顏麗萍++凌順++李弘++喻曉東++蘇林++石曉萍++陳依鴿++閆玉棟

[摘要] 目的 研究促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（pHGF）對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)及血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平的影響。 方法 將90只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為三組：非藥物處理組，毒素處理組，治療組，各組30只。毒素處理組、治療組均以PQ（25 mg/kg）一次性腹腔注射染毒，治療組予每天1次pHGF（50 μg/kg）腹腔注射，持續(xù)至第7天。各組于注射后第1、3、7天時(shí)間點(diǎn)處死相同數(shù)目大鼠，觀察各組病理學(xué)變化，并收集血清及肺組織用于相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)分析。 結(jié)果 與非藥物處理組比較，毒素處理組各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)脈氧分壓（PaO2）均有不同程度下降，治療組第1、3天相比毒素處理組PaO2有所改善（P < 0.05），第7天與毒素處理組比較，PaO2改善不明顯（P > 0.05）；毒素處理組較非藥物處理組肺組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及血清TNF-α水平明顯增高（P < 0.01），而血清超氧化物歧化酶（SOD）活力明顯降低（P < 0.01）；各時(shí)間點(diǎn)治療組較毒素處理組肺組織中Bax蛋白表達(dá)及血清TNF-α水平降低（P < 0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平及血清SOD活力升高（P < 0.05）。 結(jié)論 pHGF對(duì)百草枯中毒大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)降低炎性反應(yīng)、減少氧化損傷、抑制細(xì)胞凋亡來(lái)減輕肺損傷程度。

[關(guān)鍵詞] 促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素；百草枯中毒；肺；細(xì)胞凋亡；凋亡相關(guān)蛋白

[中圖分類(lèi)號(hào)] R563 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（c）-0029-04

[Abstract] Objective To observe the effect of hepatocyte growth-promoting factor （pHGF） on the protein expression of Bcl-2 and Bax in lung tissue and serum tumor necrosis factor α （TNF-α） level in acute paraquat poisoning rats. Methods According to random number table， 90 SD rats were randomly divided into three groups： non drug treated group， venoms group， treatment group， with 30 rats in each group. The venoms groups and treatment group were treated with PQ （25 mg/kg） by a single intraperitoneal injection， treatment group was given pHGF （50 μg/kg） by intraperitoneal injection， once a day， for seventh days. A same number of the rats were sacrificed at the 1st day， 3rd day and 7th day， and the pathology change and the related indexes of each group in serum and lung tissue were observed. Results Compared with non drug treated group， PaO2 of the venoms group was decreased inordinately at each time point. Compared to poisoning group， the PaO2 of treatment group was improved at the 1st and 3rd day （P < 0.05）， the seventh day had no obvious change （P > 0. 05）. Compared with non drug treated group， the protein expression of Bcl-2 and Bax in lung tissue and serum TNF-α level in venoms group were significantly increased （P < 0.01）， whereas，the serum SOD activity was decreased obviously （P < 0.01）. Compared with poisoning group， Bax protein expression in lung tissue and serum TNF-α level were decreased （P < 0.05） and Bcl-2 protein expression and serum SOD activity were increased （P < 0.05） in treatment group at each time point. Conclusion pHGF can reduce the damage degree of lung tissue by reducing inflammation， reducing oxidative damage and inhibiting apoptosis.

[Key words] Hepatocyte growth-promoting； Paraquat poisoning； Lung； Cell apoptosis； Apoptosis-related protein

百草枯（PQ）是一種常見(jiàn)的劇毒性觸殺型除草劑，在體內(nèi)可以導(dǎo)致多個(gè)器官的損傷。肺是PQ中毒的主要靶器官[1]，常表現(xiàn)為早期的急性肺損傷及后期的肺纖維化[2]。PQ中毒機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞氧化損傷、炎癥/細(xì)胞因子失調(diào)及細(xì)胞凋亡均證明參與了PQ中毒過(guò)程[3-4]。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（pHGF）是一種多功能細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、血管生成及抗細(xì)胞調(diào)亡、修復(fù)損傷組織等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[5]。研究證明，pHGF通過(guò)阻止肺泡細(xì)胞的調(diào)亡、促進(jìn)肺泡細(xì)胞的再生及肺血管的生成提高大鼠的運(yùn)動(dòng)耐量、氣體交換[6]。本研究通過(guò)PQ染毒大鼠建立肺損傷模型，探討pHGF對(duì)PQ中毒大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物

20%PQ水溶液，由先正達(dá)南通作物保護(hù)公司提供；pHGF注射液（規(guī)格：2 mL∶30 μg，批號(hào)：1505029），購(gòu)自威海賽洛金藥業(yè)有限公司；Bax免疫組化試劑盒（批號(hào)：160708254ZC2）、Bcl-2免疫組化試劑盒（批號(hào)：160509660A）、免疫組化抗體稀釋液（批號(hào)：160615452f）、二抗試劑（批號(hào)：2017049）及DAB顯色劑試劑盒（批號(hào)：160509660A），購(gòu)自上海邁新生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（批號(hào)：8260243）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：20160602），購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物

90只SPF級(jí)健康成年SD大鼠，雌雄各半，日齡50～60 d，體重（200±20）g，購(gòu)于桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2013-0001，批號(hào)：45000800000021，飼養(yǎng)條件：晝夜規(guī)律，溫度18～25℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.3 動(dòng)物模型的建立及分組

將90只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組：非藥物處理組，毒素處理組，治療組，各組30只。各組以第1、3、7天為觀察點(diǎn)。毒素處理組、治療組均以PQ（25 mg/kg）一次性腹腔注射染毒后，予治療組每天1次pHGF（50 μg/kg）腹腔注射，持續(xù)至第7天，非藥物處理組、毒素處理組注射等量生理鹽水作為對(duì)照。

1.4 取材及樣品制備

各組于第1、3、7天時(shí)間點(diǎn)取相同數(shù)目大鼠，以3 mL/kg的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，以胸腹正中線為切口，暴露心臟于心尖搏動(dòng)處進(jìn)針采血，并分離肺臟取肺組織固定于10%中性福爾馬林溶液48 h后，常規(guī)石蠟包埋，備于HE染色及免疫組化檢測(cè)。

1.5 動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）檢測(cè)及方法

采取0.3 mL動(dòng)脈血置于抗凝管內(nèi)，半小時(shí)內(nèi)送往桂林市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，血?dú)夥治鰞x檢測(cè)PaO2。

1.6 SOD、TNF-α測(cè)定及方法

將血漿于低溫下經(jīng)離心半徑10 cm、3000 r/min離心20 min后，取上層清液血清，按照SOD、TNF-α試劑盒的步驟要求操作，分別應(yīng)用水溶性四氮唑（WST-1）法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)SOD活力、TNF-α水平。

1.7 病理學(xué)檢查及方法

常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理組織學(xué)改變。

1.8 肺組織Bcl-2、Bax表達(dá)檢測(cè)及方法

將肺組織切片按照說(shuō)明書(shū)操作，應(yīng)用免疫組織化學(xué)（二步法）檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果判斷：細(xì)胞漿或細(xì)胞膜有棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性表達(dá)，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（10×40）觀察下，根據(jù)染色細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)目及染色程度對(duì)Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行半定量分析[7-8]：不著色者為0分，著色淺黃為1分，著色棕黃為2分，著色棕褐為3分；著色范圍<5%計(jì)為0分，5%～<25%計(jì)為1分，25%～<50%計(jì)為2分，50%～ <75%計(jì)為3分，75%～100%計(jì)為4分；將每組各張切片的著色程度及著色范圍分?jǐn)?shù)相加為計(jì)為最后分?jǐn)?shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，利用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，組間兩兩對(duì)比LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PaO2變化

與非藥物處理組比較，毒素處理組各時(shí)間點(diǎn)PaO2值均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；治療組第1、3天PaO2值較毒素處理組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其中第3天差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），第7天PaO2值與毒素處理組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 血清SOD活力改變

與非藥物處理組比較，毒素處理組各時(shí)間點(diǎn)血清SOD水平均顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；治療組與毒素處理組比較，各時(shí)間點(diǎn)血清SOD水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其中第3天差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 血清TNF-α水平變化

與非藥物處理組比較，毒素處理組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平均顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；與毒素處理組比較，治療組各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

非藥物處理組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，壁清晰完整，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)滲出，肺間質(zhì)正常，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。毒素處理組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)滲出，肺間質(zhì)水腫，肺間隔顯著增寬，局部可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以第3天改變最明顯，第3天后，上述改變減輕。治療組表現(xiàn)為不同程度的肺泡炎改變，但肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺間隔增寬及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均較毒素處理組改善。見(jiàn)圖1。2.5 各組肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況

非藥物處理組可見(jiàn)少量Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，主要分布在肺支氣管、肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)。與非藥物處理組比較，毒素處理組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。與毒素處理組比較，治療組Bcl-2蛋白在肺組織內(nèi)表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01或P < 0.05），Bax蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表2及圖2～3（封三）。

3 討論

pHGF是一種肝源性的生物活性小分子物質(zhì)，主要應(yīng)用于肝功能損害的輔助治療[9]。pHGF可以促進(jìn)HGF的表達(dá)，HGF是一種肺營(yíng)養(yǎng)因子，具有促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)肺血管生成、肺泡上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，改善肺部炎癥及調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞凋亡的作用[10-12]。

低氧血癥是衡量急性肺損傷程度及PQ中毒患者預(yù)后的重要因素[13]。本研究結(jié)果顯示，毒素處理組大鼠各時(shí)間點(diǎn)PaO2出現(xiàn)不同程度下降，其機(jī)制可能與PQ中毒后大鼠肺泡細(xì)胞功能降低，肺組織充血水腫，肺泡間隔增寬及部分肺泡壁塌陷導(dǎo)致通氣血流比失調(diào)有關(guān)；治療組較毒素處理組，大鼠PaO2在第1、3天有一定程度的改善，提示pHGF對(duì)早期PQ中毒大鼠的低氧血癥具有一定的改善功能，第7天PaO2改善不明顯（P > 0.05），可能與大鼠肺內(nèi)炎性滲出液吸收、減少，肺纖維化啟動(dòng)，肺功能暫時(shí)改善相關(guān)。

SOD是體內(nèi)清除氧自由基（ROS）的重要酶之一，將ROS轉(zhuǎn)化為H2O2、O2，當(dāng)PQ誘發(fā)肺組織細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS超出SOD清除能力，機(jī)體的氧化-抗氧化體系失衡，檢測(cè)SOD活性反映了機(jī)體清除ROS的能力，可作為PQ中毒患者的預(yù)測(cè)因子[14-15]。TNF-α是炎性反應(yīng)的始動(dòng)因子，可以增加炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，分化并促進(jìn)其他細(xì)胞因子、炎癥遞質(zhì)的表達(dá)及分泌，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，改變宿主的免疫應(yīng)答能力[16]。研究證明，TNF-α與PQ中毒患者的預(yù)后存在相關(guān)性，對(duì)判斷患者病情嚴(yán)重程度及轉(zhuǎn)歸具有預(yù)測(cè)作用[17]。本研究結(jié)果顯示，毒素處理組SOD水平明顯降低，TNF-α水平明顯增高，提示細(xì)胞的氧化損傷、炎性反應(yīng)參與了PQ中毒引起肺損傷過(guò)程。治療組各時(shí)間點(diǎn)SOD出現(xiàn)升高，TNF-α水平降低，提示pHGF能通過(guò)清除ROS發(fā)揮抗氧化作用，并對(duì)機(jī)體的炎性反應(yīng)具有抑制作用。

細(xì)胞凋亡是PQ中毒所致急性肺損傷的一個(gè)非常重要的過(guò)程，PQ可以激活Bcl-2家族不同成員觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C釋放發(fā)生細(xì)胞凋亡，Bcl-2為抗凋亡調(diào)節(jié)蛋白，Bax為促凋亡蛋白，兩者形成一個(gè)凋亡調(diào)控系統(tǒng)[18-20]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白在肺組織中的表達(dá)，采用Remmele等[21]提出的兼顧陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度的四級(jí)分級(jí)法進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示毒素處理組較非藥物處理組肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，證明Bcl-2、Bax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與PQ中毒引起的肺損傷過(guò)程。予pHGF干預(yù)后，治療組肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bax蛋白表達(dá)減弱，提示pHGF抑制了肺組織內(nèi)細(xì)胞的凋亡，主要通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)及減少促凋亡Bax蛋白表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，pHGF對(duì)PQ中毒大鼠急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕細(xì)胞氧化損傷、抑制機(jī)體炎性反應(yīng)及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Yang H，Wen Y，Bin J，et al. Protection of bone marrow mesenchymal stem cells from acute lung injury induced by paraquat poisoning [J]. Clin Toxicol，2011，49（4）：298-302.

[2] 舒維，陳文龍，謝姝，等.硫化氫對(duì)百草枯中毒大鼠急性肺損傷及炎癥介質(zhì)的影響[J].江西醫(yī)藥，2016，51（11）：1162-1164.

[3] Wang X，Luo F，Zhao H. Paraquat-induced reactive oxygen species inhibit neutrophil apoptosis via a p38 MAPK/NF-κB-IL-6/TNF-α positive-feedback circuit [J]. PLoS One，2014，9（4）：e93837.

[4] Dusinská M，Kovaciková Z，Vallová B，et al. Responses of alveolar macrophages and epithelial type Ⅱ cells to oxidative DNA damage caused by paraquat [J]. Carcinogenesis，1998，19（5）：809-812.

[5] 丁文捷，孫書(shū)珍.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體與腎臟疾病[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2009，24（2）：145-147.

[6] Shigemura N，Sawa Y，Mizuno S，et al. Amelioration of pulmonary emphysema by in vivo gene transfection with hepatocyte growth factor in rats [J]. Circulation，2005，111（11）：1407-1414.

[7] 孟愛(ài)紅，陳芝蕓，嚴(yán)茂祥.銀杏葉提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27（10）：2095-2097.

[8] 肖欣.VEGF與MMP-9在口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[D].吉林：吉林大學(xué)，2016.

[9] 王乾蘭.我國(guó)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的研究和應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志，2005，25（S1）：7-11.

[10] 周丹，呂福禎，陳英準(zhǔn).促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)肺纖維化大鼠的干預(yù)作用及其途徑[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10（37）：74-77.

[11] Narasaraju T，Yang E，Samy RP，et al. Combination Therapy with Hepatocyte Growth Factor and Oseltamivir Confers Enhanced Protection Against Influenza Viral Pneumonia [J]. Curr Mol Med，2014，14（5）：690-702.

[12] 畢寧康，岳屹囡.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)腎缺血-再灌注大鼠肺損傷的影響[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，30（3）：185-188.

[13] Huang C，Zhang X. Prognostic significance of arterial blood gas analysis in the early evaluation of paraquat poisoning patients [J]. Clin Toxicol，2011，49（8）：734-738.

[14] 趙揚(yáng)，謝繼，楊志洲，等.血清髓過(guò)氧化物酶、丙二醛和超氧化物歧化酶水平對(duì)百草枯中毒患者的預(yù)后價(jià)值研究[J].臨床急診雜志，2016，17（1）：22-25.

[15] 朱宏飛，馮丹，姚尚龍，等.大潮氣量機(jī)械通氣對(duì)大鼠肺組織急性炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，39（1）：59-63.

[16] 唐文姣.百草枯中毒患者血清細(xì)胞因子與抗氧化能力相關(guān)性分析[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（27）：25-26.

[17] 龔媛，張浩，李曉莉，等.急性百草枯中毒早期患者細(xì)胞因子與動(dòng)脈血?dú)夥治鯷J].中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2014，27（4）：279-280.

[18] Cai Q，Lu Z，Hong G，et al. Recombinant adenovirus Ad-RUNrf2 reduces paraquat-induced A549 injury [J]. Hum Exp Toxicol，2012，31（11）：1102-1112.

[19] 高艷敏，趙雄，丁佳，等.百草枯中毒大鼠的肝損傷及抗氧化藥物對(duì)其保護(hù)作用[J].肝臟，2009，14（3）：210-213.

[20] Kastelan M，Massari LP，Brajac I. The role of Bcl-2 family proteins in psoriasis [J]. Lijecnicki Vjesnik，2010， 132（1/2）：31-33.

[21] Remmele W，Stegner HE. Recommendation for uniform definition of an immunoreactive score（IRS）for immuno？鄄histochemical estrogen receptor detection（ER-ICA）in breast cancer tissue [J]. Der Pathologe，1987，8（3）：138-140.

（收稿日期：2017-01-06 本文編輯：張瑜杰）