王志旺， 王永輝， 任 遠， 王瑞瓊， 藺興遙， 段海婧

(1． 甘肅中醫(yī)藥大學， 蘭州 730000； 2． 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室， 蘭州 730000； 3． 山西中醫(yī)學院， 太原 030024)

丁苯酞對豚鼠平喘作用的初步藥效學觀察*

王志旺1,2△， 王永輝3△， 任 遠1,2△， 王瑞瓊1， 藺興遙1， 段海婧1

(1． 甘肅中醫(yī)藥大學， 蘭州 730000； 2． 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室， 蘭州 730000； 3． 山西中醫(yī)學院， 太原 030024)

目的：初步探討丁苯酞對豚鼠的平喘作用及機制。方法：本次研究分為離體氣管平滑肌實驗與動物整體實驗兩部分。在離體實驗中制備豚鼠離體氣管片，使用Ach、Hist使氣管平滑肌收縮達到最大值后，按累積加藥法加入丁苯酞，記錄1、10、100 mg/L丁苯酞對痙攣氣管平滑肌的解痙作用(n=10)。在整體實驗中，取經篩選的豚鼠分為正常對照組、模型對照組、地塞米松組及丁苯酞高、低劑量組(n=8)，在吸入低濃度激發(fā)液(1%ACh:0.05%Hist=1:1)激發(fā)6次(每次10 s)的基礎上，第7次吸入高濃度激發(fā)液(2%ACh:0.1%Hist=1:1)10 s，觀測90 mg/kg、30 mg/kg丁苯酞對哮喘豚鼠行為學以及血清NO、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中ET-1的影響。結果：1、10、100 mg/L的丁苯酞對ACh、Hist引起的離體痙攣狀態(tài)的豚鼠氣管平滑肌有顯著的解痙作用(對Ach的解痙率為15.08±7.68、42.41±13.54、77.56±24.82；對Hist的解痙率為19.40±7.60、56.84±11.72、76.35±19.40)且呈一定的量效關系(P<0.05, 0.01)；在乙酰膽堿與組胺的引喘下，90 mg/kg、30 mg/kg丁苯酞能明顯延長豚鼠的哮喘潛伏期(53.3±13.2、33.1±13.0)，改善哮喘行為學，降低血清NO(78.71±19.40、84.75±20.97)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中ET-1(24.30±5.80、28.50±6.31)的含量(P<0.05, 0.01)。結論：丁苯酞具有一定的平喘作用，而緩解NO、ET-1異常升高是其作用機制之一。

丁苯酞；平喘；豚鼠；一氧化氮；內皮素-1

【DOI】 10.12047/j.cjap.5463.2017.035

中醫(yī)理論認為當歸“主咳逆上氣”并與其它中藥配伍用于臨床治療支氣管哮喘(簡稱哮喘)，在研究當歸及其揮發(fā)油平喘、防治哮喘物質基礎的過程中，我們發(fā)現當歸揮發(fā)油中的丁苯酞對豚鼠氣管平滑肌有解痙作用。丁苯酞是目前治療缺血性腦卒中的藥物之一[1]，是當歸揮發(fā)油中性質較穩(wěn)定的成分之一。本次研究以豚鼠離體氣管平滑肌、在體哮喘豚鼠為研究對象，觀察丁苯酞對豚鼠的平喘作用，同時測定血清一氧化氮(nitric oxide, NO)、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中的內皮素-1(endothelin-1, ET-1)，探討丁苯酞治療哮喘的作用及其機制?，F將實驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

丁苯肽(butylphthalide, BPL)，中國生物制品檢驗所，批號：101035-200901，用于離體實驗；苯酞軟膠囊(butylphthalide, BPL)，石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H20050299，產品批號：13040611，用于在體實驗；氨茶堿(aminophylline, APH)，上海信誼金朱藥業(yè)有限公司，國藥準字H20033430；醋酸地塞米松片(dexamethasone, DXM)，天津藥業(yè)新鄭制藥有限公司生產，批準文號：國藥準字H41021038。取丁苯酞置研缽中，加入丁苯酞一半量的吐溫-80，采用干膠法按“油∶膠∶水=2∶1∶2”的比例制備初乳，稀釋后即得100 mg/L(離體實驗)與0.9 g/L(在體實驗)丁苯酞乳劑；另取吐溫-80配制1%的空白對照液，冷藏備用。乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、磷酸組胺(histamine, Hist)，阿拉丁試劑公司，批號：40837、47835；吐溫-80，上海大眾制藥廠，批號：700934；一氧化氮(NO)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，生產批號為20130203；內皮素-1(ET-1)測試盒，上海源葉生物科技有限公司，批號為20130201A。

1.2 儀器

HB-2型二道生理記錄儀(成都儀器廠生產)，HU-1型肌張力換能器(淮北正華生物儀器設備有限公司產品)，HH-S型電熱恒溫水浴鍋(江蘇省醫(yī)療器械廠生產)，BS1103型Sartorius電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司產品)，420AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司生產)，CH Technologies鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統(tǒng)，TGL-16G高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠生產)。

1.3 動物

豚鼠，雌雄兼用，由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所提供，實驗動物質量合格證(62000600000079)。

1.4 丁苯酞對豚鼠離體氣管平滑肌的解痙作用

1.4.1 豚鼠離體氣管條的制備 參考氣管片法[2]，取體質量250～350 g豚鼠用棒擊其后腦至昏，立即刨開頸至胸部皮膚肌肉，取下從喉頭至氣管分叉處的完整氣管段，放入Krebs-Henseleit營養(yǎng)液中，剝離氣管外附組織，用營養(yǎng)液沖洗管腔內容物后將氣管從軟骨中線(胸側)縱向剪開，再沿軟骨走向均等剪成6段，將相間3段氣管沿縱刨線縫合在一起，一端固定在L型通氣小鉤上，另一端固定于換能器上。將實驗標本置于預先裝有10 ml恒溫(37±0.5℃)營養(yǎng)液的麥氏浴管中，每分鐘通氣(內含95%O2和5%CO2)約15～20個氣泡。二道生理記錄儀記錄肌張力變化，調整氣管靜息張力為1 g，待氣管平滑肌回復正常舒縮功能后開始實驗。

1.4.2 丁苯酞對ACh引起的豚鼠離體痙攣氣管平滑肌的解痙作用 首先記錄氣管平滑肌的正常收縮曲線，之后向麥氏浴管中加入5×102mg/L ACh 0.1 ml，等氣管平滑肌收縮反應達到最大值后，按累積加藥法依次加入102、103、104mg/L丁苯酞，使營養(yǎng)液中的丁苯酞終濃度分別達到1、10、100 mg/L，記錄藥物對痙攣氣管平滑肌的解痙作用。每次加藥間隔約10 min，等低濃度藥物的作用達到平衡后再加藥至高濃度，對不同氣管平滑肌重復上述操作10次(n=10)，分別以氨茶堿、空白對照液為對照進行實驗，按下式計算解痙率(%)。

1.5 丁苯酞對豚鼠哮喘行為學及NO、ET-1的影響

1.5.1 篩選、分組 參考整體動物引喘法[3,4]，將體質量120～160 g的健康豚鼠(雌雄兼用)放入吸入染毒系統(tǒng)，以2 ml/min的霧化速度使豚鼠吸入激發(fā)液(2%ACh與0.1%Hist按1∶1的比例混合)10 s，觀察豚鼠出現哮喘發(fā)作(呼吸頻率、呼吸幅度與點頭呼吸三者中至少出現1項較明顯的變化)的時間即為引喘潛伏期，超過120 s仍無反應者棄之不用。將篩選合格的豚鼠按性別體質量分層隨機分為5組(n=8)：即正常對照組(Control)、模型對照組(Model)、地塞米松組(DXM, 1 mg/kg)、丁苯酞高(BPLH, 90 mg/kg)、低劑量組(BPLL, 30 mg/kg)。

1.5.2 造模給藥、測定指標 上述各組動物按10 ml/kg灌胃給藥，其中正常對照組與模型對照組灌胃等量空白對照液，每天1次，連續(xù)7 d。給藥1 h后，按篩選動物的方法讓豚鼠吸入低濃度激發(fā)液(1%ACh與0.05%Hist按1∶1混合)10 s，其中正常對照組以生理鹽水代替激發(fā)，每天1次，連續(xù)6 d。第7天給藥1 h后，讓豚鼠吸入高濃度激發(fā)液(2%ACh與0.1%Hist按1∶1混合)10 s，其中正常對照組以生理鹽水代替，觀測從激發(fā)開始6 min內豚鼠哮喘行為學并評分：呼吸頻率與幅度正常，未出現異常情況者計0分；呼吸頻率與幅度正常，僅出現輕微點頭呼吸者計1分；呼吸頻率正常，幅度較大，點頭呼吸明顯者計2分；呼吸頻率加快，幅度加大，點頭呼吸甚至跌倒者計3分[5]。從激發(fā)到動物出現呼吸等異常情況的時間為哮喘潛伏期，超過6 min仍無任何癥狀者哮喘潛伏期按6 min計算。第7次激發(fā)24 h后，戊巴比妥麻醉，眼眶采血，離心后取血清按試劑盒說明書測定NO；脫頸椎處死動物后手術暴露氣管，提取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，離心后取上清液按試劑盒說明書測定ET-1。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 丁苯酞對Ach、Hist引起豚鼠離體痙攣氣管平滑肌的解痙作用

與正常對照組比較，1～100 mg/L濃度范圍內的丁苯酞對ACh、Hist引起的離體痙攣狀態(tài)的豚鼠氣管平滑肌有顯著的解痙作用，且其解痙作用有明顯的量效關系(P<0.01，圖1、圖2)。

Fig. 1 Antispasmodic effect of BPL on spasmodical tracheal smooth muscle of guinea pigs motivated by ACh (n=10) APH: Aminophylline; BPL: Butylphthalide; Ach: Acetylcholine*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vsmedium concentration (10 mg/L) group

2.2 丁苯酞對豚鼠引喘潛伏期及哮喘行為學的影響

在激發(fā)過程中，模型對照組豚鼠普遍出現呼吸頻率加快、幅度加大、點頭呼吸、部分跌倒甚至死亡；與正常對照組比較，引喘潛伏期和哮喘行為學有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經丁苯酞防治后，引喘潛伏期和哮喘行為學得到不同程度的緩解，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 0.01，表1、表2)。

Fig. 2 Antispasmodic effect of BPL on spasmodical tracheal smooth muscle of guinea pigs motivated by Hist (n=10) APH: Aminophylline; BPL: Butylphthalide; Hist: Histamine*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vsmedium concentration (10 mg/L) group

GroupAsthmaticincubationperiod(s)Pre-dosePost-doseExtendedtimeControl52.8±7.6360.0±0.0307.3±7.6Model54.8±8.163.5±7.0**8.8±6.5**DXM52.9±7.1127.4±25.2##74.5±20.1##BPLH52.5±8.8105.8±20.2##△△53.3±13.2##△△BPLL51.9±8.985.0±15.8##33.1±13.0##

DXM: Dexamethasone; BPLH: Butylphthalide high-dose group; BPLL: Butylphthalide low-dose group

**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vsmodel group;?△△P<0.01vsBPL low-dose group

GroupAsthmabehavior-(0)+(1)++(2)+++(3)MeanseriesRvalue95%confidenceintervalCon-trol80000.000.10±0.20Model00262.750.84±0.20**DXM05301.380.44±0.20#BPLH03501.630.52±0.20#BPLL02511.880.59±0.20

DXM: Dexamethasone; BPLH: Butylphthalide high-dose group; BPLL: Butylphthalide low-dose group

**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05vsmodel group

2.3 丁苯酞對哮喘豚鼠血清NO、BALF中ET-1的影響

經過低濃度的激發(fā)液反復刺激后，除模型對照組有1只動物死亡外，其余動物順利完成實驗。經過激發(fā)液的反復刺激，豚鼠血清NO、BALF中ET-1的水平明顯上升，與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；經丁苯酞干預后，NO與ET-1的水平下降，與模型對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05, 0.01，表3)。

GroupnNO(μmol/L)ET-1(ng/L)Con-trol859.07±17.2920.45±5.25Model7104.55±21.96**38.76±7.76**DXM868.82±18.14##25.30±6.01##BPLH878.71±19.40#24.30±5.80##BPLL884.75±20.9728.50±6.31#

BPLH: Butylphthalide high-dose group; BPLL: Butylphthalide low-dose group; NO: Nitric oxide; BALF: Bronchoalveolar lavage fluid; ET-1: Endothelin-1; DXM: Dexamethasone

**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3 討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是呼吸系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，近三十年來盡管采取包括糖皮質激素在內的綜合抗炎抗過敏治療方案，但流行病學調查發(fā)現哮喘的發(fā)病率、死亡率未隨之而降低，仍需要去尋找新的方法來防治哮喘[6]。丁苯酞(又名(正)丁基苯酞、丁基酞內酯、丁基酞內酯、丁基鄰苯甲酸內酯，Butylphthalide)是我國第三個擁有自主知識產權的化學藥物，也是世界上用于治療腦血管病的新藥，最初是楊峻山從芹菜籽中提取的左旋體，故又名芹菜甲素，現已人工合成，化學式為C12H14O2，相對分子質量190，呈黃色油狀物，有芹菜香味，目前主要用于治療腦血管疾病。當歸、川芎和藁木等中藥中均含有丁苯酞，是上述中藥揮發(fā)油中苯酞類成分之一。實驗研究顯示[7,8]，當歸、川芎及其揮發(fā)油對平滑肌、特別是氣管平滑肌有明顯的舒張作用，臨床可用于治療哮喘；本課題組前期研究顯示，當歸揮發(fā)油對氣管平滑肌具有明顯的舒張作用[9]，而在當歸揮發(fā)油平喘物質基礎的探討中展開丁苯酞平喘作用的研究。

離體實驗可避免神經、體液等全身因素對實驗結果的影響，直接展現藥物的作用；離體氣管平滑肌實驗中常見的有氣管片、氣管環(huán)、氣管螺旋片以及氣管容積法等，其中氣管螺旋片法中很難將氣管剪成寬度相等的螺旋片，氣管容積法與氣管環(huán)法的系統(tǒng)誤差比較大，而氣管片法操作簡單，系統(tǒng)誤差較小[10]，故本次實驗以痙攣狀態(tài)的離體豚鼠氣管片為研究對象，采用累積加藥法觀察丁苯酞的解痙作用。研究結果顯示，丁苯酞對離體痙攣狀態(tài)的豚鼠氣管平滑肌有明顯的解痙作用且呈一定的量效關系，提示丁苯酞具有舒張支氣管平滑肌而平喘的潛在藥理作用。

整體實驗較離體實驗更能反映藥物對生物體的實際藥理作用；豚鼠整體引喘法曾經是研究平喘藥物的經典實驗方法，但是由于豚鼠對乙酰膽堿、組胺等引喘物質的敏感性非常高，實驗過程中動物的死亡率較高而限制了本實驗的開展。本次實驗首先采用較高濃度的激發(fā)液對豚鼠進行篩選，對實驗納入動物通過低濃度激發(fā)液的反復刺激，提高豚鼠對激發(fā)液的耐受性而降低死亡率，最后在高濃度激發(fā)液的刺激下觀察豚鼠的哮喘行為學。實驗結果顯示，丁苯酞對豚鼠引喘潛伏期以及呼吸頻率、幅度等哮喘行為學指標有明顯的緩解作用。

一氧化氮(NO)與內皮素(endothelin, ET)是調節(jié)平滑肌舒縮功能的重要活性物質，廣泛參與支氣管哮喘中的氣道高反應性、呼吸道炎癥、黏液高分泌及氣道重塑等病理反應過程。NO是L-精氨酸在NO合成酶的催化下裂解生成，近年來研究認為，在哮喘的發(fā)病機制中NO具有雙相調節(jié)作用，低濃度時可引起支氣管平滑肌松弛與血管舒張效應，但在較高濃度時，NO則顯示出一定的毒性作用，它可引起毛細血管后靜脈擴張而促進滲出、支氣管上皮細胞腫脹脫落而加重氣道的炎癥反應，炎癥反應提高氣道反應性而加重哮喘癥狀[11]。ET是由21個氨基酸殘基構成的活性多肽，有3種亞型(ET-1～3)，其中ET-1是目前最強烈的血管、支氣管平滑肌收縮劑；同時ET-1還具有刺激平滑肌細胞和成纖維細胞增殖作用而參與氣道重構，促進粘膜下腺體分泌而提高痰液的粘稠度，誘導前列腺素、組胺及血小板活化因子等炎性介質釋放而加重氣道炎癥，提高氣道的反應性。因此，ET-1既是哮喘發(fā)生的始動因子，也是哮喘的效應分子，其表達水平與哮喘的嚴重程度成正比[12,13]。在本次實驗中，采用組胺與乙酰膽堿反復激發(fā)來誘發(fā)哮喘，結果顯示哮喘豚鼠血清NO與BALF中ET-1明顯上升，在丁苯酞的干預下上述異常變化得到不同程度的緩解，提示調節(jié)NO、ET水平是丁苯酞平喘作用機制之一。

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Preliminary pharmacodynamics study on antiasthmatic action of butylphthalide in guinea pig

WANG Zhi-wang1,2△, WANG Yong-hui3△, REN Yuan1,2△, WANG Rui-qiong1,LIN Xing-yao1, DUAN Hai-jing1

(1． Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2． Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicine of Gansu Province, Lanzhou 730000; 3．Shanxi College of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030024, China)

Objective: To study the anti-asthmatic effects of butylphthalide in guinea pig. Methods: This research included isolated tracheal smooth muscle andinvivoanimal experiments. Antispasmodic effects of butylphthalide at the concentrations of 1, 10, 100 mg/L were observed through spasmodical tracheal smooth muscle of guinea pig induced by acetylcholine or histamine (n=10). After screened, the guinea pigs were divided into control group, model group, dexamethasone(DXM) group, high and low dose butylphthalide groups. The effects of butylphthalide on nitric oxide (NO), endothelin-1 (ET-1) and asthmatic behaviors were observed on the asthmatic guinea pigs that were stimulated six times by the excitation fluid (1%ACh:0.05%Hist=1:1). Results: Butylphthalide at the concentrations of 1、10、100 mg/L had anti-spasmodic effects on spasmodical tracheal smooth muscle of guinea pig (15.08±7.68、42.41±13.54、77.56±24.82 to acetylcholine, 19.40±7.60、56.84±11.72、76.35±19.40 to histamine), which showed a certain dose-effect relationship. Butylphthalide could prolong asthmatic incubation period (53.3±13.2、33.1±13.0), improve asthmatic behaviors, reduce NO in serum (78.71±19.40、84.75±20.97) and ET-1 in bronchoalveolar lavage fluid (24.30±5.80、28.50±6.31) (P<0.05, 0.01). Conclusion: Butylphthalide has some effects of anti-asthma and one of the mechanisms is to relieve abnormal increase of NO and ET-1.

butylphthalide (BPL); antiasthma; guinea pig; nitric oxide (NO); endothelin-1 (ET-1)

國家自然科學基金項目(81460668)；甘肅省自然科學基金項目(1310RJZA086, 1606RJZA011)；甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室開放基金項目(ZDSYS-KJ-2015-002, ZDSYS-KJ-2016-004)

2016-06-13

2016-11-27

R562.25；R285.5

A

1000-6834(2017)02-136-05

△【通訊作者】Tel: 0931-8765395; E-mail: wzw0933@126.com, wyh766188@sina.com, leyuan988@163.com