董維平++嚴(yán)奉奇++李霞++許秀麗++袁建林++武國軍

[摘要] 目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-4（TIMP-4）在膀胱癌組織與癌旁組織中的表達及其臨床意義。 方法 收集2015年6月～2016年9月西京醫(yī)院泌尿外科152例膀胱尿路上皮癌患者手術(shù)標(biāo)本的癌組織及其癌旁組織，利用免疫組織化學(xué)染色法分別對其進行染色，并在顯微鏡下觀察組織切片染色情況，運用半定量法分析膀胱癌組織及癌旁組織中TIMP-4蛋白的表達情況。 結(jié)果 TIMP-4蛋白免疫反應(yīng)物主要沉積于細胞質(zhì)。膀胱癌組織與癌旁組織中TIMP-4蛋白染色陽性率分別為26.97%和84.21%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。低級別膀胱乳頭狀尿路上皮癌與高級別膀胱乳頭狀尿路上皮癌組織中TIMP-4蛋白染色陽性率分別為38.71%和18.89%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 TIMP-4蛋白在膀胱癌組織內(nèi)的表達較癌旁組織表達低，且其表達量與膀胱癌組織學(xué)分級相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-4；膀胱尿路上皮癌；免疫組織化學(xué)染色

[中圖分類號] R737 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0077-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of mammalian tissue inhibitor of metalloproteinase-4 （TIMP-4） in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma and its clinical significance. Methods Surgical specimens of cancer tissues and normal tissue adjacent to carcinoma of 152 cases diagnosed as bladder urothelial cell carcinoma were collected from June 2015 to September 2016 in Department of Urology of Xijing Hospital. The immunohistochemical staining was performed and the semi-quantitative scoring system was used to evaluate the extent and intensity of the staining. The expression of mammalian TIMP-4 in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma were analyzed by using semi-quantitative method. Results Immunohistochemistry showed that TIMP-4 protein positive was staining in the cytoplasm of normal tissues and bladder carcinoma. The positive expression rate of TIMP-4 in bladder urothelial cell carcinoma and normal tissue adjacent to carcinoma was 26.97% and 84.21% respectively， with statistical difference （P < 0.05）. The positive expression rate of TIMP-4 in low-grade bladder papillary urothelial carcinoma and high-grade bladder papillary urothelial carcinoma was 38.71% and 18.89% respectively， with statistical difference （P < 0.05）. Conclusion TIMP-4 expression level in bladder urothelial cell carcinoma tissue is lower than that in normal tissue adjacent to carcinoma. The expression degree in bladder urothelial cell carcinoma is associated with histopathologic grade.

[Key words] Mammalian tissue inhibitor of metalloproteinase-4； Bladder urothelial cell carcinoma； Immunohistochemistry

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性病變，其主要組織細胞學(xué)來源為尿路上皮細胞，常被稱為膀胱尿路上皮癌（BUCC）或移行細胞癌（TCC），占到膀胱癌的90%以上。膀胱癌顯著特點是腫瘤具有多發(fā)病灶和術(shù)后高復(fù)發(fā)率。近年來膀胱癌發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率均呈逐年增加的趨勢，應(yīng)引起高度重視[1]。膀胱癌具有多中心、易復(fù)發(fā)、易侵襲、易耐藥等生物學(xué)特性，10%～30%的非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）進展為肌層浸潤性腫瘤，高級別的NMIBC更容易惡化，將近75%的高級別NMIBC在診斷后10年內(nèi)復(fù)發(fā)、進展或死亡[2]，而對于膀胱癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移、浸潤的機制研究仍不明確。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）是體內(nèi)細胞分泌的一類蛋白酶抑制劑，它們可以與基質(zhì)金屬蛋白酶原結(jié)合，并抑制其激活，進而影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡等過程[3]。TIMP-4是TIMP家族新發(fā)現(xiàn)的一個成員，其在宮頸癌、肝癌、胃癌等腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)異常表達現(xiàn)象，并提示該蛋白與腫瘤的遷移、侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-6]。然而，關(guān)于TIMP-4在膀胱癌內(nèi)的表達情況及其表達與膀胱癌的臨床關(guān)系還未見報道，本實驗擬通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測TIMP-4蛋白在膀胱癌組織與癌旁組織內(nèi)的表達情況，并分析其表達與膀胱癌不同組織學(xué)分級的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2015年6月～2016年9月于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科手術(shù)治療的患者152例，均為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切手術(shù)治療的非肌層浸潤性膀胱尿路上皮癌，獲取腫瘤組織病理標(biāo)本和癌旁正常膀胱組織標(biāo)本，年齡51～72歲。根據(jù)WHO 2004非肌層浸潤性膀胱尿路上皮癌分級方法，其中組織學(xué)分級為低級別乳頭狀尿路上皮癌62例，高級別乳頭狀尿路上皮癌90例，均為初診初治，無術(shù)前抗腫瘤史。152例患者的腫瘤標(biāo)本作為實驗組，癌旁正常膀胱組織作為對照組。實驗中所使用的所有人體組織標(biāo)本均經(jīng)過第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥物臨床試驗倫理委員會審查。

1.2 主要試劑

兔抗TIMP-4多克隆抗體（美國Sigma公司）；免疫組化試劑盒；生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）。

1.3 實驗方法

免疫組織化學(xué)SP法：制作石蠟切片，選片。組織切片烤箱內(nèi)烘烤30 min；用二甲苯浸泡脫蠟3次。自100%到70%梯度濃度的乙醇溶液依次浸泡5 min，用PBS洗片3 min×3次。滅酶活性：用0.3%甲醇-H2O2進行內(nèi)源性過氧化物酶滅活，用PBS洗片3 min×3次。抗原修復(fù)：切片用濃度0.01 mol/L、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液煮沸10 min，自然冷卻后多次用PBS洗片3 min×3次。血清封閉：室溫環(huán)境下覆加正常山羊血清封片20 min?？贵w封閉：滴加適當(dāng)濃度的TIMP-4一抗，4℃冰箱中過夜，PBS洗片3 min×5次。滴加稀釋后的二抗（生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體），37℃孵育1 h，PBS洗片3 min×5次。SP封閉：室溫滴加SP液孵育1 h，PBS洗片3 min×5次。后期處理：滴加臨時配制的3，3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽鹽酸（DAB）顯色液，約5 min觀察顯色程度，適時用PBS洗片；蘇木素液染核后用乙醇70%～100%的濃度梯度依次脫水；二甲苯浸泡性切片透明處理；37℃烤箱干燥封片；電子顯微鏡下拍片保存。

1.4 評定標(biāo)準(zhǔn)

TIMP-4蛋白陽性染色主要表現(xiàn)為細胞質(zhì)中棕黃色顆粒沉著。每例標(biāo)本選取6個典型視野進行采集（10×40），計數(shù)染色細胞，用半定量分析法進行分析。按染色程度劃分：無染色（0分）；淺染色（1分）；中等染色（2分）；濃染色（3分）。按染色細胞比例劃分：<10%（0分）；11%～25%（1分）；26%～50%（2分）；51%～75%（3分）；>75%（4分）。最終陽性染色分值為染色程度分值與染色細胞百分比的乘積，共分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）、強陽性（+++）四個層次，分別對應(yīng)：0～1分、2～4分、5～8分和9～12分。“陽性表達率”計算公式為[（+）+（++）+（+++）]例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMP-4蛋白在膀胱癌組織及癌旁正常膀胱組織中的表達

實驗組和對照組標(biāo)本中TIMP-4蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），即TIMP-4蛋白在癌旁正常膀胱組織中的陽性表達率高于膀胱癌組織（圖1、表1）。

2.2 膀胱癌不同組織學(xué)分級中TIMP-4蛋白的表達

膀胱癌不同組織學(xué)分級中TIMP-4蛋白陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），TIMP-4蛋白的陽性表達率在高級別乳頭狀尿路上皮癌中低于低級別乳頭狀尿路上皮癌（圖2、表2）。

3 討論

膀胱癌的發(fā)病率居全身惡性腫瘤的第九位，全球范圍內(nèi)每年新發(fā)病例達38萬例，而死亡病例高達15萬例[7]。在我國，膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占泌尿系惡性腫瘤的首位。男性膀胱癌發(fā)病率位居全身惡性腫瘤的第七位，女性排在第十位以后[8]。膀胱癌的預(yù)后與腫瘤的分級密切相關(guān)，其中絕大多數(shù)膀胱癌患者預(yù)后不良主要由于膀胱癌的轉(zhuǎn)移，膀胱癌診治后5年內(nèi)復(fù)發(fā)風(fēng)險變化從31%到78%，進展風(fēng)險變化從0.8%到45%[9]。然而腫瘤的轉(zhuǎn)移過程是一個多因素、多條件影響的復(fù)雜過程[10]。其中遷移、侵襲在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程中至關(guān)重要，然而腫瘤細胞遷移、侵襲也是在多因素、多基因共同作用下完成的[11]，因此對影響腫瘤細胞遷移、侵襲的基因研究顯得尤為重要。

研究顯示，MMPs家族在腫瘤細胞的發(fā)展和侵襲過程中扮演著重要的角色[12]。MMPs是一類活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，能有效降解基底膜和細胞外基質(zhì)的主要成分，并且在破壞組織結(jié)構(gòu)的同時能促進腫瘤組織血管的形成[13]。而TIMP是抑制MMPs家族的一種重要酶類，在影響腫瘤細胞生長、侵襲等過程中起重要作用[14]。在正常情況下，MMPs與TIMP家族之間處于動態(tài)平衡狀態(tài)，研究顯示，當(dāng)腫瘤細胞內(nèi)的TIMP與MMPs失去平衡，TIMP影響腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[15]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TIMPs家族成員有4個（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4）。TIMP-4是Greene等[16]在1996年采用已表達序列標(biāo)志（EST）測定方法研究MMP抑制物TIMP時發(fā)現(xiàn)，屬于TIMP家族成員的一種，按照發(fā)現(xiàn)順序被命名為TIMP-4。TIMP-4其分子量為22 kD，含有224個氨基酸，具有其他TIMPs的主要特征。作為TIMP家族新發(fā)現(xiàn)成員，通過免疫組化、RT-PCR及原位雜交技術(shù)等方法研究發(fā)現(xiàn)，其在宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織內(nèi)低表達[17-19]。

研究發(fā)現(xiàn)，TIMPs作為MMP特異性抑制因子，抑制MMP對細胞外基質(zhì)（ECM）的降解，從而抑制腫瘤細胞的遷移侵襲。Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1、TIMP-2能夠抑制血管生成素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞出芽，說明TIMPs在抑制腫瘤新生血管形成中起重要作用。TIMP是一組抑制MMPs活性的低分子蛋白酶類，目前雖然關(guān)于TIMP的作用機制研究還不多，但是現(xiàn)有研究表明，TIMP-4可以抑制多種MMP的活性，包括MMP-2、MMP-9和MMP-1等，通過促進多種MMP蛋白的降解而抑制細胞的遷移侵襲[21]。然而關(guān)于TIMP-4在膀胱癌內(nèi)的表達情況還沒有相關(guān)文獻報道，本實驗通過免疫組織化學(xué)染色方法對膀胱癌組織及癌旁組織標(biāo)本進行TIMP-4蛋白表達檢測，發(fā)現(xiàn)TIMP-4染色陽性率在膀胱癌組織與癌旁組織中分別為26.97%和84.21%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），說明在膀胱癌組織內(nèi)的陽性表達明顯低于其在癌旁組織內(nèi)的表達。進一步通過對不同組織學(xué)分級的膀胱癌組織染色分級統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，TIMP-4蛋白表達水平與膀胱癌的組織學(xué)分級密切相關(guān)，其在高級別乳頭狀尿路上皮癌和低級別乳頭狀尿路上皮癌中的陽性表達率分別為18.89%和38.71%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），說明TIMP-4蛋白的表達水平與膀胱癌的惡性程度密切相關(guān)。

綜上所述，TIMP-4作為一種抑癌基因，其在多種系統(tǒng)腫瘤中基因表達缺失，與腫瘤細胞的發(fā)生、進展、遷移侵襲有密切聯(lián)系。本研究揭示了TIMP-4蛋白在膀胱癌內(nèi)低表達，且與膀胱癌的組織學(xué)分級密切相關(guān)，為對膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機制研究提供了新思路，同時也為TIMP-4在膀胱癌內(nèi)作用機制的研究奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1] 黃健，林天歆，李鍇文，等.中國膀胱癌診斷和治療現(xiàn)狀調(diào)查及初步分析[J].中華泌尿外科雜志，2014，35（2）：8-9.

[2] Chamie K，Litwin MS，Basestt JC，et al. Recurrence of high-risk bladder cancer：a population-based analysis [J]. Cancer，2013，119（17）：3219-3227.

[3] Somigliana E，Vigano P，Benaglia L，et al. Adhesion prevention in endometriosis：a neglected critical challenge [J]. J Minim Invasive Gynecol，2012，19（4）：415-421.

[4] Lizarraga F，Espinosa M，Ceballos-Cancino G，et al. Tissue inhibitor of metallo proteinases-4 （TIMP-4） regulates stemness in cervical cancer cells [J]. Mol Carcinog，2016，55（12）：1952-1961.

[5] Tsai HT，Hsieh MJ，Chiou HL，et al. TIMP-3-1296 T>C and TIMP-4-55 T>C gene polymorphisms play a role in the susceptibility of hepatocellular carcinoma among women [J]. Tumour Biol，2014，35（9）：8999-9007.

[6] Pullen NA，Anand M，Cooper PS，et al. Matrix metalloproteinase-1 expression enhances tumorigenicity as well as tumor-related angiogenesis and is inversely associated with TIMP-4 expression in a model of glioblastoma [J]. J Neurooncol，2012，106（3）：461-471.

[7] Ferlay J，Bray F，Center MM，et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008 [J]. Int J Cancer，2010，12（7）：2893-2917.

[8] Jemal A，Bray F，Center MM，et al. Global cancer statistics 2008 [J]. CA Cancer J Clin，2011，61（8）：69-90.

[9] Sylvester RJ，van der Meijden APM，Oosterlinck W，et al. Predicting recurrence and progression in individual patients with Stage Ta T1 bladder cancer using EORTC risk tables：a combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials [J]. Eur Urol，2006，49（2）：466-477.

[10] Desouza K，Chowdhu S，Hughes S. Prompt diagnosis key in bladder cancer [J]. Practitioner，2014，258（1767）：23-27.

[11] Xiong Z，Lu MH，F(xiàn)an YH，et al. Downregulati0n of heparanase by RNA interference inhibits invasion and tumorigenesis of hepatocellular cancer cells in vitro and in vivo [J]. Int J Oncol，2012，40（5）：1601-1609.

[12] Nelson AR，F(xiàn)ingleton B，Rothenberg ML，et al. Matrix metalloproteinases：biologic activity and clinical implications [J]. J Clin Oncol，2000，18（3）：1135-1149.

[13] Sandhu BS，Sanyal AJ. Management of ascites in cirrhosis [J]. Clin Liver Dis，2005，9（4）：715-732.

[14] Chirco R，Liu XW，Jung KK，et al. Novel functions of TIMPs in cell signaling [J]. Cancer Metastasis Rev，2006，25（1）：99-113.

[15] Van Waveren C，Sun Y，Cheung HS，et al. Oxidative phosphorylation dysfunction modulates expression of extracellular matrix remodeling genes and invasion [J]. Carcinogenesis，2006，27（3）：409-418.

[16] Greene J，Wang M，Liu YE，et al. Molecular cloning and characterization of human tissue inhibitor of metalloproteinase-4 [J]. J Biol Chem，1996，271（48）：30375-30380.

[17] Lizarraga F，Espinosa M，Maldonado V，et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases-4 is expressed in cervical cancer patients [J]. Anticancer Res，2005，5（1B）：623-627.

[18] Bister V，Skoog T，Virolainen S，et al. Increased expression of matrix metalloproteinases-21 and -26 and TIMP-4 in pancreatic adenocarcinoma [J]. Mod Pathol，2007，20（11）：1128-1140.

[19] Lee S，Desai KK，Iczkowski KA，et al. Coordinated peak expression of MMP-26 and TIMP-4 in preinvasive human prostate tumor [J]. Cell Res，2006，16（9）：750-758.

[20] Kim I，Kim HG，Moon SO，et al. Angiopoietin-1 induces endothelial cell Sprouting through the activation of focal adhesion kinase and plasmin secretion [J]. Cite Res，2000，86（9）：952-959.

[21] Liu YE，Wang M，Greene J，et al. Preparation and characterization of recombination TIMP-4 [J]. J Biol Chem，1997，272（6）：20479-20483.

（收稿日期：2017-01-02 本文編輯：李亞聰）