涂偉楊越陳真黃玲沈曉黎祝新根

·論 著·

RSUME、HIF-1α小泛素化與侵襲性垂體腺瘤相關(guān)性☆

涂偉*楊越*陳真*黃玲*沈曉黎*祝新根*

目的 研究RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）增強(qiáng)小泛素化分子（small ubiquitin related modifiers，SUMO）競(jìng)爭(zhēng)性抑制泛素蛋白B（ubiquitin B，UBB）對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子1α （hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）的降解作用與侵襲性垂體腺瘤的相關(guān)性。方法 采用免疫組化、qPCR檢測(cè)38例非侵襲性垂體腺瘤、38例侵襲性垂體腺瘤以及10例正常垂體包膜中RSUME、SUMO-1、UBB、HIF-1α在蛋白質(zhì)和mRNA兩個(gè)水平上的表達(dá)，并進(jìn)行比較，并采用western blot檢測(cè)HIF-1α及其小泛素化及泛素化情況，并分析不同類型垂體腺瘤中HIF-1α的SUMO-1表達(dá)的差異。結(jié)果 侵襲性垂體腺瘤中RSUME、HIF-1α的mRNA以及HIF-1α的SUMO化水平明顯高于非侵襲性垂體腺瘤及正常垂體組織（P＜0.01）；非侵襲垂體腺瘤中RSUME、HIF-1α的mRNA以及HIF-1α的SUMO化水平均高于正常垂體組織（P＜0.01），而侵襲性垂體腺瘤中HIF-1α的泛素化明顯低于非侵襲性垂體腺瘤及正常垂體組織（P＜0.01），非侵襲垂體腺瘤中HIF-1α的泛素化低于正常垂體組織（P＜0.01）。不同類型的垂體腺瘤中HIF-1α的SUMO化的表達(dá)沒有明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 RSUME可能通過增強(qiáng)HIF-1α的SUMO化的作用競(jìng)爭(zhēng)性抑制泛素化與垂體腺瘤血管的新生及腫瘤的侵襲相關(guān)。

RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子 小泛素化分子 缺氧誘導(dǎo)因子 侵襲性垂體腺瘤

垂體腺瘤可分為功能型垂體腺瘤及無功能型垂體腺瘤，部分垂體腺瘤可向周圍組織結(jié)構(gòu)侵襲被定義為侵襲性垂體腺瘤，侵襲性垂體腺瘤是介于非侵襲性垂體腺瘤及垂體癌之間的過渡型，侵襲型垂體腺瘤具有較高的浸潤(rùn)性及復(fù)發(fā)率。目前已知侵襲性垂體腺瘤的發(fā)生與血管新生密切相關(guān)。泛素化可促進(jìn)腫瘤侵襲因子如缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α）的降解，但RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME）可通過增強(qiáng)小泛素化分子 1 （small ubiquitin related modifiers，SUMO）的表達(dá)競(jìng)爭(zhēng)性抑制泛素化蛋白B（ubiquitin B，UBB）對(duì)HIF-1α的降解作用，促進(jìn)腫瘤血管新生，然而其侵襲的分子學(xué)機(jī)制尚不明確[1]。本研究收集了2013年1月至2014年12月垂體腺瘤標(biāo)本76例，研究RSUME、SUMO-1、UBB、HIF-1α在侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)，并探討其與垂體腺瘤侵襲的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 納入標(biāo)準(zhǔn)[2]：①既往無垂體手術(shù)史；②近期無激素服用；③無重大的基礎(chǔ)疾病史 （無心、肝及肺等重要臟器疾患，肝腎功能正常）；④MRI提示垂體腺瘤，術(shù)前激素水平、術(shù)后病理報(bào)告證實(shí)為垂體腺瘤。納入南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2013年1月至2014年 12月垂體腺瘤樣本 76例。依據(jù)侵襲性垂體腺瘤的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)合術(shù)前MRI檢查依據(jù)Hardy-Wilson分類法Ⅳ級(jí)以上或Knosp分類法Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)；②術(shù)中見垂體腺瘤侵襲周圍組織結(jié)構(gòu)；③術(shù)后HE染色符合侵襲性垂體腺瘤。其中侵襲性垂體腺瘤（侵襲組）和非侵襲性垂體腺瘤（非侵襲組）各38例，其中男32例，女44例，年齡28～70歲，平均（50±12）歲，見表1。垂體腺瘤標(biāo)本依據(jù)Hardy-Wilson分類法及Knosp分類法分為侵襲組及非侵襲組，各標(biāo)本分為三部分，一部分甲醛固定用于免疫組化；一部分放置RNA保存液，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，行qPCR實(shí)驗(yàn)；一部分保存至-80℃冰箱行western blot檢測(cè)。對(duì)照組：垂體囊腫切除術(shù)得到的正常垂體包膜10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往無垂體（鞍區(qū)）手術(shù)史；②近期無激素服用；③無重大的基礎(chǔ)疾病史（無心、肝及肺等重要臟器疾患，肝腎功能正常；④MRI檢查提示為垂體囊腫。

1.2 熒光定量PCR檢測(cè)RSUME、HIF-1α基因表達(dá)水平 取適量新鮮垂體腺瘤組織與1mL總RNA抽提試劑用組織均漿器混勻，并按步驟加入氯仿、異丙醇、無水乙醇提取總RNA；按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；配制PCR反應(yīng)液：2μL cDNA，上下游引物各1μL（引物：選擇表達(dá)穩(wěn)定的腦膜瘤β-actin作參照物，引物由上海生物工程公司合成。RSUME上游引物：5＇-TACCTGGTATCTCGATTAACTCTGAAC-3＇，下游引物：5＇-TCAGTATTATTTTACCCATGAACATCA-3＇，擴(kuò)增片段 348 bp；HIF-1α上游引物：5＇-CATAGAACAGACAGAAAAATCTCATCC-3＇，下游引物：5＇-TTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGTAAT-3＇，擴(kuò)增片段450 bp；β-actin上游引物：5＇-ACGGGGTCACCCACACTGTGC-3＇，下游引物：5＇-CTAGAAG CATTTGCGGTGGACGAT G-3＇，擴(kuò)增片段659 bp）。SYBR○Premix Ex TaqTMⅡ10μL，添加去離子水使總體積達(dá)到20 μL。進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)：第一步，95℃預(yù)變性30 s；第二步，95℃5 s，60℃30 s循環(huán)40次。根據(jù)公式 ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin和ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對(duì)照組統(tǒng)計(jì)結(jié)果，結(jié)果以 2-ΔΔCt表示，相對(duì)表達(dá)值為1。

1.3 免疫組化 取甲醛固定的垂體腺瘤組織，石蠟包埋，3%H2O2阻斷過氧化物酶活性10min，PBS沖洗3次，5%胎牛血清孵育20min，分別加入兔抗人SUMO-1（Anbo Biotechnology Company）、HIF-1α抗體4℃過夜孵化，PBS再次沖洗3次；加入生物素?；?，孵育2h，PBS沖洗3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記生物素孵育2h，DAB顯色。陰性對(duì)照組（一抗處加入PBS）。封片拍照后采用美國(guó)Media Cybernetic公司設(shè)計(jì)的Image-Pro-Plus 6.0圖像分析軟件，測(cè)5個(gè)視野的積分吸光度（integral optical density，IOD）值及圖片去除空白的面積，兩者相比即可得出該圖片的平均IOD值，以此作為免疫反應(yīng)強(qiáng)度指標(biāo)。

半定量分析，其結(jié)果均由副教授以上專業(yè)人士判定。表達(dá)判定方法：隨機(jī)選擇4個(gè)高倍視野（×400倍），根據(jù)染色細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，將染色結(jié)果分為陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性。評(píng)分方法：①根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分，陰性0分，弱陽(yáng)性1分，陽(yáng)性2分，強(qiáng)陽(yáng)性3分；②根據(jù)染色細(xì)胞數(shù)評(píng)分[3]，陰性表達(dá)0分，染色細(xì)胞數(shù)＜10%計(jì)1分，10%~50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分。根據(jù)染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的乘積：0~2分（-），3~4分（+），5~7（++），8~9（+++）。

1.4 蛋白印跡法檢測(cè)SUMO-1、UBB、HIF-1α蛋白的表達(dá)水平 取新鮮垂體腺瘤組織按照總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，利用生物分光光度計(jì)比色分析總蛋白含量。80mV電壓下在10% SDS-PAGE電泳2 h。PVDF膜在250mA下轉(zhuǎn)膜30min～80min。5%脫脂奶粉封閉液中室溫下封閉2 h或4℃過夜封閉，TBST洗膜3次。分別加入目的蛋白一抗 （兔抗人SUMO-1、UBB多克隆抗體Anbo Biotechnology Company；兔抗人HIF-1α多克隆抗體 cell signaling technology，均已 1：1000稀釋）、β-actin(1∶5000稀釋)一抗，4℃過夜孵育；洗膜3次后加入二抗(1∶5000稀釋)。依據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒操作說明進(jìn)行顯影、定影。利用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行灰度掃描和凈光密度值分析。結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參的IOD比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 垂體腺瘤中SUMO-1、HIF-1α蛋白表達(dá)及定位情況 免疫組化如圖1所示：SUMO-1蛋白非侵襲組（A）及侵襲組（B）的陽(yáng)性著色主要定位分布于垂體腺瘤細(xì)胞胞漿中。HIF-1α蛋白非侵襲組（C）及侵襲組（D）的陽(yáng)性著色主要定位分布于垂體腺瘤細(xì)胞胞漿或（和）細(xì)胞核中。侵襲性垂體腺瘤中SUMO-1較非侵襲性垂體腺瘤明顯增多（表2，χ2=13.689，P=0.034），并且侵襲性垂體腺瘤中HIF-1α表達(dá)較非侵襲性垂體腺瘤明顯增多 （表2，χ2=14.678，P=0.023）。

圖1 不同級(jí)別垂體腺瘤組織中SUMO-1、HIF-1α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)。A：非侵襲性垂體腺瘤SUMO-1染色；B：侵襲性垂體腺瘤SUMO-1染色；C：非侵襲性垂體腺瘤HIF-1α染色；D：侵襲性垂體腺瘤HIF-1α染色

表1 垂體腺瘤與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2 垂體腺瘤中RSUME、HIF-1α基因表達(dá)水平

qPCR檢測(cè) RSUME、HIF-1α的 mRNA水平，RSUME、HIF-1α在侵襲性垂體腺瘤中mRNA表達(dá)明顯增加（表3，F(xiàn)=145.605，F(xiàn)=597.222，P＜0.01）。

2.3 垂體腺瘤中SUMO-HIF-1α、UBB-HIF-1α蛋白的表達(dá)水平Western blot檢測(cè)正常組、非侵襲組及侵襲組的蛋白表達(dá)水平，與正常組及非侵襲組相比，侵襲性組中SUMO-HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增加（圖2，表3，F(xiàn)=33.835，P＜0.01），而侵襲性垂體腺瘤中UBB-HIF-1α蛋白明顯低于非侵襲性垂體腺瘤及正常垂體組織 （表3，F(xiàn)=32.470，P＜0.01）。

2.4 垂體腺瘤中SUMO-HIF-1α蛋白的表達(dá)水平

依據(jù)患者垂體腺瘤的類型分類，根據(jù)單因素方差分析示各組之間SUMO-HIF-1α蛋白的表達(dá)存在差異性（圖3，表4，F(xiàn)=3.319，P=0.011）。通過SNK組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素型垂體腺瘤組、泌乳素型垂體腺瘤組、促腎上腺皮質(zhì)激素型垂體腺瘤組、甲狀腺激素型垂體腺瘤組以及無功能型垂體腺瘤組之間的SUMO-HIF-1α的表達(dá)水平均無明顯差異性（P＞0.05），但其SUMO-HIF-1α的蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組（表4，P＜0.01）。

3 討論

KIM等[4]研究表明，HIF-1的高表達(dá)影響侵襲性垂體腺瘤的生長(zhǎng)。低氧條件下HIF-1為廣泛存在于人體中的一種二聚體轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亞基組成[3]，其功能的發(fā)揮主要依賴HIF-1α的作用。HIF-1α參與人體的生長(zhǎng)、發(fā)育以及一些病理反應(yīng)，為腫瘤代謝、血管新生及轉(zhuǎn)移的重要因子。血管新生為侵襲性垂體腺瘤生長(zhǎng)的主要因素，血管新生依賴血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的作用，而HIF-1為VEGF的上游因子。常氧環(huán)境下HIF-1α蛋白很快會(huì)被降解，但由于腫瘤生長(zhǎng)旺盛，常處于缺氧狀態(tài)，因此垂體腺瘤中HIF-1α具有較高表達(dá)，并且HIF-1α可隨著垂體腺瘤侵襲性的增加而表達(dá)增強(qiáng) （圖1，表2，χ2=14.678，P= 0.023）。通過腫瘤不斷的生長(zhǎng)及血管的新生，正常供血難已維持腫瘤生長(zhǎng)的需求，此時(shí)腫瘤會(huì)誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，以代償腫瘤的缺氧狀態(tài)。同時(shí)HIF-1α也可通過調(diào)控下游靶基因VEGF進(jìn)一步促進(jìn)血管新生，增強(qiáng)腫瘤侵襲性。本研究證實(shí)：侵襲性垂體腺瘤中HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)均高于非侵襲性垂體腺瘤及正常垂體組織（圖1，P= 0.02，表3，F(xiàn)=597.22，P＜0.01）,提示HIF-1α可能與垂體腺瘤的侵襲性相關(guān)。然而泛素化-蛋白酶體的泛素化作用可迅速將 HIF-1α降解[5]，因此HIF-1α與垂體腺瘤侵襲作用的機(jī)制并不完全，HIF-1α的作用需要RSUME介導(dǎo)的SUMO化的修飾競(jìng)爭(zhēng)型抑制泛素化[6]。

表2 SUMO-1、HIF-1α免疫組織化學(xué)半定量分析結(jié)果

表3 SUMO-HIF-1α、UBB-HIF-1α的蛋白水平以及RSUME、HIF-1α的mRNA表達(dá)水平

泛素分子（UBB）具有標(biāo)記靶蛋白，誘導(dǎo)靶蛋白降解的作用，常氧狀態(tài)下HIF-1α?xí)黄錁?biāo)記，并迅速降解。SUMO分子與UBB具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)，卻具有相反的作用，且兩者之間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制。SUMO擁有三種蛋白亞型，其主要作用亞型為SUMO-1[7]，SUMO-1可競(jìng)爭(zhēng)性抑制泛素化阻斷蛋白質(zhì)的泛素化-蛋白酶體降解途徑，增加HIF-1α的穩(wěn)定性，SUMO化的作用首先需要SUMO-1分子被泛素活化酶E1激活，形成成熟的SUMO-1蛋白，然后與泛素結(jié)合酶E2（Ubc9）結(jié)合，最后用泛素連接酶E3與靶蛋白結(jié)合增強(qiáng)底物蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及活性[8]。本研究證實(shí)在HIF-1α泛素化位點(diǎn)的修飾中，隨著SUMO分子表達(dá)的增強(qiáng)，UBB分子的表達(dá)也相應(yīng)下降（圖2，表3，F(xiàn)=32.470，P＜0.01）。這可能與HIF-1α序列中的泛素化位點(diǎn)Lys391和Lys477的SUMO化競(jìng)爭(zhēng)性抑制泛素化并阻斷蛋白質(zhì)的泛素化-蛋白酶體降解途徑相關(guān)[9-10]。

圖2 垂體腺瘤組織中SUMO-HIF-1α、UBB-HIF-1α的蛋白表達(dá)。I：對(duì)照組;II：非侵襲組;III：侵襲組

RWD結(jié)構(gòu)蛋白由RSUME編碼的195個(gè)氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)與泛素結(jié)合酶 E2（Ubc9）相似[11]。人體較多組織中均可檢測(cè)到RSUME的表達(dá)，特別是在垂體組織中具有較高的表達(dá)；CARBIANAGASHIMA等[6]學(xué)者認(rèn)為RSUME被證實(shí)具有促進(jìn)腫瘤侵襲的能力，其作用機(jī)制可能是由RSUME通過SUMO化促進(jìn)腫瘤血管新生[12-13]，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲。SUMO化的作用需要泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2以及泛素連接酶E3共同作用[14]。人體中缺少泛素結(jié)合酶E2，RSUME可編碼RWD結(jié)構(gòu)蛋白，通過替代E2酶的作用，促進(jìn)HIF-1α 的SUMO化，從而在侵襲性垂體腺瘤的增殖以及血管新生發(fā)揮重要作用[15-17]。本研究證實(shí)在侵襲性垂體腺瘤中的SUMO-1以及RSUME的表達(dá)均高于非侵襲性垂體腺瘤及正常垂體組織（圖1，P= 0.009，表 3，F(xiàn)=145.61，P＜0.05）。LI[5]等學(xué)者認(rèn)為SUMO化作用于HIF-1α轉(zhuǎn)錄后的水平，與mRNA的表達(dá)并不相關(guān)；但FOWKES[12]等學(xué)者認(rèn)為隨著垂體腺瘤侵襲性的增強(qiáng)，RSUME及HIF-1α的mRNA水平也會(huì)增加，本研究的結(jié)果與FOWKES等的研究結(jié)果一致,提示RSUME有可能通過增強(qiáng)HIF-1α的SUMO化的作用促進(jìn)垂體腺瘤的侵襲性，HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)可為侵襲性垂體腺瘤的生長(zhǎng)、侵襲提供更好條件。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明RSUME相關(guān)的SUMO-1的表達(dá)可能促進(jìn)垂體腺瘤的發(fā)生（表4，F(xiàn)=3.319，P=0.011），但與垂體腺瘤發(fā)生的類型無明顯關(guān)系。

RSUME作為侵襲性垂體腺瘤發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的基因，其能通過增強(qiáng)人體垂體腺瘤中HIF-1α的SUMO化作用，促進(jìn)垂體腺瘤血管新生及腫瘤侵襲，RSUME作為侵襲性垂體腺瘤研究的一個(gè)新的靶點(diǎn)，對(duì)其更加深入的研究，將給侵襲性垂體腺瘤的防治研究提供一個(gè)新的思路。

表4 SUMO-HIF-1α的蛋白水平

圖3 不同類型垂體腺瘤組織中SUMO-HIF-1α的蛋白表達(dá)水平

[1]何偉,楊炎林,沈曉黎,等.RWD結(jié)構(gòu)小泛素化增強(qiáng)子與缺氧誘導(dǎo)因子-1α在AtT-20細(xì)胞的表達(dá)[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2015,41(6):365-369.

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The relationship between RSUME and small ubiquitin related modifiers of HIF-1α with invasive pituitaryadenomas.

TU Wei,YANG Yue,CHEN Zhen,HUANG Ling,SHEN Xiaoli,ZHU Xingen.Department of Neurosurgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi province,330006,China.Tel:0791-86311396.

Objective AIM:To study whether the RWD containing sumoylation enhancer（RSUME)enhanced small ubiquitin related modifiers (SUMO)to competitively inhibit Ubiquitin B (UBB)-mediated degradation of hypoxia hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α)and the invasive pituitary adenomas.Methods The expression of protein and mRNA levels of RSUME,SUMO-1,UBB and HIF-1α were detected by using immunohistochemistry,western blot and qPCR in 38 cases of non-invasive pituitary adenoma,38 cases of invasive pituitary adenomas and 10 cases of normal pituitary capsule.The expression of SUMO-1 was analyzed in different types of pituitary adenomas.Results The protein,and mRNA levels of RSUME,SUMO-HIF-1αwere significantly higher in the invasive pituitary adenomas than in the non-invasive pituitary adenomas and normal pituitary capsule(P<0.01).The protein and mRNA levels of RSUME, SUMO-HIF-1αwas higher in non-invasive pituitary adenomas than in normal pituitary capsule(P<0.01).However,theprotein levels of UBB-HIF-1α were significantly lower in the invasive pituitary adenomas than in the non-invasive pituitary adenomas and normal pituitary capsule(P<0.01).The protein of UBB-HIF-1α were lower in non-invasive pituitary adenomas than in normal pituitary capsule(P<0.01).The expression levels of SUMO were not significantly different among different types of pituitary adenomas(P>0.05).Conclusion RSUM may increase pituitary adenomas angiogenesis and promote tumor invasion through enhancement of SUMO of HIF-1α which competitively inhibits ubiquitination of HIF-1α.

RSUME SUMO HIF-1α Invasive pituitary adenomas

R733

A

2016-11-09）

（責(zé)任編輯：甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.03.008

☆江西省自然科學(xué)基金（編號(hào)：20142BAB205032）；江西省教育廳科學(xué)基金（編號(hào)：14064）；江西省科技廳科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：20133BBG70072）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30760258）資助

* 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（南昌330006）

通信作者（E-mail:shenxldoc@126.com）