杜 蘭,張振軒,朱亞先,張 勇*

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空間位阻對(duì)溶解態(tài)甲基菲生物降解的影響

杜 蘭1,張振軒1,朱亞先2,張 勇1*

(1.廈門(mén)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院,近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361102；2.廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系,福建廈門(mén)361005)

以菲(Phe)和甲基菲(MP:1-MP、3-MP、4-MP、9-MP)為研究對(duì)象,運(yùn)用同步熒光法研究微生物US6-1對(duì)5種溶解態(tài)多環(huán)芳烴(PAHs)的降解特性.結(jié)果顯示:MP在8×10-7,1.2×10-6mol/L2種濃度下,其生物降解過(guò)程符合零級(jí)動(dòng)力學(xué),降解速率均為:4-MP<9-MP<1-MP<3-MP;5種PAHs的最大生物降解速率同理論最大跨膜通量存在良好的線性關(guān)系;NaN3對(duì)Phe降解速率影響較小,但抑制MP降解且抑制程度與取代基位置有關(guān).

甲基菲；同系物；生物降解；跨膜過(guò)程

菲(Phe)及其烷基取代物是石油中常見(jiàn)的有機(jī)污染物[1-2].烷基取代多環(huán)芳烴(A-PAHs)的毒性常常強(qiáng)于其母環(huán)PAHs,在環(huán)境中尤其是海洋溢油區(qū),其含量顯著高于其母環(huán)化合物[3-4].因此研究水環(huán)境中A-PAHs的污染及其去除十分重要.生物降解是去除環(huán)境中PAHs最為有效的手段之一[5-6].研究表明細(xì)菌對(duì)PAHs的降解多屬于胞內(nèi)反應(yīng),生物體內(nèi)降解酶系是影響細(xì)菌降解PAHs的關(guān)鍵因素[7-8];PAHs進(jìn)入細(xì)胞的途徑是影響其降解的重要因素;而底物的位阻效應(yīng)會(huì)干擾其與降解酶和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合[9-10],進(jìn)而影響底物的降解過(guò)程[11-12].取代基位阻效應(yīng)對(duì)甲基萘生物降解影響已有報(bào)道[13-15].然而,目前關(guān)于溶解態(tài)A-PAHs尤其是3環(huán)及以上A-PAHs結(jié)構(gòu)的差異對(duì)其生物降解影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道.

本文選取新鞘氨醇桿菌() US6-1為降解菌,以Phe及甲基菲(MP, 如1-MP、3-MP、4-MP和9-MP)為研究對(duì)象,運(yùn)用同步熒光法研究上述目標(biāo)物生物降解過(guò)程和跨膜機(jī)理,以期為評(píng)估PAHs在水環(huán)境中轉(zhuǎn)化,歸宿及風(fēng)險(xiǎn)性提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP(純度>98%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司); (NH4)2SO4、Na2HPO4、K2HPO4、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CaCl2·2H2O、NaOH、FeCl3·6H2O、MgSO4·7H2O (A.R.,國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司);無(wú)水乙醇(A.R.,西隴化工股份有限公司);富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基:2216E(青島海博生物技術(shù)有限公司),NaN3(純度>99%,天津福晨化學(xué)試劑廠). MSM液體培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[16].

FLS 920型納秒時(shí)間分辨熒光光譜儀(Edinburgh Instrument公司,英國(guó));752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);HV-50全自動(dòng)電子滅菌器(Hiragama公司,日本);Universal 320R高速冷凍離心機(jī)(Hettich公司,德國(guó)); VS- 840K-U潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司); Sky 2102C恒溫振蕩器(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

US6-1由韓國(guó)海洋研究與發(fā)展院提供,可降解芴, Phe,蒽和芘(Pyr)等PAHs[16].

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Phe及MP同步熒光法波長(zhǎng)差(Δ)的選取 熒光法具有快速、靈敏和非破壞性等特點(diǎn),已被用于檢測(cè)生物降解過(guò)程中溶解態(tài)PAHs的濃度變化[17].分別稱(chēng)取一定量Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙醇,配制成1.0×10-2mol/L的儲(chǔ)備液,置于4℃冰箱保存.取適量PAHs儲(chǔ)備液于10mL比色管中,氮吹至近干后用MSM溶液定容至10mL,混勻并超聲20min.分別掃描上述5種PAHs的熒光光譜,設(shè)置ex=220~340nm,em= 320~420nm;步距均為2nm;激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2nm,確定5種PAHs的Δ和波長(zhǎng)范圍[17-18].

1.3.2 PAHs的生物降解實(shí)驗(yàn) 為考察US6-1對(duì)MP降解規(guī)律及其與濃度的關(guān)系,對(duì)5種PAHs在2種濃度條件下的降解過(guò)程展開(kāi)研究.第1組PAHs濃度均為0.8×10-6mol/L,第2組PAHs濃度均為1.2×10-6mol/L.取適量上述PAHs儲(chǔ)備液于125mL錐形瓶中,氮吹至近干后加入100mL MSM溶液.接種菌后于搖床中避光震蕩培養(yǎng)(25℃, 150r/min)[16].適當(dāng)時(shí)間后以1.3.1節(jié)方法直接測(cè)定降解體系中PAHs熒光強(qiáng)度.實(shí)驗(yàn)設(shè)3組平行.通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)降解菌初始生物量OD600=0.001時(shí),降解PAHs效率高且實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯,其余具體實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1節(jié).實(shí)驗(yàn)所用容器及培養(yǎng)液均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌20min.

1.3.3 最大生物降解速率 Phe濃度為5.0× 10-6mol/L,MP在濃度為1.2×10-6mol/L實(shí)驗(yàn)見(jiàn)1.3.2節(jié).取降解菌初始生物量OD600=0.001,其余具體實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1節(jié).

1.3.4 PAHs跨膜方式的研究方法 為使5種PAHs在較短時(shí)間內(nèi)降解明顯,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中Phe和3-MP濃度為8×10-7mol/L,1-MP濃度為7×10-7mol/L, 4-MP濃度為3×10-7mol/L, 9MP濃度為5×10-7mol/L.取適量NaN3配置成5mol/L儲(chǔ)備液,實(shí)驗(yàn)時(shí)取600mL儲(chǔ)備液加入實(shí)驗(yàn)組降解體系,使其最終濃度為30mmol/L,OD600= 0.001.其余實(shí)驗(yàn)過(guò)程參考1.3.1節(jié).

2 結(jié)果與討論

2.1 Phe及MP同步熒光波長(zhǎng)差的選取及其工作曲線

表1 同步熒光光譜法的分析特性參數(shù)

運(yùn)用同步熒光技術(shù),每隔1nm,分別考察Δ=45~65nm時(shí)Phe和MP的同步熒光光譜.結(jié)果表明Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP的最佳測(cè)定波長(zhǎng)差分別為54,52,53,55,55nm.在各自最優(yōu)條件下,分別掃描梯度濃度PAHs溶液的同步熒光,并以各自最大熒光峰處強(qiáng)度()對(duì)其濃度(,mol/L)作圖.結(jié)果表明,一定濃度范圍內(nèi)5種PAHs的濃度(mmol/L)和熒光信號(hào)值呈良好的線性關(guān)系,其分析特性見(jiàn)表1.

2.2 空間位阻對(duì)MP生物降解影響

已有文獻(xiàn)報(bào)道US6-1可降解苯并[a]芘[19]、Phe[20]、Pyr[20]等,關(guān)于其對(duì)MP降解未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1),US6-1不僅可降解Phe,還可有效降解MP.

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合(表2).結(jié)果表明在0.8×10-6和1.2×10-6mol/L 2種濃度條件下,Phe及MP降解過(guò)程均符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(230.9738),且其降解速率隨濃度增大而增大.5種PAHs降解速率大小順序?yàn)?-MP(位)<9-MP(位)<1-MP(位)<3-MP(位)≈Phe,其中3-MP的降解速率常數(shù)分別是1-MP、4-MP、9-MP的1.24、3.68、1.75倍,可見(jiàn)位取代的MP降解要明顯慢于位取代的MP. Malmquist等[21]研究指出A-PAHs生物降解速率受烷基取代基位置的影響.俞頔等[22]分析了非溶解態(tài)烷基萘各異構(gòu)體生物降解過(guò)程,證實(shí)了烷基萘在石油介質(zhì)中的降解受控于異構(gòu)體萘環(huán)上取代基位置.Wammer和Peters[23]研究了對(duì)溶解態(tài)甲基萘(MN) 異構(gòu)體生物降解過(guò)程中發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象.結(jié)合本研究結(jié)果可知,a位取代的A-PAHs降解要慢于b位取代的A-PAHs.其原因可能是甲基取代基的空間位阻效應(yīng)阻礙了MP與酶結(jié)合[10,24-25],致使其降解速率的減小.

表2 5種PAHs生物降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注:為PAHs降解時(shí)間(h);為MSM溶液中PAHs的濃度(mol/L).

2.3 空間位阻對(duì)跨膜過(guò)程的影響

芳香化合物如PAHs主要通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞[11].近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜上存在一些胞外蛋白參與調(diào)節(jié)吸收芳香化合物[14].Dimitriou-Cristidis等[15]指出,較于母環(huán)PAHs, A-PAHs生物降解速率下降是由于烷基取代基的空間位阻不僅影響基質(zhì)與酶結(jié)合,還影響其跨膜過(guò)程. Bressler等[13]通過(guò)最大生物降解速率(max)與理論最大跨膜通量(max)的關(guān)系研究了16種溶解態(tài)有機(jī)污染物的跨膜過(guò)程與生物降解速率之間的關(guān)系.因此,為研究上述5種PAHs降解過(guò)程中跨膜作用,對(duì)表3中max和max進(jìn)行線性擬合.

由圖2可知,上述PAHs的max與max存在一定的相關(guān)性,表明跨膜過(guò)程是PAHs生物降解過(guò)程中的限速步驟[13,15].由于max是由與濃度梯度相關(guān)的公式推導(dǎo)得到,因此這5種PAHs進(jìn)入U(xiǎn)S6-1屬于被動(dòng)擴(kuò)散[15].另外,3-MP和4-MP偏離這條趨勢(shì)線.根據(jù)已有研究指出位于回歸線上的PAHs生物降解速率受跨膜通量影響,可認(rèn)為回歸線以上的3-MP跨膜方式不僅包括自由擴(kuò)散還涉及其他過(guò)程,而位于線性回歸以下的4-MP的降解不僅受跨膜的限制,還受酶轉(zhuǎn)化的影響[13].

表3 5種PAHs生物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注 :MP的max為表2中濃度為1.2×10-6mol/L時(shí)降解速率;max是根據(jù)文獻(xiàn)Bressler[13]公式max=0.003×ow××WM-1/2計(jì)算得到; logow值由EPI Suite得到.

30mmol/L NaN3能抑制膜蛋白,短期內(nèi)不會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響[11,14].為進(jìn)一步探究Phe及MP進(jìn)入U(xiǎn)S6-1的方式,即烷基取代基的位阻效應(yīng)是否改變了MP跨膜過(guò)程,分別考察了NaN3對(duì)Phe和MP生物降解過(guò)程的影響(圖3).

由圖3可知,前3h NaN3未影響Phe降解: 3h以內(nèi),Phe濃度相差±0.23×10-7mol/L;3.5h時(shí),未添加NaN3Phe的剩余濃度為1.33×10-7mol/L,添加NaN3組則為1.77×10-7mol/L.因此,比較3h內(nèi)NaN3存在和不存在條件下MP的降解狀況[14],結(jié)果表明較于Phe, NaN3存在下MP降解受到抑制.可能原因是當(dāng)NaN3存在時(shí),膜蛋白被抑制,而MP進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)需膜蛋白參與,因此MP跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)減少,導(dǎo)致MP降解速率減弱;Phe跨膜過(guò)程主要是自由擴(kuò)散,不受膜蛋白影響,短期內(nèi)降解不受NaN3影響[15].因此甲基取代基改變了PAHs跨膜方式:Phe主要是自由擴(kuò)散,MP則需膜蛋白參與.MP受抑制程度與取代基位置有關(guān):4-MP (19.0%)>9-MP(11.1%)>3-MP(5.52%)>1-MP(8.78%),結(jié)合2.2節(jié)MP各異構(gòu)體降解快慢趨勢(shì),發(fā)現(xiàn)MP受NaN3抑制程度與其生物降解過(guò)程存在相關(guān)性.有類(lèi)似研究報(bào)道烴的跨膜傳輸具有選擇性且選擇的次序與細(xì)胞對(duì)底物降解的偏好性相符[26].但通過(guò)現(xiàn)有的技術(shù)手段無(wú)法判斷不同MP的膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白性質(zhì),相關(guān)研究有待進(jìn)一步開(kāi)展.

3 結(jié)論

3.1 Phe和MP同步熒光法線性范圍分別為(0.08~6.00),(0.08~1.20)×10-6mol/L,2>0.9912,能夠用于US6-1降解溶解態(tài)MP的過(guò)程研究.

3.2 菲環(huán)上不同位置的甲基取代基產(chǎn)生了不同空間位阻效應(yīng),進(jìn)而影響MP異構(gòu)體的生物降解,降解速率趨勢(shì)為:4-MP(位)<9-MP(位)<1-MP(位)< 3-MP(位),位取代MP降解速率慢于位取代MP.

3.3 甲基取代基產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)改變A-PAHs跨膜方式,且與取代基位置相關(guān),進(jìn)而影響其生物降解過(guò)程.生物降解過(guò)程涉及如代謝物,酶蛋白及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等諸多因素,因此為更全面了解A-PAHs生物降解過(guò)程及機(jī)理,需進(jìn)一步借助如蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝物組學(xué)進(jìn)行研究.

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Effect of steric hindrance on the biodegradation of dissolved methyl-phenanthrene.

DU Lan1, ZHANG Zhen-xuan1, ZHU Ya-xian2, ZHANG Yong1*

(1.State Key Laboratory of Marine Environmental Science of China, College of Environment and Ecology, Xiamen University, Xiamen 361102, China；2.Department of Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China).

The biodegradation of dissolved phenanthrene (Phe) and methyl-phenanthrene (MP), including1-MP, 3-MP, 4-MP and 9-MP by the bacteriumUS6-1was individually studied using synchronous fluorescence spectrometry. The biodegradation of MP was adequately described by zero-order kinetics at two concentrations, i.e., 8×10-7mol/L and 1.2×10-6mol/L. The rates of biodegradation were generally in the following order: 4-MP<9-MP<1-MP<3-MP. There was a good linear relationship between the measured maximum biodegradation rates and the theoretical maximum transmembrane fluxes. The addition of NaN3exerted little effects on the biodegradation of Phe but inhibited that of MP, with the degree of inhibition dependent on the position of the methyl substituent.

methyl-phenanthrene；isomer；biodegradation；membrane transport

X127

A

1000-6923(2017)04-1375-05

2016-08-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21177102,21577110);國(guó)家海洋局海洋溢油鑒別與損害評(píng)估技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目(201405);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20130121130005)

杜 蘭(1991-),女,安徽銅陵人,廈門(mén)大學(xué)碩士研究生,從事PAHs生物降解研究.

* 責(zé)任作者, 教授, yzhang@xmu.edu.cn

, 2017,37(4)：1375~1379