張耀丹，汪 偉，李繼紅，劉開(kāi)春，孟春春，孫英杰，譚 磊，宋翠萍，廖 瑛，仇旭升，丁 鏟

·研究論文·

雞源ADAR2基因克隆及其抗新城疫病毒作用研究

張耀丹，汪 偉，李繼紅，劉開(kāi)春，孟春春，孫英杰，譚 磊，宋翠萍，廖 瑛，仇旭升，丁 鏟

目前對(duì)家禽中雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶（adenosine deaminase acting on double-stranded RNA, ADAR）的種類、組織分布及其功能尚不明了。本研究中以刀豆素、poly I:C以及新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）作為刺激物誘導(dǎo)雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF）中ADARs基因上調(diào)，擴(kuò)增獲得雞ADAR2基因的mRNA。為了鑒定ADAR2的抗病毒作用，本研究構(gòu)建了能夠偶聯(lián)有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的ADAR2重組真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，結(jié)果顯示在過(guò)量表達(dá)ADAR2的細(xì)胞中，NDV的增殖受到了顯著抑制，表明ADAR2在NDV感染過(guò)程中發(fā)揮重要的抗病毒作用，這為進(jìn)一步研究雞RNA編輯酶對(duì)NDV RNA編輯奠定了基礎(chǔ)。

雞雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶基因；新城疫病毒；RNA編輯；抗病毒作用

雙鏈R NA特異性腺昔脫氨酶（adenosine deaminase acting on double-stranded RNA，ADAR）基因家族廣泛存在于從線蟲(chóng)到人的各種生物細(xì)胞中，因其所編碼的RNA編輯酶可作用于特定雙鏈RNA結(jié)構(gòu)和mRNA前體，引起腺苷發(fā)生脫氨基變成肌苷（A→I）而得名，這一現(xiàn)象被命名為“RNA編輯”，最早在20世紀(jì)90年代初由Sommer等[1]在谷氨酸受體蛋白mRNA前體上發(fā)現(xiàn)?！癛NA編輯”是一種不同于傳統(tǒng)的蛋白翻譯途徑的獨(dú)特的基因組的轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中通過(guò)RNA編輯酶可以對(duì)RNA進(jìn)行加工，如插入、刪除或取代一些核苷酸殘基，產(chǎn)生不同于模板DNA的RNA，編碼蛋白的同功異構(gòu)體，從而大幅度增加編碼蛋白質(zhì)的多樣性。目前，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)4個(gè)ADARs成員[2]：ADAR1、ADAR2、ADAR3及TENR（testis-expressed RNA-binding protein），其中ADAR1、2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)；ADAR3催化活性不高，僅存在于腦部；TENR主要在睪丸內(nèi)表達(dá)[3]。

RNA編輯酶是一種重要的病毒限制因子，能夠有效地阻斷病毒的感染[4]。在人類免疫缺陷病毒（HIV）的研究中，細(xì)胞APOBEC（apolipoprotein B mRNA-editing,catalytic polypeptide）類的RNA編輯酶可以誘發(fā)負(fù)鏈RNA發(fā)生胞嘧啶（C）→尿嘧啶（U）突變，導(dǎo)致病毒基因組翻譯受阻，蛋白編碼功能喪失或降低，從而在病毒復(fù)制的第一階段就起到阻止病毒復(fù)制的作用[5]。最新報(bào)道指出，ADAR類的RNA編輯酶也可以誘導(dǎo)流感病毒和哺乳動(dòng)物副黏病毒RNA的突變，發(fā)揮抗病毒作用[6]。盡管如此，禽類上是否存在RNA編輯酶，存在對(duì)宿主或病毒RNA的編輯作用尚未有相關(guān)報(bào)道。為了鑒定雞ADAR類RNA編輯酶的存在及其機(jī)體內(nèi)的分布，本研究在新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）感染以及干擾素刺激藥物處理的原代雞胚成纖維細(xì)胞（chicken embryo fibroblast，CEF）中提取ADAR基因的mRNA，并對(duì)其組織分布和抗病毒作用開(kāi)展了初步研究。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞株與病毒等 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠及雞成纖維細(xì)胞細(xì)胞系（DF1）購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心ATCC；NDV毒株為Herts/33及La Sota購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Tirzol Reagents購(gòu)自Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；MLV Reverse Transcriptase和RNasin購(gòu)自Promega公司；顯影液定影液試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；限制性內(nèi)切酶、dNTP、LA Taq購(gòu)自TaKaRa公司；PCR Mix購(gòu)自東盛生物公司；抗生素、瓊脂粉、瓊脂糖購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；紅色熒光標(biāo)簽的山羊抗小鼠熒光二抗及Con-A購(gòu)自SIGMA公司；Poly （I:C）（HMW）購(gòu)自Invivogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI所預(yù)測(cè)的雞ADAR2序列（序列號(hào)：NM_001111074），設(shè)計(jì)并合成ADAR2全長(zhǎng)的特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)約2020 bp。以質(zhì)粒pCMV-HA為模板，上下游引物P1、P2中分別引入EcoR I和Sal I的酶切位點(diǎn)（下劃線）及保護(hù)性堿基，由上海生工合成。HA-ADAR2-EcoR I-UP（上游引物）：5'-GAAAGAATTCACATGGA CAACGTTCCCCCCAAGGATG-3'；HA-ADAR2-Sal I-DOWN（下游引物）：5'-GCAGGTCGACAA TTAGACAGTGAGTGAAAACTGATCCTGTTC-3' 1.2.2 ADAR 2基因擴(kuò)增 取10日齡的 SPF 雞胚，采用消化法制備 CEF 細(xì)胞。Trizol法收集的正常細(xì)胞和 L a Sota感染的細(xì)胞，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以CEF cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30s，55℃退火30 s；72℃延伸2 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 ADAR 2真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收后，用EcoR I和Sal I雙酶切，緩沖液使用通用BufferH；酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與同樣用EcoR I和Sal I雙酶切的pCMV-HA于4℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB（Amp+）固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12~16 h。挑選陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR及EcoR I和Sal I限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定后，將含正確插入片段的重組質(zhì)粒命名為pCMVHA-ADAR2，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序測(cè)定。pCMV-HA-ADAR2質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，與p EGFP-C3連接，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pEGFP-C3-ADAR2。

1.2.4 序列對(duì)比和遺傳進(jìn)化分析 通過(guò)DNA STARMegAlign軟件將雞ADAR2 ORF序列和其他幾種動(dòng)物（包括人、斑馬魚(yú)、綠頭鴨等）序列進(jìn)行比對(duì)，并繪制進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 ADAR 2 R eal-time PCR檢測(cè)方法的建立及分析 根據(jù)A DA R2ORF序列設(shè)計(jì)幾對(duì)RT-qPCR的引物A D A R 2-Q-U P（上游引物）：5'AGTCAGCCCTGGCATCTTTGTT3'；ADAR2-QDOWN（下游引物）：5'CACTGAATTTATCTA CAACCAA3'。取高純度的pEGFP-C3-ADAR2質(zhì)粒（濃度508.7 ng/μ L）作為標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水做6個(gè)稀釋度，分別為：103、104、105、106、107、108copies/μ L。Real-time PCR用SY BR Green I染料法進(jìn)行測(cè)定。20μ L的反應(yīng)體系：SY BR Green qPCR Master Mix 10μ L、上下游引物各1μ L、模板1μ L、蒸餾水8μ L。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1 min：95℃變性15 s；60℃退火15 s 72 ℃45 s，40個(gè)循環(huán)；生成溶解曲線步驟：55℃30 s，每30 s升溫0.5℃，81個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)將自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。

1.2.6 NDV感染CEF對(duì)內(nèi)源性ADAR 2表達(dá)的影響 將CEF細(xì)胞鋪滿6孔板，一組用3 MOI La Sota和Herts/33感染，37℃孵育30 min后換維持液，并在6 h和12 h時(shí)加入Trizol并收集樣品。另外一組CEF用ConA和PolyI:C（HMW）刺激物處理，終濃度均為10μ g/ mL，37℃恒溫培養(yǎng)1 h，用含2%FBS的DMEM維持培養(yǎng)，分別在6 h和12 h之后收樣。細(xì)胞樣品提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后，采用RT-qPCR的方法檢測(cè)ADAR2的含量。試驗(yàn)結(jié)果采用相對(duì)比較Ct法（Qr＝2-△△Ct）分析，△△Ct=（Ct目的基因-Ct參照基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct參照基因）對(duì)照組，計(jì)算出相對(duì)含量。

1.2.7 ADAR 2多克隆抗體的制備

1.2.7.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 pCMV-HA-ADAR2質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切，與酶切之后的pET-28a質(zhì)粒4℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，LB（Kan+）固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12~16 h。挑菌，提質(zhì)粒，將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET-28a-ADAR2。

1.2.7.2 ADAR2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及抗原制備 將pET-28a-ADAR2轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，使用終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的蛋白用WB鑒定并大量誘導(dǎo)表達(dá)。SDA-PAGE確定其在包涵體內(nèi)表達(dá)，用8 mol/L尿素溶解包涵體后純化蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，分裝保存。

1.2.7.3 多克隆抗體的制備 取適量純化的包涵體每2周免疫1次小鼠。三免之后，摘眼球采血制備ADAR2多抗血清。

1.2.8 重組蛋白pEGFP-C3-ADAR 2的Western blot鑒定及細(xì)胞亞定位 收集轉(zhuǎn)染pEGFP-C3和pEGFP-C3-ADAR2的細(xì)胞加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min。SDS-PAGE電泳之后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維（NC）膜上，以5 %脫脂乳4℃封閉過(guò)夜。根據(jù)目的蛋白大小將NC膜分開(kāi)，并用GFP商品化兔抗作為一抗，山羊抗兔 IgG-HRP為二抗，采用ECL增強(qiáng)顯色試劑盒進(jìn)行顯影檢測(cè)。

為確定ADAR2的細(xì)胞亞定位，檢測(cè)了轉(zhuǎn)染pEGFP-C3和pEGFP-C3-ADAR2的DF1細(xì)胞間接免疫反應(yīng)。培養(yǎng)36 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的熒光表達(dá)情況。所用一抗為上述制備的ADAR2鼠抗，二抗為紅色熒光標(biāo)簽的山羊抗小鼠熒光二抗，室溫染DAPI 5 min后洗凈封片。

1.2.9 外源性ADAR 2轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)NDV復(fù)制的影響

為了驗(yàn)證ADAR2能否在DF1中引發(fā)抗NDV效應(yīng)，我們使用高純度去內(nèi)毒素的EGFP-C3-A DA R2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染D F 1細(xì)胞，48 h后感染N D V毒株Herts/33，劑量為5 MOI。分別在6 h和12 h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，采用T rizol提取法提取R NA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物參照文獻(xiàn)[7]，Pla-rt13：5'-CAACAATAGGAGTGGAGTGTCTGA-3'；Plart14：5'-CAGGGTATCGGTGATGTCTTCT-3'。通過(guò)RT-qPCR的方法檢測(cè)樣品，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y= -3.2901x + 38.922（y指循環(huán)數(shù)Ct，x指拷貝值以10為底的對(duì)數(shù)值）

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增 電泳結(jié)果顯示，正常CEF細(xì)胞樣品PCR擴(kuò)增后未見(jiàn)有明顯目的條帶，而La Sota刺激的CEF細(xì)胞樣品PCR擴(kuò)增后電泳，可見(jiàn)一條較亮的約2100 bp的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1），并且測(cè)序結(jié)果與目的序列一致。

圖1 雞ADAR2基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR-amplified ADAR2 gene from CEF cDNAM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: La Sota株作用的CEF細(xì)胞; 2: 正常的CEF細(xì)胞M: DNA Marker(DL2000); 1: PCR products of CEF infected with La Sota strain; 2: PCR products of CEF as control

2.2 ADAR2基因序列分析 通過(guò)DNAStar-MegAlign軟件將雞ADAR2序列與其他幾種動(dòng)物序列進(jìn)行同源性比對(duì)。雞ADAR2與人、鼠、河豚魚(yú)、斑馬魚(yú)和槍烏賊ADAR2核苷酸序列同源性分別為78.3%、76.3%、71.9%、70.2%和62.0%；氨基酸序列同源性分別是83.9%、82.9%、81.0%、76.2%和62.2%。各物種ADAR2的基因序列的遺傳進(jìn)化關(guān)系如圖2所示。通過(guò)對(duì)氨基酸序列的生物信息學(xué)分析，雞ADAR2蛋白存在兩段雙鏈RNA結(jié)合區(qū)，分別位于第80~142位和第237~298位，與其他物種的差異較小，而介導(dǎo)腺苷脫氨基的活性功能區(qū)位于323~698位（圖3、圖4）。用于本次實(shí)驗(yàn)分析的其他動(dòng)物ADAR2的GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1。

2.3 ADAR2-Q-PCR的引物優(yōu)化 標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔點(diǎn)曲線等有熒光定量機(jī)器自動(dòng)生成，結(jié)果見(jiàn)圖5；質(zhì)粒pEGFP-C3-ADAR2的濃度換算成拷貝值（質(zhì)粒濃度×6.022×1023）（質(zhì)粒總堿基數(shù)×109×660）。線性回歸方程y=-3.283x+38.032（R2=0.993），擴(kuò)增效率為101.6%。

2.4 NDV刺激CEF上調(diào)表達(dá) 采用相對(duì)比較Ct法（Qr＝2-△△Ct）分析，△△Ct=(Ct目的基因-Ct參照基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct參照基因)對(duì)照組，計(jì)算出相對(duì)含量。經(jīng)RT-PCR絕對(duì)定量的方法計(jì)算可知單位正常CEF細(xì)胞中ADAR2基因的拷貝數(shù)約為0.8。3 MOI的La Sota和Herts/33感染CEF細(xì)胞6 h和12 h之后，ADAR2的含量出現(xiàn)1~3倍不等的上調(diào)，如圖6所示，可見(jiàn)ADAR2蛋白是受NDV的刺激上調(diào)表達(dá)的。另外CEF細(xì)胞在受Con-A作用6 h和12 h小時(shí)后的ADAR2表達(dá)含量均增加了5倍左右（P＜0.01）；PolyI:C（HMW）可以促使ADAR2也可以上調(diào)表達(dá)約3倍和5倍（P＜0.01）。

2.5 EGFP-C3-ADAR2重組蛋白的Western blot鑒定和亞定位 圖7可見(jiàn)清晰地ADAR2重組蛋白110 kDa大小的條帶，符合EGFP-C3-ADAR2重組蛋白的大小。推測(cè)圖中55 kDa大小的條帶是ADAR2降解的蛋白片段。間接免疫熒光結(jié)果顯示，pEGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后整個(gè)細(xì)胞區(qū)域發(fā)出綠色熒光，而在轉(zhuǎn)染EGFPC3-ADAR2的細(xì)胞中可觀察到特異性綠色熒光，并且與DAPI熒光重合（圖8）；ADAR2鼠抗的紅色熒光與EGFP-C3-ADAR2綠色熒光重疊，說(shuō)明ADAR2鼠抗具有熒光效價(jià)，更進(jìn)一步證實(shí)了ADAR2只在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。

2.6 過(guò)表達(dá)ADAR2對(duì)NDV復(fù)制的影響 根據(jù)所得Ct值絕對(duì)定量換算結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-ADAR2的細(xì)胞中NP含量明顯低于非轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組，差異均具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），實(shí)時(shí)熒光定量的結(jié)果見(jiàn)圖9，證實(shí)ADAR2過(guò)量表達(dá)可以抑制NDV的增殖。

3 討論

“RNA編輯”現(xiàn)象在宿主抗病毒免疫過(guò)程以及病毒進(jìn)化中的作用是目前RNA病毒研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，正在引起越來(lái)越多研究學(xué)者的關(guān)注[4]。哺乳動(dòng)物ADARs蛋白家族成員有ADAR1、ADAR2、ADAR3 及TENR四種，其中ADAR1、ADAR2的RNA編輯活性最強(qiáng)。家禽是否表達(dá)ADAR1和ADAR2基因，以及這兩種蛋白是否正常表達(dá)尚不明了。

據(jù)報(bào)道，ADAR1和ADAR2屬于干擾素刺激基因（ISGs）[8]，其啟動(dòng)子序列與PKR基因啟動(dòng)子的I型干擾素刺激反應(yīng)元件相同[9]。本研究嘗試以刀豆素、Poly I:C以及NDV病毒作為刺激物誘導(dǎo)CEF細(xì)胞中ADARs基因的上調(diào)，并根據(jù)雞的全基因組測(cè)序和生物信息分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了雞ADAR2基因的mRNA（未擴(kuò)增到ADAR1基因）。在此基礎(chǔ)上，我們建立了雞ADAR2的Real-time PCR檢測(cè)方法。對(duì)雞各個(gè)臟器的檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，ADAR2是健康雞體內(nèi)正常表達(dá)的一種基因，主要存在于心臟、肝臟、腎臟、肺臟、腦、胸腺、法氏囊、氣囊等組織臟器中，并且在肺臟和法氏囊中表達(dá)量最高。

表1 本研究中各動(dòng)物ADAR2序列及其登錄號(hào)Table 1 ADAR2 sequences used and their GenBank accession numbers

圖2 ADAR2基因進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2 Phylogenetic tree of ADAR2 gene

圖3 雞ADAR2氨基酸結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Amino acid structure of chicken ADAR2

圖4 雞與6個(gè)物種 ADAR2功能區(qū)序列對(duì)位排列分析Fig.4 Alignment of amino acidsequences of encoding region of ADAR2 gene between chicken and 6 other speciesa:結(jié)合區(qū)1; b:結(jié)合區(qū)2; c:催化區(qū)a: dsRBD1; b: dsRBD2; c: Deaminase domain

圖5 Real-time PCR引物的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.5 Optimization of the primers and standard curve for Real-time PCRA: 標(biāo)準(zhǔn)曲線; B: 熔點(diǎn)峰A: Standard curve; B: Melt peak

圖6 NDV和藥物作用刺激ADAR2上調(diào)表達(dá)Fig.6 Higher expression of ADAR2 in response to NDV and pharmacological stimuli

圖7 Western blot鑒定EGFP-C3-ADAR2蛋白的表達(dá)Fig.7 Western blot analysis of EGFPC3-ADAR2 proteinM: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: DF1細(xì)胞對(duì)照; 2: pEGFP-C3-ADAR2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞M: Protein Marker; 1: DF1 cell control ; 2: Transient expression of pEGFP-C3-ADAR2

圖8 間接免疫熒光檢測(cè)ADAR2基因在Hela細(xì)胞中的表達(dá)Fig.8 Expresssion of ADAR2 gene in Hela cells detected by the indirect immunoflurescenceA1~A4: 轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的Hela; B1~B4: 轉(zhuǎn)染pEGFP-C3-ADAR2的HelaA1~A4: Hela transfected with pEGFP-C3; B1~B4: Hela transfected with pEGFP-C3-ADAR2

圖9 DF1細(xì)胞感染NDV的NP含量的比較Fig.9 Qualification of NP in DF1 cells infected with NDV

通過(guò)序列比對(duì)分析，雞源與人源、鼠源ADAR2的氨基酸同源性較高，達(dá)到83.9%，尤其3個(gè)主要的功能區(qū)，即2個(gè)RNA結(jié)合區(qū)位和1個(gè)腺苷脫氨基活性功能區(qū)，僅存在極少的氨基酸差異，由此可以初步推斷，雞源ADAR2具有與人源ADAR2類似的RNA編輯功能。

有報(bào)道指出，ADARs的RNA編輯活性對(duì)不同病毒的感染存在兩種截然相反的效果，既可能是促進(jìn)病毒增殖的作用，也可能存在抑制病毒增殖。在丁型肝炎病毒（Hepatitis D virus，HDV）的研究中，ADAR1和ADAR2同樣顯示出了顯著的抗病毒效果。在HDV復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生兩種形式的抗原：HDAg-S 和HDAg-L。前者是病毒復(fù)制所必需的，后者抑制病毒復(fù)制，但為病毒粒子包裝所必需[10]。Casey等[11]證實(shí)了后者的產(chǎn)生正是由于ADAR1編輯了HDV反向基因組amber/W處的腺苷，使其脫氨基變成肌苷，導(dǎo)致氨基酸序列中終止子變成色氨酸密碼子，并使該閱讀框延長(zhǎng)。Jayan和Casey[12]通過(guò)將ADAR1 和ADAR2轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)二者顯著增加HDV RNA的編輯，從而明顯抑制了HDV RNA的復(fù)制。而在HIV-1研究中，ADAR1和ADAR2的RNA編輯作用可以促進(jìn)病毒增殖的作用，大量表達(dá)后可以刺激病毒的釋放和病毒粒子的感染性[13]。Doria等[14]指出ADAR2的過(guò)量表達(dá)不但不會(huì)不抑制HIV-I的增殖，甚至細(xì)胞中敲除ADAR2后能夠顯著抑制病毒的增殖。

我們的研究顯示，刀豆素和PolyI:C刺激能夠引起ADAR2的顯著上調(diào)。同樣，NDV感染能夠引起ADAR2的上調(diào)，這一結(jié)果與前期的報(bào)道一致[13]。為了確定ADAR2蛋白對(duì)NDV感染的影響，我們構(gòu)建了能夠正常表達(dá)偶聯(lián)有綠色熒光蛋白的重組ADAR2蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞。根據(jù)間接免疫熒光和Western blot檢測(cè)結(jié)果，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，外源雞ADAR2-GFP重組蛋白可以大量表達(dá)，并集中在細(xì)胞核中，這與哺乳動(dòng)物ADAR2的亞細(xì)胞定位一致。在過(guò)量表達(dá)ADAR2的細(xì)胞中，NDV的生長(zhǎng)受到了顯著的抑制，這表明ADAR2在NDV感染過(guò)程中主要發(fā)揮抗病毒作用，暗示ADAR2的RNA編輯作用可能對(duì)病毒的RNA造成了損傷。Susp è ne等[6]通過(guò)3DIPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ADARs蛋白能夠引起季節(jié)性流感和麻疹病毒基因組發(fā)生A→G突變，突變成規(guī)律性，以5 ArA和5 UrA為主，這一結(jié)果證明了ADAR蛋白確實(shí)能夠引起副黏病毒基因組發(fā)生RNA編輯。因此，可以推測(cè)，在ADAR2高表達(dá)細(xì)胞中，NDV的增殖受到顯著抑制是受到了ADAR2對(duì)病毒RNA直接攻擊。

本研究首次在雞體內(nèi)鑒定了ADAR2基因的表達(dá)，證實(shí)其有抑制NDV增殖的作用，其抗病毒的作用機(jī)制則需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示。

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IDENTIFICATION OF CHICKEN ADENOSINE ACTING ON RNA (ADAR2) AND ITS ANTI-VIRAL EFFECT ON NEWCASTLE DISEASE VIRUS

ZHANG Yao-dan, WANG Wei, LI Ji-hong, LIU Kai-chun, MENG Chun-chun, SUN Ying-jie, TAN Lei, SONG Cui-ping, LIAO Ying, QIU Xu-sheng, DING Chan
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The type, tissue distribution and function of avian adenosine deaminase acting on double-stranded RNA (ADAR) have not been well characterized although recently it has been extensively studied for its roles in antiviral effect and virus evolution. In this study, ADAR2 mRNA was amplified from primary CEF cells previously stimulated with ConA, poly I:C and Newcastle disease virus (NDV). The eukaryotic plasmid expressing green fluorescent protein (GFP)-labeled ADAR2 was constructed to determine the antiviral effect of ADAR2. In the transfected DF1 cells, the GFP-labeled ADAR2 was visualized in cellular nuclei and growth of NDV was obviously inhibited, suggesting chicken ADAR2 might play a role in the anti-NDV activity. However, the detailed mechanism of ADAR2 mediated anti-NDV effect need to be carried out in the future.

ADAR2 gene; Newcastle disease virus; RNA editing；antiviral effect

S852.659.5

A

1674-6422（2017）02-0035-08

2016-11-04

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201303033）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31101822，31530074）

張耀丹，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

丁鏟，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn；仇旭升，E-mail：xsqiu1981@shvri.ac.cn

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）