米 嬌，陳 翔，吳林蔚，楊 勇，楊 濤，甘廣東，莊名揚，周新虎，李國友

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都610041； 2.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

洋河大曲中螺甾醇健康功能因子研究

米 嬌1，陳 翔2，吳林蔚1，楊 勇2，楊 濤1，甘廣東2，莊名揚1，周新虎2，李國友1

（1.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川成都610041； 2.江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

白酒是我國最重要的傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，在世界范圍內(nèi)享有很高的聲譽。曲藥被稱為酒之骨，決定了白酒的風(fēng)格和品質(zhì)，對白酒釀造起著舉足輕重的作用。目前，主要采用頂空-固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用的方法研究大曲中低沸點香味物質(zhì)，對大曲中高沸點難揮發(fā)成分研究鮮有報道。本研究以洋河酒廠提供的大曲為材料，利用95%vol乙醇進(jìn)行提取，結(jié)合正相硅膠、反相硅膠、Sephadex LH-20等多種色譜技術(shù)，從大曲中分離得到6個螺甾醇類化合物，應(yīng)用核磁共振、質(zhì)譜等波譜技術(shù)分別將其鑒定為sarsasapogenin（1）、7α-hydroxysarsasapogenin（2）、yamogenin（3）、diosgenin（4）、neotigogenin（5）和tigogenin（6）。本研究首次從洋河大曲中發(fā)現(xiàn)了具有廣泛生理活性的螺甾醇類小分子，為揭示中國白酒的健康功能因子奠定了基礎(chǔ)。

大曲； 化學(xué)成分； 活性成分； 色譜技術(shù)； 螺甾醇

白酒是我國特有的酒種，它與白蘭地、威士忌、朗姆酒、伏特加和金酒齊名，被譽為世界著名的六大蒸餾酒之一[1]，在世界范圍內(nèi)享有很高的聲譽。白酒的釀造是以高粱、小麥等糧谷為主要原料，以曲藥為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾等步驟制作而成?！扒司浦恰?，曲為白酒發(fā)酵提供微生物、酶、香味物質(zhì)和香味前體物質(zhì)，決定了白酒的風(fēng)格和品質(zhì)[2]，對白酒釀造起著非常重要的作用?，F(xiàn)在通常采用自然制曲的方式生產(chǎn)大曲，因此，大曲中富集了來自原料、水、空氣、場地中復(fù)雜的微生物菌系。微生物在大曲中的生長繁殖過程中，將原料中的淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化為醇類、醛類、酸類、酮類、酯類等種類十分復(fù)雜的化學(xué)成分。大曲化學(xué)成分十分豐富，對白酒釀造、白酒香和味有重要貢獻(xiàn)。目前，研究者們主要用頂空-固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用的方法研究大曲中的揮發(fā)性化學(xué)成分，但這些方法最大的局限是它們很難檢測大曲中沸點較高的化合物。然而，高沸點化合物在白酒釀造過程同樣扮演著十分重要的角色，其對白酒呈香呈味有重要貢獻(xiàn)。為了系統(tǒng)全面地認(rèn)識大曲化學(xué)成分，充分闡明大曲對白酒質(zhì)量的影響，本實驗采用現(xiàn)代色譜技術(shù)和波譜手段對大曲的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲樣：洋河大曲酒廠提供的入庫貯存1個月的優(yōu)質(zhì)大曲。

耗材及試劑：薄層層析（TLC）硅膠和柱層析硅膠（200～300目，300～400目）均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；反相硅膠為蘇州納微生物科技有限公司產(chǎn)品；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20為GE Healthcare Bio-Sciences AB產(chǎn)品；甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、丙酮等均為工業(yè)級，重蒸后使用。254 nm和365 nm紫外、10%硫酸乙醇溶液加熱顯色及碘蒸氣顯色。

儀器設(shè)備：Bruker Avance 400核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）；Bruker Daltonics BioTOF-Q質(zhì)譜儀；HP 6890/5973 GC-MS為美國安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 螺甾醇的提取和分離

取洋河大曲曲塊（18.0 kg）粉碎，用4倍量95%vol乙醇室溫浸提2次，每次24 h，提取液過濾，減壓濃縮得浸膏158.5 g。將浸膏與硅膠均勻拌和，以硅膠柱層析的方法分離純化，以氯仿-甲醇體系（20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1）為洗脫劑進(jìn)行正相硅膠柱梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并得到15個部分（A—O）。A部分45.0 g，為油狀物，用GC-MS進(jìn)行分析。B部分共20.1 g，其中油狀物用GC-MS分析。C部分（15.4 g）經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯體系（30∶1、20∶1、10∶1、3∶1、1∶1）梯度洗脫，TLC檢測后合并為6段（C1—C6）。C1段結(jié)晶得化合物1（1286.4 mg）。C2段經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，氯仿-甲醇（1∶1）為洗脫劑，分為C21、C22、C23，其中將C22經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯體系（10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、1∶1）梯度洗脫，第6部分結(jié)晶得化合物3、4、5、6混合物（112.1 mg），第9部分經(jīng)過Sephadex LH-20柱層析，氯仿-甲醇（1∶1）為洗脫劑，結(jié)晶得到化合物2（67.0 mg）。

1.3 波譜數(shù)據(jù)測試

取樣品20～30 mg裝于核磁管中，加入0.5 mL的氘代氯仿，以400 MHz的核磁進(jìn)行數(shù)據(jù)采集得到1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

化合物1：C27H44O3；白色無定型粉末(甲醇)；1H-NMR(400 MHz，CDCl3)：δ 0.77(3H，s，H-18)，0.99(3H，s，H-19)，1.00(3H，d，J=7.8 Hz，H-21)，1.09 (3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，3.31(1H，d，J=10.8 Hz，H-26a)，3.96(1H，d，J=10.8 Hz，H-26b)，4.12(1H，brs，H-3)，4.41(1H，q，J=7.2 Hz，H-16)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 29.9(C-1)，27.8(C-2)，67.1(C-3)，33.5(C-4)，36.5(C-5)，26.5(C-6)，26.6(C-7)，35.3 (C-8)，40.3(C-9)，35.3(C-10)，20.9(C-11)，39.9(C-12)，40.6(C-13)，56.4(C-14)，31.7(C-15)，81.0(C-16)，62.1(C-17)，16.5(C-18)，23.9(C-19)，42.1(C-20)，14.3(C-21)，109.8(C-22)，27.1(C-23)，25.8(C-24)，26.0(C-25)，65.1(C-26)，16.1(C-27)。通過波譜數(shù)據(jù)分析，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照[3]，將該化合物鑒定為sarsasapogenin。

化合物2：C27H44O4；白色無定型粉末(甲醇)；ESI-MS：m/z 455.3[M+Na]+；1H-NMR(400 MHz，CDCl3)：δ 0.77(3H，s，H-18)，1.02(3H，s，H-19)，1.01 (3H，d，J=6.0 Hz，H-21)，1.09(3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，3.31(1H，d，J=10.9 Hz，H-26a)，3.96(1H，dd，J= 2.5，J=10.96 Hz，H-26e)，3.70(1H，td，J=2.9，J=11.9 Hz，H-7)，4.03(1H，brs，H-3)，4.38(1H，q，J=7.3 Hz，H-16)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 29.7(C-1)，26.4(C-2)，67.7(C-3)，32.3(C-4)，35.5(C-5)，38.4(C-6)，69.9(C-7)，35.3(C-8)，41.3(C-9)，36.9 (C-10)，21.1(C-11)，40.2(C-12)，40.6(C-13)，56.3(C-14)，31.7(C-15)，80.9(C-16)，62.1(C-17)，16.5 (C-18)，23.7(C-19)，42.1(C-20)，14.3(C-21)，109.8 (C-22)，26.0(C-23)，25.8(C-24)，27.1(C-25)，65.1 (C-26)，16.1(C-27)。通過波譜數(shù)據(jù)分析，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照[4]，將該化合物鑒定為7α-hydroxysarsasapogenin。

化合物3：C27H42O3；白色無定型粉末(甲醇)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 37.2(C-1)，26.0(C-2),71.7(C-3)，40.2(C-4)，140.8(C-5)，121.4(C-6)，32.1(C-7)，31.5(C-8)，50.1(C-9)，36.7(C-10)，20.9 (C-11)，42.3(C-12)，39.8(C-13)，56.5(C-14)，31.8 (C-15)，80.9(C-16)，61.9(C-17)，42.1(C-18)，19.4 (C-19)，14.4(C-20)，16.3(C-21)，109.8(C-22)，31.6 (C-23)，25.8(C-24)，27.1(C-25)，65.1(C-26)，16.1 (C-27)。通過波譜數(shù)據(jù)分析，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照[5]，將該化合物鑒定為yamogenin。

化合物4：C27H42O3；白色無定型粉末(甲醇)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)：δ 37.2(C-1),31.6(C-2),71.7(C-3),42.3(C-4),140.8(C-5),121.4(C-6),32.1(C-7),31.4(C-8),50.1(C-9),36.7(C-10), 20.9(C-11),39.8(C-12),40.2(C-13),56.5(C-14), 31.8(C-15),80.9(C-16),62.0(C-17),16.3(C-18), 19.4(C-19),41.6(C-20),14.5(C-21),109.3(C-22)，31.3(C-23)，28.8(C-24)，30.3(C-25)，66.8(C-26)，17.1(C-27)。通過波譜數(shù)據(jù)分析，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照[5]，將該化合物鑒定為diosgenin。

化合物5：C27H44O3；白色無定型粉末(甲醇)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 37.0(C-1)，32.3(C-2)，71.3(C-3)，38.2(C-4)，44.8(C-5)，28.6(C-6)，32.3(C-7)，35.1(C-8)，54.4(C-9)，35.6(C-10)，21.1 (C-11)，40.1(C-12)，40.6(C-13)，56.3(C-14)，31.8 (C-15)，81.0(C-16)，62.2(C-17)，16.5(C-18)，12.4 (C-19)，42.1(C-20)，14.3(C-21)，109.7(C-22)，26.0 (C-23)，25.8(C-24)，27.1(C-25)，65.1(C-26)，16.1 (C-27)。通過波譜數(shù)據(jù)分析，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照[5]，將該化合物鑒定為neotigogenin。

化合物6：C27H44O3；白色無定型粉末(甲醇)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)：δ 37.0(C-1)，31.4(C-2)，71.3(C-3)，38.2(C-4)，44.8(C-5)，28.6(C-6)，32.3(C-7)，35.1(C-8)，54.4(C-9)，35.6(C-10)，21.1 (C-11)，40.1(C-12)，40.6(C-13)，56.3(C-14),31.8 (C-15)，80.8(C-16)，62.2(C-17)，16.5(C-18)，12.4(C-19)，41.6(C-20)，14.5(C-21)，109.3(C-22)，31.4 (C-23)，28.8(C-24)，30.3(C-25)，66.8(C-26)，7.1 (C-27)。通過波譜數(shù)據(jù)分析，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對照[5]，將該化合物鑒定為tigogenin。

圖1 洋河大曲分離的化合物1—6的結(jié)構(gòu)

3 討論

本實驗從大曲中分離鑒定了6個小分子化學(xué)成分，經(jīng)過核磁共振鑒定，確定為sarsasapogenin（1）、7α-hydroxysarsasapogenin（2）、yamogenin（3）、diosgenin（4）、neotigogenin（5）和tigogenin（6）。這6個化合物為螺甾醇類化合物，之前對我國釀酒大曲的研究中尚無此類成分的報道，因此本研究成果屬于首次報道。此類型化合物具有十分廣泛的生理活性，如：sarsasapogenin（菝葜皂苷元）具有改善老年性癡呆、抗氧化、降血糖、抗骨質(zhì)疏松等作用；yamogenin（亞莫皂甙元）具有抗真菌的作用；diosgenin（薯蕷皂苷元）具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎、抗皮膚病與改善皮膚老化等作用[7]；tigogenin（劍麻皂素）具有降血糖、抗炎、鎮(zhèn)痛、增強免疫等作用[8-9]。我國白酒釀造中特殊的蒸餾方式，其蒸餾過程物理化學(xué)機理復(fù)雜，一些高沸點、大極性的成分容易被帶入白酒中。本研究中發(fā)現(xiàn)的健康功能因子可能以微量成分存在于白酒中，因此，本研究結(jié)果不僅豐富了我們對大曲中化學(xué)成分的認(rèn)識，更讓我們意識到大曲和白酒中存在許多未知的健康功能因子還有待深入研究和認(rèn)識。同時，螺甾醇類健康因子的發(fā)現(xiàn)，為中國白酒中健康功能因子的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)，有利于促進(jìn)我國白酒產(chǎn)品的健康發(fā)展。

[1] 朱寶鏞,章克昌.中國酒經(jīng)[M].上海：文化出版社,2002.

[2] 沈怡方,李大和.低度白酒生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1998.

[3] 于德泉,分析化學(xué)手冊（第七冊）核共振波譜分冊[M].3版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[4]RAHMAN A,CHOUDHARY M I,ASIF F,et al. Microbial transformation of sarsasaprgenin by Fusarium lini[J].Phytochemistry,1998,49(8)：2341-2342.

[5]TORI K,SEO S,TERUI Y,et al.Carbon-13 NMR spectra of 5β-steroidal sapogenins.Reassignment of the F-ring carbon signals of(25S)-spirostans[J].Tetrahedron l etters,1981,22(25)：2405-2408.

[6] 岳蕾,陳玲,寇俊萍,等.薯蕷皂苷元藥理活性及其機制研究進(jìn)展[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2010,15(2)：233-237.

[7] 李燕婧,周桂芬,韋善新,等.劍麻皂素藥理作用的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(10)：1958-1959.

[8] 賴克道,李燕婧,李茂.劍麻皂素降血糖作用的研究[J].廣西科學(xué)院學(xué)報,2010,26(1)：56-58.

Spirostanols with Health Functions in Yanghe Daqu

MI Jiao1,CHEN Xiang2,WU Linwei1,YANG Yong2,YANG Tao1,GAN Guangdong2, ZHUANG Mingyang1,ZHOU Xinhu2and LI Guoyou1
(1.Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu,Sichuan 601161;
2.Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

Daqu is closely related to the quality and styles of Baijiu.It plays an important role in liquor-making.At present,the flavoring compounds with low boiling point in Daqu are studied by HS-SPME-GC-MS.However,there are few reports on the flavoring compounds with high boiling point in Daqu.In this study,Daqu from Yanghe Distillery was used as the research object.6 spirostanols were isolated from Daqu through 95%vol ethanol extraction and multiple chromatographic technology including silica gel,reverse phase silica gel and Sephadex LH-20.On the basis of spectroscopic analysis,they were identified as sarsasapogenin(1),7α-hydroxysarsasapogenin(2),yamogenin(3),diosgenin(4),neotigogenin(5),and tigogenin(6).These spirastanols with diverse biological activities were reported in Yanghe Daqu for the first time,which laid the foundation for discovering healthy constituents in Chinese Baijiu in the future.

Daqu;chemical constituents;bioactive components;chromatography;spirostanols

TS262.3；TS261.1；TS21.7

A

1001-9286（2017）05-0031-04

10.13746/j.njkj.2017064

2017-03-21

李國友（1977-），男，羌族，理學(xué)博士，中國科學(xué)院成都生物研究所，主要從事天然產(chǎn)物研究工作。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2017-03-30；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170330.1541.003.html。