孫 鵬， 田向陽， 史仍飛

(上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院， 上海 200438 )

玉米肽聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對肥胖大鼠肝組織中ATGL和TNF-α影響*

孫 鵬， 田向陽， 史仍飛△

(上海體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院， 上海 200438 )

目的：探討玉米肽結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)對肥胖大鼠體脂肪和肝細(xì)胞甘油三酯脂肪酶(ATGL)及腫瘤壞死因子α(TNF-α的)影響。方法：以32只肥胖雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，隨機(jī)分為安靜對照組(CON)、玉米肽組(DCP)、運(yùn)動(dòng)組(DEX)和玉米肽運(yùn)動(dòng)組(DCE)(n=8)。玉米肽組和玉米肽運(yùn)動(dòng)組給予玉米肽飼料，其它各組給予普通飼料。運(yùn)動(dòng)組和玉米肽運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)，干預(yù)4周后處死取材。剝離腹腔脂肪組織和肝臟，蛋白印跡技術(shù)檢測肝組織ATGL和TNF-α蛋白的表達(dá)。結(jié)果：干預(yù)4周后，與肥胖對照組相比，玉米肽運(yùn)動(dòng)組大鼠體重以及脂肪系數(shù)顯著下降(P<0.05，P<0.01)，且顯著低于單獨(dú)玉米肽補(bǔ)充組(P<0.05)；肝細(xì)胞ATGL蛋白表達(dá)顯示，玉米肽運(yùn)動(dòng)組均高于其它各組，且與對照組有顯著性差異(P<0.05)；玉米肽運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞TNF-α蛋白結(jié)果均低于其它組，且顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)論：玉米肽結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)能有效地降低肥胖大鼠的體重以及脂肪含量，可能是玉米肽與有氧運(yùn)動(dòng)的協(xié)同作用，調(diào)節(jié)了肝臟ATGL和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)脂代謝有關(guān)。

肥胖；玉米肽；有氧運(yùn)動(dòng)；脂肪組織脂肪酶

【DOI】 10.12407/j.cjap.5416.2017.030

近年來，肥胖已成為威脅人類健康的最大殺手之一，高熱能食物的攝取和體力活動(dòng)水平的降低可能是主要的誘發(fā)因素。肝臟在調(diào)節(jié)脂代謝的過程中發(fā)揮重要作用，脂肪組織甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)是近年來在脂肪組織中發(fā)現(xiàn)的脂肪水解酶類，主要催化甘油三酯水解為甘油二酯,在肝臟也有表達(dá)[1,2]；同時(shí)大量研究表明肥

胖者處于長期的慢性低度炎癥狀態(tài)[3]，即表現(xiàn)為腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥因子在脂肪組織過量表達(dá)。玉米肽類是植物蛋白經(jīng)酶解得到小分子肽類物質(zhì)，富含豐富的支鏈氨基酸，具有調(diào)節(jié)脂代謝、預(yù)防肝性腦病、提高機(jī)體抗氧化等生理功能[4]。玉米肽結(jié)合運(yùn)動(dòng)對肥胖大鼠減脂的效果及相關(guān)機(jī)制的研究鮮有報(bào)道，是否兩者聯(lián)合使用對于肥胖大鼠有協(xié)同作用？本研究以有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合玉米肽補(bǔ)充的干預(yù)方案探討其對肥胖大鼠脂質(zhì)代謝和肝臟ATGL、TNF-α蛋白的影響，以進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)結(jié)合玉米肽補(bǔ)充在調(diào)節(jié)脂肪代謝的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與肥胖模型的建立

清潔級成年雄性SD大鼠，體重160～180 g，購于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，通過兩個(gè)月肥胖建模飼養(yǎng)，取建模成功的32只作為實(shí)驗(yàn)對象。普通飼料：購于上海仕林科技有限公司。玉米肽(corn peptide)：購于湖北瑞邦生物科技有限公司。高脂飼料：參考那立欣等[5]配方加工而成，配方如下：一般鼠料74.75%、豬油10%、蔗糖5%、蛋黃粉5.0%、麻油3%、膽酸鈉0.25%、食鹽2%。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方案

32只肥胖大鼠隨機(jī)分為肥胖對照組(DIO)、玉米肽組(DCP)、運(yùn)動(dòng)組(DEX)、玉米肽聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組(DCE)(n=8)。玉米肽組、玉米肽聯(lián)合運(yùn)動(dòng)組給予玉米肽飼料，其余各組給予一般鼠料。運(yùn)動(dòng)組和玉米肽運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)(跑臺坡度為零，速度15 m/min，時(shí)間60 min/d，頻率6 d/w[6])，其余各組不做運(yùn)動(dòng)干預(yù)。干預(yù)4周后取材。玉米肽飼料：參照吳海寰等[7]蛋白質(zhì)的攝入量，每千克飼料加入200 g玉米肽。肥胖模型組經(jīng)8周的高脂飼料飼養(yǎng)，取32只達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)的大鼠納入實(shí)驗(yàn)組，肥胖標(biāo)準(zhǔn)為肥胖建模組體重超過安靜對照組體重平均值20%[8]。

1.3 主要試劑與儀器

ATGL和TNF-α抗體(美國CST公司)，二抗(美國CST公司)，β-actin(美國CST公司)。IKA T10基礎(chǔ)型分散機(jī)(德國IKA公司)，SE300-10A-1.0微型電泳槽/TE22轉(zhuǎn)膜儀(美國Hoefer公司)，Gel Doc EZ凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO RAD公司)。

1.4 樣本采集

所有大鼠麻醉后，固定、備皮、依次剪開腹部皮膚、筋膜，剝離肌肉，下腔靜脈取血，離心后取血漿，-80℃凍存。采血后迅速暴露肝臟，避免損傷肝臟組織及大血管，迅速分離出肝臟。去除包膜，剪取一小塊肝組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗肝臟，濾紙吸干水分，裝入凍存管中液氮速凍，-80℃凍存。取出大鼠雙側(cè)腎周脂肪墊及附睪脂肪墊，4℃生理鹽水洗滌，用濾紙吸干后稱重，錫箔紙包裹后-80℃凍存。

1.5 指標(biāo)測定方法

1.5.2 內(nèi)臟脂肪系數(shù)和肌肉指數(shù) 內(nèi)臟脂肪系數(shù)(%)=內(nèi)臟脂肪重量(g)/體重(g)×100。

1.5.3 肝組織中ATGL和TNF-α蛋白的測定 采用Western blot法檢測，稱取60～80 mg肝組織，放入5 ml離心管內(nèi)，加入1 000 μl裂解液，勻漿機(jī)粉碎，靜置20～30 min后，離心取上清液。 BCA法蛋白質(zhì)定量后確定上樣量(每孔20 μl，總蛋白量為每孔40 μg)。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離(濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%)后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h后孵育一抗(1∶1 000稀釋)，4℃過夜。TBST洗滌3次后孵育二抗(1∶3 000稀釋)1 h。TBST洗滌3次后， ECL發(fā)光，暗室內(nèi)顯影、定影。用Gel Doc EZ凝膠成像系統(tǒng)掃描定量各條帶的相對灰度值。采用LabWorks軟件讀取積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 玉米肽結(jié)合運(yùn)動(dòng)對肥胖大鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重?zé)o顯著性差異；4周的實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，與肥胖對照組相比，所有運(yùn)動(dòng)組大鼠體重均下降，但僅有玉米肽結(jié)合運(yùn)動(dòng)組有顯著降低(P<0.05)。玉米肽結(jié)合運(yùn)動(dòng)組大鼠體重顯著低于單獨(dú)玉米肽組及單獨(dú)運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)。

GroupBeforeAfterDIO496.93±30.03544.33±39.95DCP493.48±23.03555.80±18.39DEX492.50±20.82487.55±17.05DCE494.30±26.29469.79±14.26*#

DIO: Obese control group; DCP: Core peptide group; DEX: Exercise group; DCE: Corn peptide combined exercise group

*P<0.05vsDIO control group;?#P<0.05vsDCP group

2.2 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠脂肪指數(shù)和Lee′s指數(shù)的變化

與肥胖對照組相比，玉米肽運(yùn)動(dòng)組大鼠內(nèi)臟脂肪顯著下降(P<0.01)，且也低于其它各組；Lee′s index結(jié)果顯示，與對照組比較，僅單獨(dú)運(yùn)動(dòng)組出現(xiàn)顯著下降(P<0.05，表2)。

2.3 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠肝組織中ATGL及TNF-α蛋白表達(dá)的變化

與肥胖對照組相比，玉米肽組、玉米肽結(jié)合運(yùn)動(dòng)組肝臟ATGL/β-Actin表達(dá)分別增加了2.47倍和3.43倍，均有顯著性差異(P<0.05，圖1)，且玉米肽結(jié)合運(yùn)動(dòng)組高于單獨(dú)玉米肽組；TNF-α結(jié)果顯示，與對照相比運(yùn)動(dòng)組、玉米肽結(jié)合運(yùn)動(dòng)組大鼠肝臟TNF-α/β-Actin分別降低了56.8%和62.7%，有顯著性差異(P<0.05，圖2)。

GroupFatindexLee'sindexDIO3.88±0.210.321±0.013DCP3.87±0.480.321±0.007DEX2.92±0.820.308±0.012*DCE2.69±0.41**#0.317±0.005

DIO: Obese control group; DCP: Core peptide group; DEX: Exercise group; DCE: Corn peptide combined exercise group

*P<0.05,**P<0.05vsDIO control group;?#P<0.05vsDIO group

Fig. 1 Effect of different treatments on ATGL ATGL: Adipose triglyceride lipase*P<0.05vsDIO group

Fig. 2 Effect of different treatments on TNF-α TNF-α: Tumar necrosis factor-α*P<0.05vsDIO group

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)玉米肽具有降低肥胖大鼠體重，并能提高肝細(xì)胞內(nèi)肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyl transferase，CPT)活性，降低脂肪酸合成酶活性[9]。但是玉米肽結(jié)合運(yùn)動(dòng)在人體及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究還鮮有報(bào)道。當(dāng)前結(jié)果表明補(bǔ)充玉米肽結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)能降低肥胖大鼠體重和體脂水平，并且這一積極效應(yīng)優(yōu)于單獨(dú)補(bǔ)充玉米肽或運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式，這可能是玉米肽和有氧運(yùn)動(dòng)發(fā)揮了協(xié)同效果，既有效地起到了減體重和減脂肪的作用，又起到了增加瘦體重的目的。

補(bǔ)充玉米肽的積極效應(yīng)主要源于玉米肽富含小分子肽類物質(zhì)，這些小分子肽類由玉米蛋白經(jīng)酶切而得到的含2～6個(gè)氨基酸的混合肽，研究表明這些小分子肽可以直接被吸收[10]，從而在體內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的生理功能，如調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗高血壓、抗疲勞和抗氧化等。小分子肽類物質(zhì)在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮功能[9]。另一方面，玉米肽中富含豐富的支鏈氨基酸，尤其是亮氨酸。研究表明亮氨酸補(bǔ)充能顯著減少飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠體重,并且與提高的能量消耗和脂肪組織中解偶聯(lián)蛋白(UCP3)表達(dá)有關(guān)[11]。也有進(jìn)一步的研究認(rèn)為亮氨酸對高脂飲食誘導(dǎo)的高血脂癥有預(yù)防作用，如zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸能降低高脂飲食小鼠血漿LDLC水平。

肝臟是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的重要器官，在脂肪的合成與分解方面均發(fā)揮重要作用。在上述分析中亮氨酸補(bǔ)充能夠降低血脂和減輕體重，但亮氨酸不同于其它必需氨基酸，其主要代謝場所在外周組織(如骨骼肌等)而不是肝臟中，因?yàn)楦渭?xì)胞線粒體內(nèi)支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶活性較低。長期以來，激素敏感脂肪酶( hormone-sensitive lipase, HSL) 被認(rèn)為是脂肪分解主要限速酶[13]。近幾年通過基因敲除技術(shù)發(fā)現(xiàn)脂肪組織存在一種新的ATGL，也存在于肝臟[2]。在小鼠肝臟細(xì)胞中過表達(dá)ATGL可以促進(jìn)游離脂肪酸的釋放和氧化, 改善肝臟的脂質(zhì)代謝[14,15], 說明ATGL在維持小鼠機(jī)體能量平衡中也起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)玉米肽補(bǔ)充顯著提高大鼠肝臟ATGL蛋白表達(dá)，尤其是運(yùn)動(dòng)與玉米肽聯(lián)合干預(yù)，同時(shí)我們檢測的TNF-α蛋白表達(dá)則在運(yùn)動(dòng)組有顯著性降低。

細(xì)胞因子TNF-α主要通過誘發(fā)炎癥發(fā)揮作用，近些年來研究認(rèn)為肥胖呈現(xiàn)低度炎癥反應(yīng)，也有研究證實(shí),高脂膳食大鼠肝臟TNF-α表達(dá)增加[16]，TNF-α可能直接作用于胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,抑制胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),減弱胰島素的作用，從而影響脂肪代謝。本研究中玉米肽與運(yùn)動(dòng)結(jié)合改善肝臟脂肪分解能力，同時(shí)也顯著降低TNF-α水平。Speretta等研究[17,18]證實(shí)長期有氧運(yùn)動(dòng)能夠降低體內(nèi)TNF-α的表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。

玉米肽結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)有效地減少了肥胖大鼠的體重以及脂肪含量。其可能機(jī)制是在運(yùn)動(dòng)促進(jìn)機(jī)體代謝的條件下，玉米肽中所富含的支鏈氨基酸和小分子肽類物質(zhì)發(fā)揮對肝臟細(xì)胞ATGL和TNF-α的積極調(diào)節(jié)作用，從而進(jìn)一步促進(jìn)脂類代謝，優(yōu)于運(yùn)動(dòng)、玉米肽的單獨(dú)干預(yù)方案。

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Effects of dietary corn peptide and exercise on hepatic ATGL and TNF-α in obese rats

SUN Peng, TIAN Xiang-yang, SHI Reng-fei△

(Shanghai University of Sports, College of Life Science, Shanghai 200438, China)

Objective: To determine whether dietary corn peptides supplementation with or without exercise on body composition and factors related to hepatic lipid metabolism in obese rats induced by a high fat diet. Methods: Male SD rats were fed a high-fat diet (40% calorie as fat) for 8 weeks as a dietary induced obesity model (DIO,n=32). They were then randomly divided into four groups, control, corn piptide(CP) group, exercise group and CP+exercise group (n=8). Supplement (CP: 200 g/kg) and exercise(tread mill Ex was performed 15 m/min for 60 min/d, 5 days a week) protocol for 4 weeks. Body weight and dietary levels of rats were monitored during the experimental period. At the end of the 4thweeks, rats of all groups were sacrificed. Perirenal fat and liver were harvested, and hepatic adipose triglyceride lipase(ATGL) and TNF-α were analyzed via Western blot. Results: After 4 weeks, compared with DIO control group, body weight and perirenal fat mass index in CP+exercise group were significantly decreased (P<0.05). Hepatic ATGL was significantly higher in corn peptides supplementation, especially in combination with exercise (P<0.05).At the same time, the values of TNF-α expression were decreased significantly in exercise groups compared with DIO group (P<0.05). Conclusion: Corn peptides combined with aerobic exercise has a weight reduction by lowering adipose tissue in experimental animals, it may be related to the expression of ATGL and TNF-α in the liver, and promote lipid metabolism.

obesity; corn peptide; aerobic exercise; ATGL

上海教委創(chuàng)新項(xiàng)目(13YZ100)；上海體育學(xué)院“運(yùn)動(dòng)健身科技”省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2016-01-15

2016-11-02

R151.2

A

1000-6834(2017)02-117-04

△【通訊作者】Tel： 021-51253247； E-mail： rfshi@sus.edu.cn