朱紅玲王秋榮何華瓊

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

·研究報告·

青藤堿對BALB/c-nu/nu裸小鼠高侵襲性人結(jié)腸癌SW 480移植瘤增殖及環(huán)氧合酶-2表達的影響*

朱紅玲1王秋榮1何華瓊2△

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

目的 觀察青藤堿對高侵襲性人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植瘤細(xì)胞周期及結(jié)腸瘤體組織中環(huán)氧合酶-2（COX-2）表達的影響，研究青藤堿防治結(jié)腸癌的機制。方法 先用5只免疫功能正常的BALB／c-nu/nu裸小鼠建立高侵襲性人結(jié)腸癌瘤源，3周后取直徑約2 mm的瘤塊移植于20只免疫缺陷的BALB／c-nu/nu2裸小鼠回盲漿膜凹龕部，1周后再隨機分為結(jié)腸癌組和青藤堿組。青藤堿組按10 mL/（kg·d）灌10%青藤堿治療30 d，結(jié)腸癌組灌0.9%氯化鈉注射液對照。測量BALB／c-nu/nu裸小鼠結(jié)腸瘤體積、瘤質(zhì)量并計算腫瘤抑制率；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2、M和S期的細(xì)胞周期比例；免疫組化法檢測結(jié)腸瘤體組織COX-2的表達，RT-PCR法檢測COX-2 mRNA表達。結(jié)果 與結(jié)腸癌組比較，青藤堿組結(jié)腸瘤體積、瘤質(zhì)量及S期細(xì)胞比值明顯降低、G1、G2期細(xì)胞比值提高，腫瘤抑制率為（39.75%）（P＜0.05）；COX-2和COX-2 mRNA低表達（P＜0.05）。結(jié)論 青藤堿可能在G1、G2和S期誘導(dǎo) SW 480細(xì)胞阻滯、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480細(xì)胞的有絲分裂，并通過下調(diào)COX-2表達而間接影響癌細(xì)胞的增殖，具有抗高侵襲性人結(jié)腸癌的作用。

青藤堿 高侵襲性人結(jié)腸癌 環(huán)氧合酶-2 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480 細(xì)胞增殖周期

【Key words】Sinomenine；Aggressive human colon cancer；Cyclooxygenase-2；Colon cancer cell line SW 480；Cell cycle

結(jié)腸癌具有惡性程度高、高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性的特點，在中醫(yī)學(xué)中屬 “腸蕈”之范疇，脾胃受損、飲食失節(jié)及濕熱壅聚成痰而搏結(jié)于腸腑是其主要病因［1-2］。在我國結(jié)腸癌發(fā)病率僅次于肝癌、肺癌、食管癌和胃癌，其病死率極高，手術(shù)切除聯(lián)合放療、化療可降低復(fù)發(fā)率、提高患者存活時間，其預(yù)后與腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。研究表明，環(huán)氧合酶（COX-2）在結(jié)腸組織中表達與結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480細(xì)胞的增殖、分化有關(guān)，通過干擾結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480細(xì)胞的有絲分裂，抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖中的相關(guān)的酶（COX-2）的表達可影響腫瘤細(xì)胞的分化與增殖［4-5］。本研究主要觀察青藤堿對高侵襲性人結(jié)腸癌模型BALB／c-nu/nu裸小鼠結(jié)腸瘤體組織中COX-2表達和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480生長增殖的相關(guān)性，研究青藤堿防治結(jié)腸癌的機制，為臨床治療提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用BALB／c-nu/nu裸小鼠為SPF級，25只，雌性，體質(zhì)量（22±3）g，鼠齡4～5周；實驗動物生產(chǎn)許可證（SCXK（鄂）2013-0008），本實驗在湖北醫(yī)藥學(xué)院動物房標(biāo)準(zhǔn)實驗室完成 ［SYXK（鄂）2013-0031］。

1.2 試劑與器材 高侵襲性人結(jié)腸癌SW 480細(xì)胞株（由十堰市太和醫(yī)院消化內(nèi)科提供，人結(jié)腸癌組織來源于2016年1月2日的1名手術(shù)患者，男性，乳頭狀管狀腺癌Ⅱ級）；青藤堿（煙臺魯銀藥業(yè)有限公司，批號H01601217）；水合氯醛（采購自無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司，批號160220）；鼠COX-2 ELISA試劑盒用其AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 （采購自上海雙贏生物科技有限公司，批號96T/48T，160317）；流式細(xì)胞儀（Epics Altra，美國貝克曼庫爾特公司）。

1.3 造模 1）高侵襲性人結(jié)腸癌模型（瘤源）制備。將十堰市太和醫(yī)院消化內(nèi)科手術(shù)時切取的新鮮人結(jié)腸癌組織標(biāo)本置于含0.1%慶大霉素生理鹽水浸泡2 min后切取淡紅色、生長良好的魚肉狀瘤組織，剪成直徑2 mm的瘤塊，然后用20號套管針將腫瘤組織分別注射移植到5只免疫功能正常的BALB／c-nu/nu裸小鼠左側(cè)背部皮下，壓迫止血。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，定時觀察移植瘤的生長情況，待瘤體直徑達到10 mm時（3周時），處死裸小鼠，取瘤組織再次按以上述方法皮下移植，經(jīng)3代傳代后就可建立穩(wěn)定的后皮下移植瘤動物模型。2）高侵襲性人結(jié)腸癌原位移植瘤模型制備。用以上高侵襲性人結(jié)腸癌模型裸小鼠為瘤源，處死瘤源動物后，取腫瘤組織，置于含0.1%慶大霉素的0.9%氯化鈉注射液中浸泡清洗2 min，再次切取魚肉狀瘤組織，剪成直徑2 mm的瘤塊備用。取20只免疫缺陷的BALB／c-nu/nu裸小鼠，用10%水合氯醛麻醉（按0.25 mL/100 g劑量麻醉）動物，待動物麻醉后，仰臥位固定，用75%酒精消毒腹部皮膚。在盲腸部位打開腹腔并尋找盲腸，小心鉗出小鼠盲腸，在盲腸末端劃破漿膜面，將備用的瘤塊塞入回盲漿膜凹龕部，然后回納盲腸入腹腔，用可吸收線分層縫合腹腔，消毒，放入鼠籠單籠飼養(yǎng)［6］。術(shù)后觀察小鼠腹部體征。

1．4 分組與給藥 原位移植瘤模型制備手術(shù)后1周，將存活BALB／c-nu/nu裸小鼠隨機分為結(jié)腸癌組和青藤堿組。治療前將青藤堿配制成10%的水溶液，治療時按《藥理學(xué)實驗》中動物給藥方法，將鼠體表面積換算成青藤堿用量 ［換算后鼠用量為10 mL/（kg·d）］灌胃治療30 d，結(jié)腸癌組灌0.9%氯化鈉注射液對照。

1.5 檢測指標(biāo) 1）SW 480移植瘤細(xì)胞周期用抑瘤率檢測。參照文獻［7］，在治療30 d，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量瘤體長、短徑3次，取平均值減少誤差，然后計算腫瘤體積（腫瘤體積＝ax6／2，a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑）。處死動物，完整地取出腫瘤組織，稱質(zhì)量，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率（%）＝［（結(jié)腸癌組平均瘤重-青藤堿組平均瘤質(zhì)量）/結(jié)腸癌組平均瘤質(zhì)量×100%］。參照文獻［8］，采用美國Epics Altra流式細(xì)胞儀檢測結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例。2）實時定量PCR分析COX-2和COX-2 mRNA的表達。參照文獻［9］，取瘤體組織50 mg，一步法提取瘤體組織總RNA，取1 μg總RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄；引物序列見表1，PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、Taq酶 （5 U/μL）0.45 μL、dNTPs（10 mmo1/L each）1 μL、含15 mmol/L Mg緩沖液5 μL，β-actin的上、下游引物各1 μL，COX-2的上、下游引物各1 μL，用滅菌水補充至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：93℃30 s、94℃3 min、64℃30 s、71℃1 min，35個循環(huán)，71℃7 min。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間和兩樣本兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 青藤堿對結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例的影響 見表2。青藤堿組G1、G2期細(xì)胞增殖比值提高、S期降低，與結(jié)腸癌組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例比較n（%）

2.2 各組瘤質(zhì)量、瘤體積及抑瘤率比較 見表3。青藤堿組瘤質(zhì)量和瘤體積均低于結(jié)腸癌組，腫瘤抑制率高于結(jié)腸癌組（均P＜0.05）。

表3 兩組瘤質(zhì)量、瘤體積及抑瘤率比較

2.3 各組COX-2和COX-2 mRNA表達的比較 見表4。結(jié)腸癌組COX-2和COX-2 mRNA在瘤體上均高表達，青藤堿組COX-2和COX-2 mRNA均低表達，與結(jié)腸癌組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 兩組COX-2和COX-2 mRNA表達的比較（±s）

表4 兩組COX-2和COX-2 mRNA表達的比較（±s）

組別 n COX-2（pg/μL） COX-2 mRNA結(jié)腸癌組 15 54.82±7.02 33.74±2.91青藤堿組 15 40.62±5.48*20.84±3.05*

3 討 論

青風(fēng)藤屬防己科植物，藥用成份青藤堿是從其根莖中提取的單體生物堿［10］。最新研究表明，該生物堿除具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用外，還對多種腫瘤細(xì)胞的分化增殖有抑制作用，可抑制肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、肺癌及前列腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的生長增殖［11］。以往研究多證實青風(fēng)藤在體外細(xì)胞培養(yǎng)中具有肯定的抗癌作用，本實驗研究發(fā)現(xiàn)其對結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植腫瘤也有一定的抑制作用。

腫瘤的生長和腫瘤細(xì)胞分化增殖與其細(xì)胞周期的紊亂有密切關(guān)系，腫瘤細(xì)胞分化和增殖有G1、G2、M和S期4個周期，任何一個環(huán)節(jié)紊亂均可引起細(xì)胞的生長、分化、凋亡失控或異常，并最終導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖，這就是腫瘤細(xì)胞無限制性增殖的原因［12］。在藥物治療時，可選擇干擾G1～S期這一細(xì)胞周期限制點來實現(xiàn)抗腫瘤目的。有研究證實青藤堿對肝癌Hep G2細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞G1周期阻滯［13］。也有研究發(fā)現(xiàn)青藤堿在體外細(xì)胞培養(yǎng)中具有阻滯腫瘤細(xì)胞周期的G1期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，通過這一途經(jīng)來達到抑制肺癌細(xì)胞生長的作用［14］。目前國內(nèi)對青藤堿干擾高侵襲性人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植瘤鮮有系統(tǒng)的研究報道。從本研究的結(jié)果來看，青藤堿組結(jié)腸瘤體積、瘤質(zhì)量明顯降低，腫瘤抑制率達39.75%，這說明青藤堿確有抑制高侵襲性人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植瘤生長的作用。流式細(xì)胞儀檢測顯示結(jié)腸瘤體組織SW 480細(xì)胞在G1、G2期細(xì)胞比值提高，S期細(xì)胞比例降低，這提示青藤堿誘導(dǎo)SW 480移植瘤細(xì)胞的G1、G2和S期這一細(xì)胞周期限制點，阻滯腫瘤生長。

COX-2與腫瘤的生長和腫瘤細(xì)胞分化增殖密切相關(guān)，結(jié)腸癌中COX-2高表達，這可以作為診斷結(jié)腸癌的腫瘤重要標(biāo)志物之一［15］。COX-2具有過氧化氫酶和環(huán)氧化酶活性，可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素而參與機體炎癥反應(yīng)，高表達的COX-2可降解細(xì)胞外基膜和基質(zhì)，促使腫瘤細(xì)胞浸潤周圍組織，增強腫瘤分化和遷移［16-17］。COX-2導(dǎo)致腫瘤分化、遷移及惡化的機制較多，如可能通過上調(diào)β-catenin蛋白表達來激活β-catenin信號通路、增加腫瘤VEGF表達來促進腫瘤遷移及惡化［18］。還有研究發(fā)現(xiàn)胃癌、結(jié)腸癌COX-2高表達，這會降低介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的 E-cadherin的活性，提高腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白黏附能力而增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力［19］。在本實驗中，青藤堿組COX-2和COX-2 mRNA低表達，這提示青藤堿還可通過影響COX-2蛋白合成來抑制SW 480移植瘤細(xì)胞生長，但其具體是能過什么途經(jīng)還有待進一步的研究。

綜上所述，在高侵襲性人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480移植瘤結(jié)腸腫瘤組織中，S期細(xì)胞比值降低，G1、G2期細(xì)胞比值提高，且COX-2和COX-2 mRNA低表達。青藤堿可能在G1、G2和S期誘導(dǎo)SW 480細(xì)胞阻滯、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 480細(xì)胞的有絲分裂，并通過下調(diào)COX-2表達而間接影響癌細(xì)胞的增殖，提示G1、G2和S期阻滯與影響COX-2表達可能是高侵襲性結(jié)腸癌治療的新靶點。

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Effect of Sinomenine on BALB/c-nu/nu Nude Mice of Highly Invasive Human Colon Cancer SW Cell Proliferation and Tumor 480 Epoxy Synthase-2 Expression

ZHU Hongling，WANG Qiurong，HE Huaqiong.Taihe Hospital，the Affiliated Hospital of Hubei Medical University，Hubei，Shiyan 442000，China.

Objective：To observe the effect of sinomenine on invasion of human colon cancer cell line SW 480 tumor cell cycle and colon tumor cyclooxygenase-2（cyclooxygenase-2，COX-2）expression and mechanism of treating colon cancer with sinomenine.Methods：5 immunocompetent BALB/c-nu/nu mice were used to establish highly invasive human colon tumor models，3 weeks later，tumor block which had a diameter of 2 mm was transplanted to 20 immunodeficient BALB/c-nu/nu nude mice ileocecal serous concave niche，1 week later，they were randomly divided into colon cancer group and sinomenine group.Sinomenine group was treated by 10 mL/（kg·d）with 10%sinomenine for 30 days（d），colon cancer group was given saline control.The measurement of BALB/ c-nu/nu nude mice colon tumor volume，tumor weight and tumor inhibition rate was calculated；the colon tumor tissue SW was detected by flow cytometry in 480 cells in the cell cycle of G1，G2，M and S phase ratio；immunohistochemistry was used to detect the expression of colon tumor tissue COX-2，COX-2 mRNA expression was detected by RT-PCR.Results：Compared with colon cancer group，sinomenine group colon tumor volume，tumor cell ratio and quality of S stage decreased，G1and G2phase cells ratio increased，tumor inhibition rate was （39.75%）（P＜0.05）；the expression of COX-2 and COX-2 mRNA was low（P＜0.05），the differences were statistically significant.Conclusion：Sinomenine can inhibit colon cancer SW 480 cells induced by SW 480 cell block in G1，G2and S phase of mitosis，and through down-regulation of COX-2 expression，it indirectly influences the proliferation of cancer cells with high invasive human colon cancer.

R285.5

A

1004-745X（2017）04-0591-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.008

2017-01-03）

湖北省教育指導(dǎo)項目（B2016125）

△通信作者（電子郵箱：job13872797666@163.com）