王 政，蔣 靜，張磊萍，王 艷

（1.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品安全檢測中心，上海 201202；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

·簡報(bào)·

蝦桃拉病毒、黃頭病毒和白斑病毒液相芯片快速檢測方法的建立

王 政1，蔣 靜2，張磊萍2，王 艷2

（1.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品安全檢測中心，上海 201202；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

本研究通過設(shè)計(jì)、合成并修飾基因特異性引物和寡核苷酸探針并標(biāo)記生物素，利用該探針與熒光編碼微球偶聯(lián)后與蝦黃頭病毒（Yellow head virus，YHV）、蝦桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus，TSV）和白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的PCR產(chǎn)物雜交反應(yīng)，用液相芯片檢測儀（Luminex200）檢測熒光信號，初步建立了蝦黃頭病毒、桃拉病毒和白斑病毒的快速同步檢測方法。結(jié)果顯示，建立的該方法具有較好的特異性，偶聯(lián)特異性探針的微球只與相應(yīng)的病毒基因的PCR產(chǎn)物反應(yīng)，而不與其他蝦病病毒基因反應(yīng)，YHV、TSV和WSSV檢測靈敏度高分別為401.5、251.5和75.2 copies。

蝦桃拉病毒；蝦黃頭病毒；白斑病毒；液相芯片

白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、Taura綜合征病毒（Taura syndrome virus，TSV）和黃頭病毒（Y ellow head virus， Y HV）是廣泛流行并嚴(yán)重威脅蝦養(yǎng)殖的三種主要病原體，引起的蝦白斑綜合征、Taura綜合征和黃頭病均屬世界動物衛(wèi)生組織（international office ofepizootic disease, OIE）規(guī)定的必需上報(bào)的疫病[1,2]。WSSV為一種無包涵體病毒，地理分布廣，流行范圍大，傳染性強(qiáng)，對發(fā)病蝦致死時(shí)間短，目前尚無有效的治療藥物，還不能有效地控制疫情[3,4]。TSV最早的暴發(fā)流行在南北美洲，1992年夏季厄瓜多爾Taura河附近的蝦養(yǎng)殖場首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道幼蝦（Penaeus vannamei）感染TSV。YHV開始流行主要在東南亞一帶，1990年泰國首次發(fā)現(xiàn)Y HV引起黑虎蝦（Black tiger shrimp）大量死亡。由于沒有TSV和Y HV的有效防治措施，它們目前的影響已遠(yuǎn)超過了原有區(qū)域，尤其是TSV，近年來已嚴(yán)重危害著亞洲各國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。2005年3月至2006年3月，使用RT-PCR方法，上海出入境檢驗(yàn)檢疫局從浦東國際機(jī)場口岸入境的195批鮮活草蝦中檢出TSV陽性草蝦12批、Y HV陽性草蝦7批，另檢出TSV和Y HV混合感染草蝦2批[5]。

美國納斯達(dá)克上市的Luminex公司研發(fā)的液相芯片技術(shù)，又稱懸浮陣列/流式熒光技術(shù)，具有高通量、敏感性高、速度快的特點(diǎn)，既可進(jìn)行免疫學(xué)檢測也可進(jìn)行核酸檢測[6-9]。本研究利用液相芯片技術(shù)對Y HV、TSV和WSSV同時(shí)進(jìn)行檢測，并評價(jià)該方法的靈敏度和特異性，以期為多種蝦病的快速檢測和診斷提供一種敏感、快速和高效的方法。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和樣品

1.1.1 陽性對照 蝦黃頭病毒（Y HV）、蝦桃拉綜合癥病毒（TSV）、白斑綜合癥病毒（WSSV）、皰疹病毒（koi herpes virus，K HV）、動物流行性潰瘍綜合癥病毒（Epizootic ulcerative syndrome virus，EUS）、流行性造血器官壞死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV）和傳染性皮下及造血組織壞死病毒（Infections hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）由上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物與毒理實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。所有樣品均為進(jìn)境鮮活水產(chǎn)品草蝦樣品。

1.1.2 試劑和儀器 鏈霉素-親和素-藻紅蛋白（SAPE）購自美國Invitrogen公司；表面羧基化的熒光編碼微球購自美國Bio-Rad公司；Luminex 200液相芯片檢測儀為美國Luminex公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 探針及引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank登錄的WSSV基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件找出基因中最保守的25個(gè)寡核苷酸（oligo nucleotide，nt）作為液相芯片檢測探針，探針的Tm值盡量保持在56℃~58℃，分別在探針的上下游設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物，應(yīng)用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物、探針?biāo)虸nvitrogen公司合成，下游引物的5'端標(biāo)記生物素，Probe的5'-C6標(biāo)記氨基，探針反向互補(bǔ)序列RC-Probe的5'端標(biāo)記生物素。Y HPPI：5'-ATTCAGCACCTGGGCTCGTCTC-3'，Y HV-P2：5'-GGT A T CA CCGT T CA GT GT CT TG-3'，探針：5'-GTCGCATACACTAAACTACA -3'；TSV-P1：5'-ATTGAATACTTAGCACAGCGA CC-3'，TSV-P2：5'-GAACACCACTACCATAGGG GAG-3'，探針：5'-GCTCAACAGATACACTATCA -3'；WSSV-PI：5'-ACGTGTTGGAAGAAGCGTC GTCG-3'，WSSV-P2：5'-TGCTGCACACGTCAAT GAGGG-3'，探針：5'-AGAGAGGTCCTACAATAC TC-3'。引物用水溶解成200μ mol/mL貯存母液備用。

1.2.2 寡核苷酸探針與微球的共價(jià)偶聯(lián) 將所有試劑恢復(fù)至室溫，重懸微球，取200 μ L微球（5×106）至1.5 mL的聚丙烯微量離心管中，離心去上清，加入MES（0.1 mol/L，pH=4.5）50 μ L混勻，加入相應(yīng)的寡核苷酸探針0.2 nmol/μ L。再加入新鮮配制的EDC溶液（10 mg/mL）10 μ L，充分混勻，室溫避光孵育30 min，重復(fù)1次。用1 mL Tween-20（0.02 %V/V）和1 mL SDS（0.1% w/v）各洗滌1次，最后用適量的MES（0.1 mol/L，pH=4.5）重懸微球，采用血球計(jì)數(shù)法對制備的熒光編碼微球進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出熒光編碼微球的濃度，2℃~8℃避光保存。

1.2.3 液相芯片體系的優(yōu)化

1.2.3.1 雜交溫度的優(yōu)化 雜交反應(yīng)在45 min條件下，根據(jù)探針的Tm值，選定42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃六個(gè)溫度梯度為研究對象，考察不同雜交溫度下液相芯片的檢測效果。

1.2.3.2 雜交時(shí)間的優(yōu)化 分別選取30、45、60、75、90 min五個(gè)雜交時(shí)間，選擇最適宜的雜交時(shí)間。

1.2.3.3 SAPE濃度對于液相芯片體系的影響 同1.2.3.1步驟操作，采用優(yōu)化好的雜交溫度和雜交時(shí)間，研究使用不同濃度的SAPE參與反應(yīng)對檢測信號的影響。

1.2.3.4 液相芯片檢測體系閾值 提取使用其他方法確定的TSV、Y HV陰性樣品20份的RNA，經(jīng)RT- PCR擴(kuò)增；提取WSSV PCR陰性樣品20份的DNA為模板擴(kuò)增。所得到的 PCR產(chǎn)物用于液相芯片的檢測試驗(yàn)，檢測20份樣品的MFI可以計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.3.5 液相芯片檢測體系靈敏度 將TSV、Y HV、WSSV基因組的RT-PCR產(chǎn)物或者PCR產(chǎn)物構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7這7種稀釋度的稀釋液，用建立的液相芯片法進(jìn)行檢測。

1.2.3.6 液相芯片檢測體系特異性 將Y HV、TSV、WSSV、IHHNV、EUS、EHNV和KHV基因組的RTPCR產(chǎn)物或者PCR產(chǎn)物，用建立的液相芯片方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜交溫度對液相芯片檢測方法的影響 分別Y HV、TSV和WSSV的目標(biāo)片段，將其與探針微球雜交，設(shè)置不同的雜交溫度（42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃）進(jìn)行雜交，液相芯片法檢測MFI結(jié)果見圖1。隨著雜交溫度的提高，3種病毒的平均熒光強(qiáng)度都出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)雜交溫度為46℃時(shí)3種病毒的平均熒光強(qiáng)度均達(dá)到最高值，故選擇46℃為檢測體系的雜交溫度。

寡核苷酸探針雜交的最佳條件要既能保證雜交的特異性，又能在適當(dāng)?shù)乃俾氏滦纬煞€(wěn)定的雜交體。探針序列越長，越易形成雜交體，但缺乏特異性，且雜交速率減慢。短探針具有較高的特異性，但存在不穩(wěn)定的雜交體缺陷。溫度對雜交效果有明顯的影響，因此選擇最適當(dāng)?shù)碾s交溫度可以增強(qiáng)雜交的特異性，降低非特異性雜交的熒光強(qiáng)度。本試驗(yàn)中，根據(jù)探針的Tm值，選定42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃六個(gè)溫度梯度為研究對象，考察不同雜交溫度下液相芯片的檢測效果。結(jié)果表明，MFI隨著溫度的升高平緩上升，但溫度達(dá)到46℃時(shí)，MFI達(dá)到最大值，雜交溫度達(dá)到48℃時(shí)，平均熒光強(qiáng)度驟，存在顯著性差異，故最終選擇46℃作為最佳反應(yīng)溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同雜交溫度下YHV、TSV和WSSV的液相芯片檢測結(jié)果Fig.1 The detection result of YHV, TSV and WSSV byliquichip technique at different hybrid temperature

2.2 雜交時(shí)間對液相芯片檢測方法的影響 分別選取30、45、60、75、90 min為雜交時(shí)間，進(jìn)行Y HV、TSV和WSSV的液相芯片檢測反應(yīng)的MFI值，結(jié)果顯示，隨著雜交時(shí)間的增加Y HV的MFI先增加，至45 min后進(jìn)入一段平臺期，75 min后MFI值略有下降；TSV的MFI值隨著時(shí)間的增加而平穩(wěn)增加，直至75 min時(shí)到達(dá)最高點(diǎn)，隨后逐漸下降；WSSV的MFI值為30~75 min，隨時(shí)間推移，數(shù)值上升，后則呈下降趨勢（圖2）。綜上所述，選擇60 min為3個(gè)病毒共用的雜交反應(yīng)時(shí)間。

2.3 SAPE濃度對液相芯片檢測方法的影響 將YHV、TSV和WSSV目的片段與微球在46℃雜交60 min后，加入70 μ L的SAPE，濃度分別為1、2、4、8、16 ng/mL反應(yīng)完畢后檢測MFI。結(jié)果顯示，隨著SAPE濃度的增加，樣品和空白對照的MFI值都顯著增加，當(dāng)SAPE濃度由1 ng/mL增加至8 ng/mL時(shí)，Y HV、TSV和WSSV的MFI值顯著增加。SAPE后濃度繼續(xù)增加至16 ng/mL時(shí) ，Y HV和TSV的MFI值增加緩慢，而WSSV則略有下降。以Y HV為例，當(dāng)SAPE濃度為1 ng/mL時(shí)，MFI的值為285.7；當(dāng)SAPE濃度變?yōu)? ng/mL時(shí)MFI值增至2.1倍；SAPE濃度分別增加至4、8、16 ng/mL時(shí)，MFI值則分別是1 ng/ mL時(shí)MFI值的4.3倍、7.8倍和8.8倍。TSV和WSSV的變化趨勢與之相仿，故選擇8 ng/mL作為后期實(shí)驗(yàn)的SAPE濃度。

圖2 不同雜交時(shí)間下YHV、TSV和WSSV的液相芯片檢測結(jié)果Fig.2 The detection result of YHV, TSV and WSSV by liquichip technique at different hybridization time

本研究對雜交溫度、雜交時(shí)間、SAPE濃度等進(jìn)行探索的過程中，發(fā)現(xiàn)在分析結(jié)果時(shí)，盡量圈定微球相對集中區(qū)域，這樣可以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 SAPE濃度對液相芯片檢測方法的影響Table 1 The effects of concentration of SAPE on liquichip technique

2.4 液相芯片檢測方法閾值的確定 提取其他方法確定的TSV、Y HV陰性樣品20份的RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增；提取WSSV PCR陰性樣品20份的DNA為模板擴(kuò)增。所得到的PCR產(chǎn)物用于液相芯片的檢測試驗(yàn)，用液相芯片法測得MFI的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算閾值，結(jié)果見表2，Y HV、TSV和WSSV的閾值分別為214.55、143.86和108.48，當(dāng)樣品的MFI值高于cut-off值時(shí)視為陽性。

2.5 液相芯片檢測體系靈敏度的檢測 將TSV、Y HV、WSSV基因組模板作梯度稀釋，選擇稀釋倍數(shù)為101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍和107倍稀釋，作為PCR擴(kuò)增模板，用PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增后于建立的液相芯片檢測體系中進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖3所示，MFI值于稀釋度的log值存在線性關(guān)系，即TSV：MFI=-448.2logX+4307；WSSV：MFI=-130.3logX+984.2； Y HV：MFI=-103.3 logX+768.5，其中MFI表示平均熒光強(qiáng)度，X表示稀釋度，該回歸曲線的R2分別為0.993、0.954和0.997，可以根據(jù)平均熒光強(qiáng)度MFI對病毒的污染量做半定量分析，將表2中的閾值帶入回歸曲線方程，求得TSV、Y HV和WSSV靈敏度達(dá)401.5、251.5、75.2 copies。

表2 液相芯片檢測方法的閾值Table 2 MFI value of liquichip for YHV, TSV and WSSV

圖3 液相芯片檢測體系靈敏度結(jié)果Fig.3 The sensitivity test of liquichip for YHV, TSV and WSSV

2.6 液相芯片檢測體系特異性試驗(yàn)結(jié)果 提取其他方法確定Y HV、TSV、WSSV、IHHNV、EUS、EHNV、KHV分別為陽性樣品的基因組RNA（提取RNA轉(zhuǎn)化為cDNA）作為PCR擴(kuò)增模板用PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增后于建立的液相芯片檢測體系中進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示。特異性結(jié)果表明建立的液相芯片方法能特異性檢出Y HV、TSV、WSSV，其他陽性對照均為陰性。

圖4 液相芯片檢測體系特異性結(jié)果Fig.4 The specificity test of liquichip for YHV, TSV and WSSV

盡管目前RT-PCR是檢測TSV和Y HV的國標(biāo)用方法，但其難以檢出蝦在慢性感染期所攜帶的低拷貝的病毒[10]，液相芯片方法可以避免常規(guī)RT-PCR凝膠電泳中EB對環(huán)境造成的不良影響，而且液相芯片在高通量方面有無法取代的優(yōu)勢，并且能夠同時(shí)對片段大小相近的樣品進(jìn)行快速檢測。同時(shí)本研究從樣品處理到出結(jié)果僅需2.5 h，由于液相芯片的反應(yīng)體系更加接近生物反應(yīng)體系，同時(shí)又設(shè)計(jì)選用了具有高特異性地引物探針，使得該方法的特異性和特異性高于傳統(tǒng)的檢測方法。

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PRELIMINARY DEVELOPMENT OF LIQUICHIP DETECTION TECHNIQUE FOR YELLOW HEAD VIRUS, TAURA SYNDROME VIRUS AND WHITE SPOT SYNDROME VIRUS

WANG Zheng1, JIANG Jing2, ZHANG Lei-ping2, WANG Yan2
(1. Agricultural Product Safety Testing Center of Shanghi Pudong New District, Shanghai 201202, China; 2. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine, Shanghai 200135, China)

A liquichip technique for detection of Yellow head virus(YHV), Taura syndrome virus(TSV) and White spot syndrome(WSSV) was developed in the present study by using Luminex 200 to catch fluorescence signal. In this method, specific primers and their corresponding oligonucleotide probes were designed, synthesized and modified. Then individual YHV, TSV and WSSV probes were labeled with biotin and coupled with fluorescence-coded microspheres. The results showed that this method displayed good specificity to YHV, TSV and WSSV and no reaction to other shrimp viruses. The sensitivity test indicated the detection limit for YHV, TSV and WSSV reached to 401.5、251.5 and 75.2 copies. A liquichip technique was preliminarily developed for detection of YHV, TSV and WSSV.

TSV; YHV; WSSV; Luminex

S852.659.1

B

1674-6422（2017）02-0077-05

2016-09-01

上海檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（HK006-2011）

王政，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

王艷，E-mail: wang_yan@shciq.gov.cn