李貞 趙衛(wèi)星

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 河南 新鄉(xiāng) 453003)

B7-H3和Smad7蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李貞 趙衛(wèi)星

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的 探討B(tài)7-H3和Smad7蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織中的表達(dá)水平及臨床意義。方法 收集82例ESCC組織標(biāo)本及其癌旁正常組織石蠟標(biāo)本，運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)B7-H3及Smad7蛋白的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)組織中B7-H3 mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果 B7-H3在ESCC組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁正常組織，Smad7蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于癌旁正常組織(P<0.05)。ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.294，P=0.005)。ESCC組織中B7-H3蛋白表達(dá)與臨床分期、分化程度有關(guān)(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)與分化程度有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 ESCC組織中B7-H3蛋白表達(dá)上調(diào)，Smad7蛋白表達(dá)下調(diào)。B7-H3和Smad7蛋白的異常表達(dá)可能參與了ESCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

食管鱗狀細(xì)胞癌； B7-H3蛋白；Smad7蛋白

食管癌屬于常見(jiàn)惡性腫瘤之一，居腫瘤相關(guān)疾病死亡原因的第6位，主要病理類型包括鱗癌、腺癌。我國(guó)主要以鱗癌為主，分布變異較大，河南、山西等省份為高發(fā)區(qū)。目前，食管癌的早期發(fā)現(xiàn)率、診斷率仍較低，臨床診斷多為中晚期患者，5年生存率僅為20%[1]。因此，深入了解食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer，ESCC)的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展，對(duì)ESCC的早期診斷、治療、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間具有重要作用。B7-H3是免疫相關(guān)蛋白B7家族的成員，由316個(gè)氨基酸組成，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，在獲得性免疫反應(yīng)中作為第二信使發(fā)揮作用[2]。TGF-β通路是其免疫反應(yīng)中重要的調(diào)控因素之一，Smad7為該通路的主要蛋白[3]。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H3在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并且可能與腫瘤預(yù)后相關(guān)[4]。本研究主要研究B7-H3和Smad7在ESCC中的表達(dá)并探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 材料 82例新鮮食管癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本取自于2011年8月至2016年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行食管癌根治術(shù)治療的ESCC患者。標(biāo)本采集后立即放無(wú)RNA酶的EP管中，-80 ℃冰箱保存。分別根據(jù)WHO病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)及臨床分期。其中男50例，女32例，年齡39～72歲，平均(59.86±5.8)歲；伴周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例，無(wú)周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；中、低分化54例，高分化28例。TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期28 例，Ⅲ、Ⅳ期54例。所有患者均接受手術(shù)治療且術(shù)后病理證實(shí)為ESCC，術(shù)前均未接受任何抗癌治療。標(biāo)本分別在癌組織、癌旁正常組織(取自手術(shù)切緣或癌組織邊緣5 cm以外)2個(gè)部位取材，均經(jīng)HE染色病理診斷證實(shí)。

1.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR 首先根據(jù)Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取癌組織及癌旁組織總RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參。B7-H3上游引物：5’-AGC ACT GTG GTT TGG TAT CTG TCA G-3’；下游引物：5’-CAC CAG CTG TTT GGT ATC TGT CAG-3’。β-actin上游引物：5’-GGT GTG ATG GTGGGT ATG GGT-3’；下游引物：5’-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3’。反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性1 min，然后擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃、5 s，60 ℃、30 s。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。用SDS(2.4版)進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)分析采用比較Ct(ΔΔCt)值的方法。

1.3 采用免疫組化SP法檢測(cè)B7-H3和Smad7蛋白的表達(dá) 兔抗人B7-H3多克隆抗體(1∶100)、兔抗人Smad7多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司SP試劑盒和DAB 顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。癌組織和癌旁正常組織脫水常規(guī)處理后，滴加經(jīng)PBS液稀釋的一抗、二抗及辣根過(guò)氧化物酶鏈霉卵白素液，DAB顯色工作液進(jìn)行顯色，蘇核復(fù)染脫水、透明、封片，于鏡下觀察。B7-H3和Smad7蛋白在ESCC中的著色都主要定位于胞質(zhì)，陽(yáng)性顆粒為棕黃色。隨機(jī)挑選每張切片中的5個(gè)高倍視野，于每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，得到陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。所有切片結(jié)果的判讀均由兩位高年資有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)老師指導(dǎo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理。采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較B7-H3、Smad7在ESCC和正常食管黏膜組織中陽(yáng)性表達(dá)率的差異；采用χ2檢驗(yàn)比較B7-H3和Smad7蛋白在ESCC組織中表達(dá)與臨床病理各變量間的關(guān)系；采用Spearman相關(guān)性分析對(duì)ESCC組織中兩指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC和癌旁正常組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達(dá)情況 ESCC和癌旁正常組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。B7-H3在ESCC組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁正常組織，Smad7蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于癌旁正常組織(P<0.05)。見(jiàn)表1。

A：B7-H3在ESCC中陽(yáng)性表達(dá)(400×)；B：Smad7在ESCC中陰性表達(dá)(400×)；C：B7-H3在癌旁正常組織中陰性表達(dá)(400×)；D：Smad7在癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)(400×)。

圖1 B7-H3和Smad7蛋白在食管癌組織中的表達(dá)

2.2 B7-H3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 B7-H3 mRNA在ESCC中的相對(duì)表達(dá)水平高于癌旁正常組織(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 B7-H3在ESCC和癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)水平

2.3 ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白表達(dá)的相關(guān)性 ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.294，P=0.005)。見(jiàn)表2。

表2 ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.4 B7-H3和Smad7蛋白表達(dá)與ESCC分化及臨床特征的關(guān)系 ESCC組織中B7-H3蛋白表達(dá)與臨床分期、分化程度有關(guān)(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)與分化程度有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 B7-H3和Smad7蛋白表達(dá)與ESCC分化及臨床分級(jí)的關(guān)系[n(%)]

3 討論

食管癌惡性程度較高，臨床發(fā)現(xiàn)的多為中晚期患者[5]。腫瘤的形成和多種原因有關(guān)，包括易感基因、生活環(huán)境、誘導(dǎo)因素等[6]。淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，主要受組織相容性抗原和共刺激分子的調(diào)節(jié)。B7-H3是一種跨膜糖蛋白，可接受共刺激分子的調(diào)節(jié)，引起下游通路的激活或抑制，作用于T細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中抑制T細(xì)胞的活化、多種細(xì)胞因子的合成，利于腫瘤的增生。B7-H3的異常表達(dá)與肺癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤相關(guān)[4]。

研究表明，B7-H3在腫瘤組織中通過(guò)上調(diào)TLR4的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致NF-κB通路的激活，而NF-κB的激活發(fā)揮正反饋?zhàn)饔茫险{(diào)B7-H3在腫瘤組織中的表達(dá)，并且與腫瘤新生血管的形成密切相關(guān)，促進(jìn)癌組織的轉(zhuǎn)移[7]。所以在腫瘤組織中，B7-H3的表達(dá)水平是升高的。TGF-β信號(hào)通路主要與EMT有關(guān)，涉及多種Smad蛋白，如Smad2、Smad4，通過(guò)與TGF-β受體結(jié)合以轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，參與遺傳物質(zhì)的調(diào)控，產(chǎn)生抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的效應(yīng)，而TGF-β信號(hào)通路可通過(guò)TAK1促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活[8]。TGF-β和NF-κB的激活促進(jìn)Smad7的表達(dá)，而Smad7在該通路中發(fā)揮負(fù)反饋?zhàn)饔?，是一種負(fù)調(diào)控因子，具有抑癌作用。在癌組織中，由于這種相互作用，致癌因子增多，抑癌因子減少，Smad7表達(dá)水平降低，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增生及轉(zhuǎn)移[9]。

本研究運(yùn)用免疫組化方法測(cè)定ESCC組織及癌旁正常組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示ESCC組織中B7-H3蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05)，Smad7蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)，ESCC組織中B7-H3和Smad7蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；ESCC組織中B7-H3蛋白表達(dá)與臨床分期、分化程度有關(guān)(P<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)與分化程度有關(guān)(P<0.05)。由該結(jié)果可推測(cè)，B7-H3促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的激活，通過(guò)TGF-β信號(hào)通路的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致Smad7水平降低，誘發(fā)EMT，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，并且參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移。腫瘤的形成是多因素導(dǎo)致的，需要進(jìn)一步研究其發(fā)生原因。因此，深入研究ESCC中各種分子及信號(hào)通路的作用機(jī)制，有利于更好地預(yù)防腫瘤的發(fā)生，為治療方案的改進(jìn)以及預(yù)后評(píng)估提供參考。

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Expression of B7-H3 and Smad7 protein in esophageal squamous cell carcinoma tissue and the clinical significance

Li Zhen, Zhao Weixing

(PathologyTeachingSection,BasicMedicalCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

Objective To explore the expression of B7-H3 and Smad7 protein in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissue and the clinical significance. Methods Eighty-two cases of ESCC tissues and adjacent normal tissues were selected and the expression of B7-H3 and Smad7 protein were detected by immunohistochemistry. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression level of mRNA B7-H3 in ESCC tissues and adjacent normal tissues. Results Positive expression rate of B7-H3 protein in ESCC tissues was significantly higher than the adjacent normal tissues (P<0.05), and the positive expression rate of Smad7 protein was lower than the adjacent normal tissues (P<0.05). The expression of B7-H3 protein was negatively correlated with Smad7 protein in ESCC tissues (rs=-0.294,P=0.005). Expression of B7-H3 protein was significantly related to clinic staging and differentiation grade (P<0.05), and the expression of Smad7 protein was significantly related to differentiation grade (P<0.05). Conclusion Expression of B7-H3 protein was up-regulated and expression of Smad7 protein was down-regulated in ESCC tissues. The abnormal expression of B7-H3 and Smad7 protein may be involved in the occurrence and development of ESCC.

Esophageal squamous cell carcinoma; B7-H3 protein; Smad7 protein

趙衛(wèi)星，E-mail：zwx9@xxmu.cdu.cn。

R 735.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.06.005

2017-02-12)