黃瓊珠， 劉瀟萌， 黃國全， 王麗娟， 鄭玉潔， 陳鑫城， 劉禮斌， 陳 洲△

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 福州 350122； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科 福建內(nèi)分泌研究所, 福州 350001；3. 中國人民解放軍第四七六醫(yī)院內(nèi)分泌科, 福州 350002)

艾塞那肽對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護作用*

黃瓊珠3， 劉瀟萌1， 黃國全1， 王麗娟1， 鄭玉潔1， 陳鑫城1， 劉禮斌2， 陳 洲1△

(1. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 福州 350122； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科 福建內(nèi)分泌研究所, 福州 350001；3. 中國人民解放軍第四七六醫(yī)院內(nèi)分泌科, 福州 350002)

目的：探討GLP-1類似物艾塞那肽(exenatide)對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟的保護作用。方法：SD大鼠隨機分為正常組(NC組，n=8)和模型組；模型組給予高脂高糖飼料，喂養(yǎng)4周后腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)建模，72 h后以血糖≥16.7 mmol·L-1為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)，將成模大鼠隨機分為糖尿病對照組(DM組，n=10)、3 μg·kg-1艾塞那肽干預(yù)(Ex-1)組和6 μg·kg-1艾塞那肽干預(yù)(Ex-2)組；艾塞那肽組連續(xù)皮下注射艾塞那肽(bid)12周，NC組和DM組注射等容積溶劑；測定各組大鼠糖脂代謝變化和腎功能指標(biāo)如血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)、尿素氮(BUN)、24 h尿微量白蛋白排出率(24 h UMA)并計算肌酐清除率(Ccr)；測定腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛( MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)；HE染色觀察腎組織病理形態(tài)及ELISA法測定腎組織糖基化終末產(chǎn)物AGEs水平。結(jié)果：與糖尿病組相比，艾塞那肽可明顯改善糖尿病大鼠糖脂代謝，血糖、糖基化血紅蛋白(HbAlc)、甘油三脂及膽固醇值均下降(P<0.05)，腎功能指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)且肌酐清除率下降(P<0.05)，提示腎小球高濾過狀態(tài)；同時改善糖尿病引起的腎組織病理結(jié)構(gòu)改變，AGEs濃度下降(P<0.05)，氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和GSH-Px活力升高，MDA含量降低(P<0.05)。結(jié)論：艾塞那肽具有腎臟保護作用，其機制可能與抑制糖尿病大鼠腎組織的AGEs生成和改善氧化應(yīng)激有關(guān)。

艾塞那肽；糖尿病腎??；糖基化終末產(chǎn)物；氧化應(yīng)激

【DOI】 10.12047/j.cjap.5466.2017.033

糖尿病腎病是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，也是終末期腎病和糖尿病死亡的重要原因[1]。其發(fā)病機理復(fù)雜，目前認(rèn)為與腎血管動力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、糖代謝紊亂等多項因素相關(guān)[2]，而且這些因素之間常常會相互促進，共同推動糖尿病腎病進程。越來越多研究指出，AGEs-RAGE-氧化應(yīng)激系統(tǒng)在糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，糖尿病患者和糖尿病大鼠、小鼠腎組織中AGEs、RAGE水平顯著高于正常對照組，而且與糖尿病腎病具有相關(guān)性。增多的AGEs可與內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞等細(xì)胞表面上的RAGE受體結(jié)合，啟動細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、促進一系列炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致DM組大鼠腎組織纖維化相關(guān)指標(biāo)表達增加，從而引起或加重糖尿病腎病的進程[3]。

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種具有促胰島素分泌作用的胃腸類激素，也是近年來糖尿病藥物研究的熱點[4]。艾塞那肽(Exenatide, Ex)是首個人工合成的GLP-1類似物，研究發(fā)現(xiàn)其除了降低血糖，還有抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡等多效性[5]，國外臨床研究亦提示其對糖尿病患者有腎臟保護作用[6]，但具體機制有待進一步研究。本實驗擬觀察艾塞那肽對實驗性糖尿病大鼠腎臟的保護作用，并從糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)和氧化應(yīng)激方面探討其保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ, Sigma, USA)；艾塞那肽注射劑(Baxter Pharmaceutical Solution LLC)；大鼠糖基化血紅蛋白(HbA1c)試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)；大鼠AGEs試劑盒(Uscn Life Science，USA)；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)

雄性SD大鼠，體重200 ±30 g，購自福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)，12 h晝/夜周期。實驗全過程符合《實驗動物管理條例》。

1.3 模型建立及分組

大鼠隨機分為正常組(NC組，n=8)和模型組。模型組給予高脂高糖飼料，喂養(yǎng)4周后腹腔注射STZ(30 mg·kg-1，檸檬酸緩沖液稀釋)建模，72 h后測血糖，以血糖≥16.7 mmol·L-1為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)[7]。將成模大鼠隨機分為糖尿病對照組(DM組，n=10)、3 μg·kg-1艾塞那肽干預(yù)(Ex-1，n=8)組和6 μg·kg-1艾塞那肽干預(yù)(Ex-2，n=8)組。艾塞那肽連續(xù)皮下注射(bid)12周，NC組和DM組注射等容積溶劑。

1.4 樣本制備

實驗結(jié)束前2 d，將大鼠放入代謝籠(1只/籠)，禁食不禁水，記24 h尿量，免疫比濁法測定尿微量白蛋白濃度，計算24 h尿微量白蛋白排泄率(24 hour urine micro-albumin，24 h UMA)。末次給藥后禁食12 h，大鼠稱重、測空腹血糖，給予10%水合氯醛(0.03 ml·kg-1)腹腔注射麻醉固定，經(jīng)腹主動脈采血8 ml備用；快速取出左右腎，分離腎被膜并稱重記錄，計算腎指數(shù)[(腎重mg/體重g)×1 000]；右腎存于-80℃?zhèn)溆?；左腎固定、脫水、石蠟包埋和切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

1.5 生化指標(biāo)檢測

糖基化血紅蛋白HbA1c(glycated hemoglobin A1c)采用ELISA檢測，血清總膽固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、尿肌酐(urine creatinine, Ucr)、尿素氮(blood urea-nitrogen，BUN)等采用Beckman全自動生化分析儀測定，計算肌酐清除率(creatinine clearance rate,Ccr)[8]。

1.6 腎組織AGEs和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

凍存的腎組織制成10%腎組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝備用，按照試劑盒說明分別采用ELISA法測AGEs，TBA法測定MDA，WST-1法測定SOD，比色法測定GSH-Px。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 艾塞那肽改善糖尿病大鼠一般情況

與NC組大鼠相比，DM大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿，且毛發(fā)色澤暗淡、精神萎靡、活動減少，體重增長緩慢。Ex干預(yù)組大鼠一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)，攝食、進水量較DM組顯著下降。

2.2 艾塞那肽改善糖尿病大鼠糖脂代謝指標(biāo)

結(jié)果顯示DM組血糖、HbA1c、TG及CHOL與NC組相比均明顯升高(P<0.05)，Ex干預(yù)組相關(guān)指標(biāo)均下降(P<0.05)，糖脂代謝改善(表1)，但Ex-1與Ex-2之間統(tǒng)計學(xué)比較無顯著差異。

2.3 艾塞那肽改善糖尿病大鼠腎臟損傷

2.3.1 艾塞那肽對糖尿病大鼠腎功能指標(biāo)的影響 表2可見，DM組大鼠腎指數(shù)和24 h UMA明顯高于NC組大鼠(P<0.01)，肌酐清除率Ccr高于NC組(P<0.05)，提示糖尿病狀態(tài)下腎臟高濾過；Ex干預(yù)組大鼠腎指數(shù)和24 h UMA則較DM組大鼠下降(P<0.05)；且Ccr下降(P<0.05)，顯示高濾過狀態(tài)改善，但兩組Ex組之間比較無顯著性差異。

2.3.2 艾塞那肽對腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 HE染色普通光學(xué)顯微鏡下觀察可見，與NC組大鼠相比，DM組大鼠部分腎小球增生，腎小管細(xì)胞肥大、排列紊亂，管腔內(nèi)偶見滲出物，腎間質(zhì)偶見炎性細(xì)胞浸潤，腎內(nèi)小動脈壁增厚，管腔狹窄，管周纖維化，Ex干預(yù)組則上述病理改變明顯減輕(圖1見彩圖頁Ⅰ)。

2.3.3 艾塞那肽對糖尿病大鼠腎組織AGEs和氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與NC組相比，DM組腎組織AGEs濃度明顯增加(P<0.01，表3)；腎組織呈氧化應(yīng)激狀態(tài)，SOD和GSH-Px活力明顯降低而MDA增加(P<0.05)；與DM組相比，Ex干預(yù)組AGEs濃度下降(P<0.05)；而且氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和GSH-Px活力升高，MDA含量降低(P<0.05)，但兩組Ex組之間無顯著性差異。

Tab. 1 Effects of exenatide on metabolic characteristics of rats ±s)

GLU: Glucose; HbA1c: Glycated hemoglobin A1c; TG: Triglyceride; CHOL: Cholesterol; NC: Control; DM: Diabetes mellitus group; Ex: Exenatide

*P<0.05vsNC group；?#P<0.05vsDM group

Tab. 2 Effects of exenatide on the function of kidney of ±s)

BUN: Blood urea-nitrogen; Ccr: Creatinine clearance rate; 24 h UMA: 24 hoururine micro-albumin

*P<0.05,**P<0.01vsNC group;?#P<0.05vsDM group

Tab. 3 The level of AGEs and the characters of oxidative stress of renal ±s)

AGEs: Advanced glycation end products; GSH-Px: Glutathione peroxidase

*P<0.05,**P<0.01vsNC group；?#P<0.05,##P<0.01vsDM group

3 討論

GLP-1是機體血糖穩(wěn)態(tài)的重要腸道調(diào)節(jié)激素之一，它一方面可增強葡萄糖依賴的胰島素分泌反應(yīng)，另一方面通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)促進飽脹感，減少食物攝入，從而減輕胰島β細(xì)胞負(fù)擔(dān)，降低體重，是目前降糖藥研究的熱點之一。GLP-1類似物艾塞那肽，可結(jié)合并激活GLP-1受體，其作用與內(nèi)源性GLP-1相似。本實驗結(jié)果顯示艾塞那肽干預(yù)除了改善糖尿病大鼠一般狀況之外，還可降低血糖血脂，艾塞那肽組大鼠空腹血糖、HbA1c以及TG、CHOL均比DM組降低，這與國外報道一致[8,9]；同時腎功能檢測中發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組腎指數(shù)和24 h UMA也較DM組大鼠降低，肌酐清除率較DM組下降，腎臟高濾過狀態(tài)改善，同時艾塞那肽干預(yù)組大鼠腎臟腎小球肥大和腎組織病理形態(tài)改變也有所緩解，證實艾塞那肽除了降糖作用之外，對糖尿病大鼠腎臟損傷也具有改善作用。但是實驗中通過結(jié)果統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，兩個不同劑量的艾塞那肽干預(yù)組之間多方面指標(biāo)差別并無統(tǒng)計學(xué)意義，提示這一劑量范圍內(nèi)艾塞那肽對糖尿病腎臟功能指標(biāo)的改善沒有明顯的量效關(guān)系。

近年來越來越多的國內(nèi)外研究顯示，GLP-1類似物改善糖尿病腎病中腎臟損傷的作用，可能還具有降糖之外的其他機制，如Hiroki[10]等的研究提示GLP-1類似物可能通過激活cAMP-PKA信號通路，影響NAD(P)H 氧化酶可能是其改善糖尿病腎病的機制之一。同時，大量研究結(jié)果也證實，AGEs和氧化應(yīng)激在糖尿病腎病發(fā)展中起著重要的作用[7]。AGEs是指蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子在沒有酶參與的條件下，自發(fā)的與葡萄糖或其他還原單糖反應(yīng)所生成的產(chǎn)物。AGEs 能夠結(jié)合并破壞組織細(xì)胞，從而加速衰老及多種疾病的進展。機體高糖狀態(tài)導(dǎo)致AGEs生成并在腎組織蓄積，使腎間質(zhì)纖維化和腎組織損傷。本實驗中DM大鼠腎組織AGEs濃度明顯高于NC組(P<0.01)，提示非酶促糖基化作用在DM模型大鼠腎臟損傷中起一定的作用。高糖引起氧化應(yīng)激，增多的AGEs也誘導(dǎo)氧化應(yīng)激促進氧自由基大量產(chǎn)生，加重腎損傷，而氧化應(yīng)激又會加速AGEs的生成，二者共同促進糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[11,12]。如實驗所示，DM組大鼠體內(nèi)氧化和抗氧化能力失衡，腎組織MDA含量升高，MDA是常見的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可間接反映細(xì)胞受損程度；而SOD和GSH-Px的活力明顯低于NC組，SOD反映機體清除自由基的能力，GSH-Px則是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能保護細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害，因此DM組為氧化應(yīng)激狀態(tài)。艾塞那肽干預(yù)組腎功能改善，同時腎組織AGEs含量降低，SOD和GSH-Px的活力提高，MDA含量減少，提示除了改善糖脂代謝外，抑制非酶促糖基化作用、改善氧化應(yīng)激可能也是艾塞那肽發(fā)揮腎臟保護作用的重要機制。

上述結(jié)果表明，艾塞那肽具有延緩DM及腎臟損傷進程的作用，可能與其影響AGEs-RAGE-氧化應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān)，可為該類藥物在糖尿病腎病治療的臨床應(yīng)用提供新思路。

[1] Kitada M, Kanasaki K, Koya D. Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease[J].WorldJDiabetes, 2014, 5(3): 342-356.

[2] 齊敏友， 楊鈞杰， 周 斌, 等. 熊果酸對糖尿病小鼠腎病的保護作用及機制研究[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2014, 30(5): 445-448.

[3] Yamagishi S. Role of advanced glycation end products (AGEs) and receptor for AGEs (RAGE) in vascular damage in diabetes[J].ExpGerontol, 2011, 46(4): 217-224.

[4] Skov J. Effects of GLP-1 in the kidney[J].RevEndocrMetabDisord, 2014, 15(3): 197-207.

[5] Gedulin BR, Nikoulina SE, Smith PA,etal. Exenatide (exendin-4) improves insulin sensitivity and β-cell mass in insulin-resistant obese fa/fa Zucker rats independent of glycemia and body weight[J].Endocrinology, 2005, 146(4): 2069-2076.

[6] Panchapakesan U, Mather A, Pollock C. Role of GLP-1 and DPP-4 in diabetic nephropathy and cardiovascular disease[J].ClinSci(Lond), 2013, 124(1): 17-26.

[7] 李穎萌, 范雪梅, 王義明, 等. 葛根芩連湯對2型糖尿病大鼠的治療作用及其機制探討[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2013, 48(9): 1415-1421.

[8] Nielsen LL, Young AA, Parkes DG. Pharmacology of exenatide (synthetic exendin-4): a potential therapeutic for improved glycemic control of type 2 diabetes[J].RegulPept, 2004, 117(2): 77-88.

[9] Xu WW, Guan MP, Zheng ZJ,etal. Exendin-4 alleviates high glucose-induced rat mesangial cell dysfunction through the AMPK pathway[J].CellPhysiolBiochem, 2014, 33(2): 423-432.

[10]Fujita H, Morii T, Fujishima H,etal. The protective roles of GLP-1R signaling in diabetic nephropathy: possible mechanism and therapeutic potential[J].KidneyInt, 2014, 85(3): 579-589.

[11]Tesch GH, Lim AK. Recent insights into diabetic renal injury from the db/db mouse model of type 2 diabetic nephropathy[J].AmJPhysiolRenalPhysiol, 2011, 300(2): F301-310.

[12]楊 銳, 劉小粉, 馬善峰, 等. 硫化氫對1型糖尿病大鼠腎臟的保護作用[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2016, 32(2): 181-184.

The protective effect of exenatide on the renal injury in diabetic rats

HUANG Qiong-zhu3, LIU Xiao-meng1, HUANG Guo-quan1, WANG Li-juan1, ZHENG Yu-jie1, CHEN Xin-cheng1,LIU Li-bin2, CHEN Zhou1△

(1. College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350122; 2. Fujian Institute of Endocrinology, Department of Endocrinology, Union Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350001; 3. Department of Endocrinology, the 476th Hospital of People's Liberation Army, Fuzhou 350002, China)

Objective: To investigate the protective effect of exenatide (Ex) on the renal injury in streptozotocin-induced diabetic rats． Methods: Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups: normal control group (NC group,n=8) and model group. Model group was injected with low dose of streptozotocin (30 mg·kg-1) after the rats were fed with high fat and high glucose diet for 4 weeks. Seventy-two hours later, rats of blood glucose level ≥16.7 mmol·L-1were divided into diabetes mellitus group (DM,n=10) and two exenatide-treated groups (Ex groups，3 or 6 μg·kg-1,n=8). Ex groups subcutaneously injected with exenatide for 12 weeks, but NC group and DM group were injected with the same volume of solvent. Changes in glycolipid metabolism and renal function such as serum creatinine (Scr), urine creatinine (Ucr), blood urea nitrogen (BUN), 24 hour urine micro-albumin (24 h UMA)in the 4 groups of rats were determined and creatinine clearance rate (Ccr) were calculated. Renal oxidative stress parameters such as superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde(MDA), glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to examine pathological morphology in the renal tissues and ELISA was performed to determine the level of advanced glycation end products(AGEs), the glycosylation end product in renal tissues. Results: Compared to the DM group，glycolipid metabolic abnormalities in the exenatide-treated groups were significantly ameliorated with lower levels of blood glucose，HbAlc, cholesterol and triglyceride (P<0.05). The renal function index was markedly improved (P<0.05) with Ccr reduced, indicating a high glomerular filtration status. Meanwhile, exenatide treatment improved the diabetes-induced pathological changes in renal morphology, substantially increased the activities of SOD and GSH-Px, and reduced the levels of MDA and AGEs. Conclusion: Exenatide has the renal protective effect probably by the mechanisms of inhibition of AGEs production and reduction of oxidative stress in the renal tissues of diabetic rats.

exenatide； diabetes nephropathy； advanced glycation end products； oxidative stress

福建省科技廳重點項目(2013Y0041)福建省財政廳專項資助(2012B022)；國家衛(wèi)計委共建科學(xué)基金-福建省衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關(guān)計劃(wkj-fj-12)

2016-06-20

2016-12-14

R587.1

A

1000-6834(2017)02-128-04

△【通訊作者】Tel: 13960833981； E-mail: kellandchen1007@Hotmail.com