朱紅玲王秋榮何華瓊
(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,湖北 十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)
·研究報告·
青藤堿對BALB/c-nu/nu裸小鼠高侵襲性人結(jié)腸癌SW 480移植瘤增殖及環(huán)氧合酶-2表達的影響*
朱紅玲1王秋榮1何華瓊2△
(1.湖北省十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,湖北 十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院,湖北 十堰 442000)
目的 觀察青藤堿對高侵襲性人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植瘤細(xì)胞周期及結(jié)腸瘤體組織中環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達的影響,研究青藤堿防治結(jié)腸癌的機制。方法 先用5只免疫功能正常的BALB/c-nu/nu裸小鼠建立高侵襲性人結(jié)腸癌瘤源,3周后取直徑約2 mm的瘤塊移植于20只免疫缺陷的BALB/c-nu/nu2裸小鼠回盲漿膜凹龕部,1周后再隨機分為結(jié)腸癌組和青藤堿組。青藤堿組按10 mL/(kg·d)灌10%青藤堿治療30 d,結(jié)腸癌組灌0.9%氯化鈉注射液對照。測量BALB/c-nu/nu裸小鼠結(jié)腸瘤體積、瘤質(zhì)量并計算腫瘤抑制率;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2、M和S期的細(xì)胞周期比例;免疫組化法檢測結(jié)腸瘤體組織COX-2的表達,RT-PCR法檢測COX-2 mRNA表達。結(jié)果 與結(jié)腸癌組比較,青藤堿組結(jié)腸瘤體積、瘤質(zhì)量及S期細(xì)胞比值明顯降低、G1、G2期細(xì)胞比值提高,腫瘤抑制率為(39.75%)(P<0.05);COX-2和COX-2 mRNA低表達(P<0.05)。結(jié)論 青藤堿可能在G1、G2和S期誘導(dǎo) SW 480細(xì)胞阻滯、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480細(xì)胞的有絲分裂,并通過下調(diào)COX-2表達而間接影響癌細(xì)胞的增殖,具有抗高侵襲性人結(jié)腸癌的作用。
青藤堿 高侵襲性人結(jié)腸癌 環(huán)氧合酶-2 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480 細(xì)胞增殖周期
【Key words】Sinomenine;Aggressive human colon cancer;Cyclooxygenase-2;Colon cancer cell line SW 480;Cell cycle
結(jié)腸癌具有惡性程度高、高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性的特點,在中醫(yī)學(xué)中屬 “腸蕈”之范疇,脾胃受損、飲食失節(jié)及濕熱壅聚成痰而搏結(jié)于腸腑是其主要病因[1-2]。在我國結(jié)腸癌發(fā)病率僅次于肝癌、肺癌、食管癌和胃癌,其病死率極高,手術(shù)切除聯(lián)合放療、化療可降低復(fù)發(fā)率、提高患者存活時間,其預(yù)后與腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。研究表明,環(huán)氧合酶(COX-2)在結(jié)腸組織中表達與結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480細(xì)胞的增殖、分化有關(guān),通過干擾結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480細(xì)胞的有絲分裂,抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖中的相關(guān)的酶(COX-2)的表達可影響腫瘤細(xì)胞的分化與增殖[4-5]。本研究主要觀察青藤堿對高侵襲性人結(jié)腸癌模型BALB/c-nu/nu裸小鼠結(jié)腸瘤體組織中COX-2表達和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480生長增殖的相關(guān)性,研究青藤堿防治結(jié)腸癌的機制,為臨床治療提供依據(jù)?,F(xiàn)報告如下。
1.1 實驗動物 實驗用BALB/c-nu/nu裸小鼠為SPF級,25只,雌性,體質(zhì)量(22±3)g,鼠齡4~5周;實驗動物生產(chǎn)許可證(SCXK(鄂)2013-0008),本實驗在湖北醫(yī)藥學(xué)院動物房標(biāo)準(zhǔn)實驗室完成 [SYXK(鄂)2013-0031]。
1.2 試劑與器材 高侵襲性人結(jié)腸癌SW 480細(xì)胞株(由十堰市太和醫(yī)院消化內(nèi)科提供,人結(jié)腸癌組織來源于2016年1月2日的1名手術(shù)患者,男性,乳頭狀管狀腺癌Ⅱ級);青藤堿(煙臺魯銀藥業(yè)有限公司,批號H01601217);水合氯醛(采購自無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司,批號160220);鼠COX-2 ELISA試劑盒用其AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 (采購自上海雙贏生物科技有限公司,批號96T/48T,160317);流式細(xì)胞儀(Epics Altra,美國貝克曼庫爾特公司)。
1.3 造模 1)高侵襲性人結(jié)腸癌模型(瘤源)制備。將十堰市太和醫(yī)院消化內(nèi)科手術(shù)時切取的新鮮人結(jié)腸癌組織標(biāo)本置于含0.1%慶大霉素生理鹽水浸泡2 min后切取淡紅色、生長良好的魚肉狀瘤組織,剪成直徑2 mm的瘤塊,然后用20號套管針將腫瘤組織分別注射移植到5只免疫功能正常的BALB/c-nu/nu裸小鼠左側(cè)背部皮下,壓迫止血。術(shù)后單籠飼養(yǎng),定時觀察移植瘤的生長情況,待瘤體直徑達到10 mm時(3周時),處死裸小鼠,取瘤組織再次按以上述方法皮下移植,經(jīng)3代傳代后就可建立穩(wěn)定的后皮下移植瘤動物模型。2)高侵襲性人結(jié)腸癌原位移植瘤模型制備。用以上高侵襲性人結(jié)腸癌模型裸小鼠為瘤源,處死瘤源動物后,取腫瘤組織,置于含0.1%慶大霉素的0.9%氯化鈉注射液中浸泡清洗2 min,再次切取魚肉狀瘤組織,剪成直徑2 mm的瘤塊備用。取20只免疫缺陷的BALB/c-nu/nu裸小鼠,用10%水合氯醛麻醉(按0.25 mL/100 g劑量麻醉)動物,待動物麻醉后,仰臥位固定,用75%酒精消毒腹部皮膚。在盲腸部位打開腹腔并尋找盲腸,小心鉗出小鼠盲腸,在盲腸末端劃破漿膜面,將備用的瘤塊塞入回盲漿膜凹龕部,然后回納盲腸入腹腔,用可吸收線分層縫合腹腔,消毒,放入鼠籠單籠飼養(yǎng)[6]。術(shù)后觀察小鼠腹部體征。
1.4 分組與給藥 原位移植瘤模型制備手術(shù)后1周,將存活BALB/c-nu/nu裸小鼠隨機分為結(jié)腸癌組和青藤堿組。治療前將青藤堿配制成10%的水溶液,治療時按《藥理學(xué)實驗》中動物給藥方法,將鼠體表面積換算成青藤堿用量 [換算后鼠用量為10 mL/(kg·d)]灌胃治療30 d,結(jié)腸癌組灌0.9%氯化鈉注射液對照。
1.5 檢測指標(biāo) 1)SW 480移植瘤細(xì)胞周期用抑瘤率檢測。參照文獻[7],在治療30 d,用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量瘤體長、短徑3次,取平均值減少誤差,然后計算腫瘤體積(腫瘤體積=ax6/2,a為腫瘤長徑,b為腫瘤短徑)。處死動物,完整地取出腫瘤組織,稱質(zhì)量,計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=[(結(jié)腸癌組平均瘤重-青藤堿組平均瘤質(zhì)量)/結(jié)腸癌組平均瘤質(zhì)量×100%]。參照文獻[8],采用美國Epics Altra流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例。2)實時定量PCR分析COX-2和COX-2 mRNA的表達。參照文獻[9],取瘤體組織50 mg,一步法提取瘤體組織總RNA,取1 μg總RNA,用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄;引物序列見表1,PCR反應(yīng)體系:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、Taq酶 (5 U/μL)0.45 μL、dNTPs(10 mmo1/L each)1 μL、含15 mmol/L Mg緩沖液5 μL,β-actin的上、下游引物各1 μL,COX-2的上、下游引物各1 μL,用滅菌水補充至50 μL。PCR反應(yīng)條件為:93℃30 s、94℃3 min、64℃30 s、71℃1 min,35個循環(huán),71℃7 min。
表1 引物序列
1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以(±s)表示,采用單因素方差分析,組間和兩樣本兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 青藤堿對結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例的影響 見表2。青藤堿組G1、G2期細(xì)胞增殖比值提高、S期降低,與結(jié)腸癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
表2 兩組結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例比較n(%)
2.2 各組瘤質(zhì)量、瘤體積及抑瘤率比較 見表3。青藤堿組瘤質(zhì)量和瘤體積均低于結(jié)腸癌組,腫瘤抑制率高于結(jié)腸癌組(均P<0.05)。
表3 兩組瘤質(zhì)量、瘤體積及抑瘤率比較
2.3 各組COX-2和COX-2 mRNA表達的比較 見表4。結(jié)腸癌組COX-2和COX-2 mRNA在瘤體上均高表達,青藤堿組COX-2和COX-2 mRNA均低表達,與結(jié)腸癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
表4 兩組COX-2和COX-2 mRNA表達的比較(±s)
表4 兩組COX-2和COX-2 mRNA表達的比較(±s)
組別 n COX-2(pg/μL) COX-2 mRNA結(jié)腸癌組 15 54.82±7.02 33.74±2.91青藤堿組 15 40.62±5.48*20.84±3.05*
青風(fēng)藤屬防己科植物,藥用成份青藤堿是從其根莖中提取的單體生物堿[10]。最新研究表明,該生物堿除具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用外,還對多種腫瘤細(xì)胞的分化增殖有抑制作用,可抑制肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、肺癌及前列腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的生長增殖[11]。以往研究多證實青風(fēng)藤在體外細(xì)胞培養(yǎng)中具有肯定的抗癌作用,本實驗研究發(fā)現(xiàn)其對結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植腫瘤也有一定的抑制作用。
腫瘤的生長和腫瘤細(xì)胞分化增殖與其細(xì)胞周期的紊亂有密切關(guān)系,腫瘤細(xì)胞分化和增殖有G1、G2、M和S期4個周期,任何一個環(huán)節(jié)紊亂均可引起細(xì)胞的生長、分化、凋亡失控或異常,并最終導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖,這就是腫瘤細(xì)胞無限制性增殖的原因[12]。在藥物治療時,可選擇干擾G1~S期這一細(xì)胞周期限制點來實現(xiàn)抗腫瘤目的。有研究證實青藤堿對肝癌Hep G2細(xì)胞的生長有明顯抑制作用,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞G1周期阻滯[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)青藤堿在體外細(xì)胞培養(yǎng)中具有阻滯腫瘤細(xì)胞周期的G1期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,通過這一途經(jīng)來達到抑制肺癌細(xì)胞生長的作用[14]。目前國內(nèi)對青藤堿干擾高侵襲性人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植瘤鮮有系統(tǒng)的研究報道。從本研究的結(jié)果來看,青藤堿組結(jié)腸瘤體積、瘤質(zhì)量明顯降低,腫瘤抑制率達39.75%,這說明青藤堿確有抑制高侵襲性人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植瘤生長的作用。流式細(xì)胞儀檢測顯示結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2期細(xì)胞比值提高,S期細(xì)胞比例降低,這提示青藤堿誘導(dǎo)SW 480移植瘤細(xì)胞的G1、G2和S期這一細(xì)胞周期限制點,阻滯腫瘤生長。
COX-2與腫瘤的生長和腫瘤細(xì)胞分化增殖密切相關(guān),結(jié)腸癌中COX-2高表達,這可以作為診斷結(jié)腸癌的腫瘤重要標(biāo)志物之一[15]。COX-2具有過氧化氫酶和環(huán)氧化酶活性,可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素而參與機體炎癥反應(yīng),高表達的COX-2可降解細(xì)胞外基膜和基質(zhì),促使腫瘤細(xì)胞浸潤周圍組織,增強腫瘤分化和遷移[16-17]。COX-2導(dǎo)致腫瘤分化、遷移及惡化的機制較多,如可能通過上調(diào)β-catenin蛋白表達來激活β-catenin信號通路、增加腫瘤VEGF表達來促進腫瘤遷移及惡化[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)胃癌、結(jié)腸癌COX-2高表達,這會降低介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的 E-cadherin的活性,提高腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白黏附能力而增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力[19]。在本實驗中,青藤堿組COX-2和COX-2 mRNA低表達,這提示青藤堿還可通過影響COX-2蛋白合成來抑制SW 480移植瘤細(xì)胞生長,但其具體是能過什么途經(jīng)還有待進一步的研究。
綜上所述,在高侵襲性人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植瘤結(jié)腸腫瘤組織中,S期細(xì)胞比值降低,G1、G2期細(xì)胞比值提高,且COX-2和COX-2 mRNA低表達。青藤堿可能在G1、G2和S期誘導(dǎo)SW 480細(xì)胞阻滯、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480細(xì)胞的有絲分裂,并通過下調(diào)COX-2表達而間接影響癌細(xì)胞的增殖,提示G1、G2和S期阻滯與影響COX-2表達可能是高侵襲性結(jié)腸癌治療的新靶點。
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Effect of Sinomenine on BALB/c-nu/nu Nude Mice of Highly Invasive Human Colon Cancer SW Cell Proliferation and Tumor 480 Epoxy Synthase-2 Expression
ZHU Hongling,WANG Qiurong,HE Huaqiong.Taihe Hospital,the Affiliated Hospital of Hubei Medical University,Hubei,Shiyan 442000,China.
Objective:To observe the effect of sinomenine on invasion of human colon cancer cell line SW 480 tumor cell cycle and colon tumor cyclooxygenase-2(cyclooxygenase-2,COX-2)expression and mechanism of treating colon cancer with sinomenine.Methods:5 immunocompetent BALB/c-nu/nu mice were used to establish highly invasive human colon tumor models,3 weeks later,tumor block which had a diameter of 2 mm was transplanted to 20 immunodeficient BALB/c-nu/nu nude mice ileocecal serous concave niche,1 week later,they were randomly divided into colon cancer group and sinomenine group.Sinomenine group was treated by 10 mL/(kg·d)with 10%sinomenine for 30 days(d),colon cancer group was given saline control.The measurement of BALB/ c-nu/nu nude mice colon tumor volume,tumor weight and tumor inhibition rate was calculated;the colon tumor tissue SW was detected by flow cytometry in 480 cells in the cell cycle of G1,G2,M and S phase ratio;immunohistochemistry was used to detect the expression of colon tumor tissue COX-2,COX-2 mRNA expression was detected by RT-PCR.Results:Compared with colon cancer group,sinomenine group colon tumor volume,tumor cell ratio and quality of S stage decreased,G1and G2phase cells ratio increased,tumor inhibition rate was (39.75%)(P<0.05);the expression of COX-2 and COX-2 mRNA was low(P<0.05),the differences were statistically significant.Conclusion:Sinomenine can inhibit colon cancer SW 480 cells induced by SW 480 cell block in G1,G2and S phase of mitosis,and through down-regulation of COX-2 expression,it indirectly influences the proliferation of cancer cells with high invasive human colon cancer.
R285.5
A
1004-745X(2017)04-0591-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.008
2017-01-03)
湖北省教育指導(dǎo)項目(B2016125)
△通信作者(電子郵箱:job13872797666@163.com)