1 主要儀器與試劑

        離子色譜儀:Dionex ICS 5000+型,配有高壓泵、淋洗液自動發(fā)生器、檢測器和自動進樣器,美國賽默飛世爾科技有限公司;

        去離子水系統(tǒng):GenPure Pro UV–TOC型,美國賽默飛世爾科技有限公司;

        鹽酸:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

        甲烷磺酸:99%,美國賽默飛世爾科技有限公司;

        氫氧化鈉溶液:50%,美國賽默飛世爾科技有限公司;

        L-胱氨酸:不小于99.7%,美國西格瑪–阿拉丁有限公司;

        尼龍濾膜:Thermo Scientific Target2型,30 mm,

        0.45 μm,美國賽默飛世爾科技有限公司;

        凈化柱:Dionex?OnGuardⅡRP型,美國賽默飛世爾科技有限公司;

        一次性使用無菌注射器:1 mL,上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司;

        實驗用水為去離子水。

        1.2 儀器工作條件

        1.2.1 色譜條件

        分析柱:IonPac CS17 型(250 mm×2 mm,美國賽默飛世爾科技有限公司);保護柱:IonPac CG17 型(50 mm×2 mm,美國賽默飛世爾科技有限公司);淋洗液:甲烷磺酸溶液,流量為0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0~6.0 min為0.3 mmol/L 甲烷磺酸溶液,6.1~20.0 min為30 mmol/L 甲烷磺酸溶液,20.1~30.0 min為0.3 mmol/L 甲烷磺酸溶液;柱溫:30℃;進樣體積:10 μL;Au電極(AAA),Ag/AgCl參比電極,安培檢測器,氨基酸電位波型見表1。

        1.2.2 柱后衍生條件

        柱后衍生液為300 mmol/L NaOH溶液,流量為0.3 mL/min。

        1.3 溶液制備

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

        準(zhǔn)確稱取一定量(精確到0.001 g)的L-胱氨酸,用去離子水配制成質(zhì)量濃度為1.000 g/L的胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,用去離子水配制成胱氨酸質(zhì)量濃度分別為0.1,0.5,1.0,2.0,5.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

        表1 氨基酸電位波型

        1.3.2 樣品溶液制備

        取990 μL尿樣于10 mL容量瓶中,加入10 μL鹽酸,搖勻后加入去離子水定容至標(biāo)線,搖勻,依次過OnGuard ⅡRP柱和0.45 μm尼龍濾膜,棄去初濾液5 mL,收集后續(xù)濾出液。將濾出液稀釋至20倍體積后進樣分析。

        1.3.3 柱后衍生液制備

        NaOH溶液:300 mmol/L,取15.6 mL 50%氫氧化鈉溶液稀釋至1 L。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 樣品前處理方法的選擇

        由于尿液中含有的大量有機物在離子色譜柱上保留很強,不能用甲烷磺酸淋洗液洗脫。將同一濃度的胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液過OnGuard ⅡRP前處理柱前后分別進樣,胱氨酸色譜峰面積相同,說明OnGuard ⅡRP前處理柱對胱氨酸沒有保留。因此將樣品過OnGuard ⅡRP前處理柱,可有效去除尿液中的有機物。

        2.2 色譜條件的選擇

        胱氨酸極性較強,在一般的C18柱上沒有保留,因此選擇離子交換色譜柱。胱氨酸為兩性化合物,作為陰離子可在氨基酸分析柱上有保留,但氨基酸分析的淋洗液為堿性NaOH溶液,而胱氨酸會在堿性條件下水解為半胱氨酸,半胱氨酸在人體內(nèi)廣泛存在,因此不能選用NaOH溶液作為淋洗液,以防止胱氨酸水解[16–17]。作為陽離子胱氨酸可在陽離子交換柱上保留,且可與常規(guī)陽離子很好的分離??紤]到尿液中成分復(fù)雜,含有大量代謝產(chǎn)物等有機化合物,這些化合物在陽離子色譜柱上也會有保留,因此選擇柱容量低的CS17為分析柱。在將胱氨酸與其它化合物分開的同時將其它有保留的離子洗脫,不會影響樣品分析的重現(xiàn)性。

        2.3 干擾影響

        在樣品前處理時加入鈉、鉀、鎂、鈣等陽離子,這些離子在電化學(xué)檢測器上沒有響應(yīng)。電化學(xué)檢測是通過測量電化學(xué)活性物質(zhì)在適當(dāng)?shù)氖┘与娢幌掳l(fā)生氧化或還原反應(yīng)時所產(chǎn)生的電流變化從而測定該物質(zhì)的一種檢測技術(shù)。人體中含量較高的鈉、鉀、鎂、鈣不能發(fā)生氧化還原反應(yīng),所以對胱氨酸的檢測沒有干擾。因為人體內(nèi)存在半胱氨酸,因此加入半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,確認(rèn)半胱氨酸與胱氨酸可以基線分離,色譜圖見圖1。

        圖1L-胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

        2.4 柱后衍生液的影響

        因為金電極需要在堿性條件下工作,但是該實驗色譜條件為酸性淋洗液,因此需要在柱后加入堿液,提供堿性檢測環(huán)境。為使胱氨酸在金電極上有更高的響應(yīng)值,對不同濃度、不同流速的柱后衍生液進行試驗。試驗考察了100,200,300,500 mmol/L NaOH溶液,并分別在每個濃度的NaOH溶液下考察了0.1,0.2,0.3,0.5 mL/min 4種不同流量的影響。試驗發(fā)現(xiàn)500 mmol/L NaOH溶液在0.3 mL/min流量下,噪音最小,胱氨酸的信噪比最高,因此選用此條件作為柱后衍生條件。

        2.5 線性方程、線性范圍和檢出限

        在1.2色譜條件下,測定1.3.1配制的胱氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以胱氨酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸,得線性回歸方程為Y=6.033 3X+0.073 2,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9,線性范圍為0.1~5.0 mg/L。以信噪比(S/N)為3計算胱氨酸的檢出限,計算得胱氨酸的檢出限為0.05 mg/L。結(jié)果表明,該方法線性范圍寬、相關(guān)性好,且檢出限低,可滿足臨床檢測尿液樣品中胱氨酸的要求。

        2.6 精密度試驗

        對同一尿液樣品中的胱氨酸含量進行6次平行測定,結(jié)果見表2。由表2可知,胱氨酸測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.71%,保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%,說明該方法具有較高的精密度,滿足分析要求。

        表2 精密度試驗結(jié)果

        2.7 實際樣品分析及加標(biāo)回收試驗

        按1.3.2對尿液樣品進行處理后在1.2儀器工作條件下進樣測定,并對樣品進行加標(biāo)回收試驗。樣品測定結(jié)果列于表3,回收試驗結(jié)果見表4,樣品溶液加標(biāo)色譜圖見圖2。由表4可知,3個加標(biāo)水平的回收率在94%~108%之間,說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度,可用于臨床檢測該類型樣品。因為尿液中胱氨酸的檢測結(jié)果為陽性,可初步判斷該患者有腎結(jié)石。

        表3 樣品測定結(jié)果

        表4 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

        圖2 尿液樣品加標(biāo)色譜圖

        3 結(jié)語

        以低容量IonPac CS17為色譜柱,甲烷磺酸為流動相梯度洗脫,建立了離子色譜安培法直接檢測尿液中胱氨酸的方法。該方法樣品前處理簡單,分析時間短,靈敏度高,專屬性強,回收率良好,可用于臨床快速檢測尿液中的胱氨酸。

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        《宇航計測技術(shù)》簡介

        《宇航計測技術(shù)》創(chuàng)刊于1981年,是國家科委批準(zhǔn)的國家級技術(shù)性刊物?!队詈接嫓y技術(shù)》曾榮獲國家、北京市和航天系統(tǒng)優(yōu)秀科技期刊獎;為我國首批中文核心期刊、計量核心期刊和國家統(tǒng)計用刊;目前,本刊已成為《中國學(xué)術(shù)期刊》(光盤版),《中國導(dǎo)彈與航天文摘》(CAMA)與《中國期刊網(wǎng)》全文收錄用刊。

        中國標(biāo)準(zhǔn)刊號為ISSN1000-7202/CN11-2052/V,全國各地郵局均可訂閱,郵發(fā)代號:18-123。

        廣告經(jīng)營許可證:京豐工商廣字第0013號。

        主編:周謙 電話:010-68383695 傳真:010-68383627

        通信地址:北京市9200信箱24分箱《宇航計測技術(shù)》編輯部 郵編:100076

        《宇航計測技術(shù)》2017年第2期目錄

        高光譜紅外成像系統(tǒng)的乒乓緩存設(shè)計

        空間光纖傳感測量技術(shù)應(yīng)用研究

        一種基于面源黑體的某型紅外動態(tài)模擬靶標(biāo)研制

        基于LabVIEW的陀螺平臺測試系統(tǒng)設(shè)計與實現(xiàn)

        平衡功能測試與評估系統(tǒng)數(shù)據(jù)預(yù)處理方法研究

        發(fā)動機氣瓶熱防護產(chǎn)品絕熱性能評定研究

        基于ARVM模型的液體火箭發(fā)動機試驗臺故障預(yù)測方法

        基于Labview的振動沖擊測量系統(tǒng)設(shè)計

        轉(zhuǎn)軸扭轉(zhuǎn)變形動態(tài)測量噪聲消除方法研究

        JJG 860–2015 《壓力傳感器(靜態(tài))檢定規(guī)程》淺析

        空間碎片材料檢測技術(shù)研究

        某飛行器鐵路運輸環(huán)境測試系統(tǒng)研究

        深空遙操作大回路延時研究

        利用靜電雙探針對輝光放電等離子體診斷分析

        指標(biāo)測試在導(dǎo)航雷達(dá)檢修維護中的應(yīng)用

        一種交直流差可計算電阻的設(shè)計

        北斗D2導(dǎo)航電文解析和完好性性能分析

        淺析儀器儀表機箱三防設(shè)計技術(shù)

        一種手持式校準(zhǔn)控制器設(shè)計與實現(xiàn)

        基于感應(yīng)傳感的位置增量編碼器設(shè)計

        Determination of Cystine in Urine by Ion Chromatography with Pulsed Amperometric Detection

        Shi Lei1, Zhong Chunming2, Lin Qingfeng3, Liu Hui4, Pan Guangwen4, Li Renyong4
        (1. Yantai Yuhuangding Hospital, Yantai 264000, China; 2. The Criminal Investigation Branch of Longyan Municipal Public Security Bureau, Longyan 364000, China; 3. Quanzhou Environmental Monitoring Station, Quanzhou 362001, China; 4. ThermoFisher Scenitific, Shanghai 201206, China)

        The method for the determination of cystine in urine was developed by ion chromatography with pulsed amperometric detection. The urine sample was diluted,then the organic matter in the urine was removed by a OnGuard ⅡRP pretreatment column,and the filter liquor was separated by using low capacity of cation exchange column IonPac CS17 with methane sulfonic acid as gradient elution,and derived by 300 mmol/L NaOH solution,the content of cystine in urine was determined with ion chromatography pulse ampere method and external standard method. The mass concentration of cystine in urine had good linear relationship with the chromatography peak area in the range of 0.1–5.0 mg/L with the correlation coefficients(r2) of 0.999 9. The detection limit of the method was 0.05 mg/L. The relative standard deviation of determination results was 0.71%(n=6). The recovery of sample was 94%–108%. The method is suitable for the determination of cystine in urine with a simple operation,high specificity and sensitivity.

        cystine; urine; ampere detector; ion chromatography

        O657.7

        A

        1008–6145(2017)03–0072–04

        聯(lián)系人:劉慧;E-mail: hui.liu@thermofisher.com

        2017–03–14

        10.3969/j.issn.1008–6145.2017.03.017

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