葛含靜，楊苗苗

（陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，陜西西安710100）

一株纖維素高產(chǎn)菌株的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

葛含靜，楊苗苗

（陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，陜西西安710100）

從實(shí)驗(yàn)室自制醋中篩選出1株纖維素高產(chǎn)菌株J2，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定，確定為漢森氏葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter hansenii，GenBank登錄號(hào)為GU213109）。通過PB（Plackett-Burman）和BB（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化菌株J2的發(fā)酵培養(yǎng)條件，結(jié)果表明，培養(yǎng)基中酵母膏和無水乙醇的含量對(duì)BC（細(xì)菌纖維素，bacterial cellulose）產(chǎn)量影響極顯著，ZnSO4的含量影響顯著。通過多元二次方程方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，表明所建模型與實(shí)際擬合良好，且發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后配方中酵母膏3.3 g/L，ZnSO40.9 g/L，無水乙醇0.7%；使用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，菌株J2的BC產(chǎn)量增加到10.41 g/100 mL，提高了22.18%。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明，菌株J2最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d，BC產(chǎn)量可達(dá)12g/100mL。

細(xì)菌纖維素；鑒定；發(fā)酵條件

纖維素是地球上最豐富的大分子材料，它與人們的衣食住行息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，自然界絕大部分纖維素由植物的光合作用產(chǎn)生，但某些微生物可通過異養(yǎng)作用產(chǎn)生胞外纖維素，即細(xì)菌纖維素（bacterial cel－lulose，BC）。BC僅由β-1，4-D-吡喃葡萄糖一種單體聚合而成，不摻雜其他任何形式的糖，故而其純度極高[1-2]。與常見的植物纖維相比，BC機(jī)械強(qiáng)度高、吸水保水率高、生物適應(yīng)性良好，是性能最好的纖維素，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、造紙、聲學(xué)器材、石油開采等許多領(lǐng)域[3]。

目前，BC的合成研究主要圍繞培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)與改造、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化、菌株的代謝工程改造、高產(chǎn)菌株的自然選育及誘變選育等展開。Hornung等[4-5]研制出一種內(nèi)含噴霧裝置的反應(yīng)器，可把營(yíng)養(yǎng)成分和氧氣噴灑到BC表面，使BC產(chǎn)量大大提高。Hwang等[6]通過優(yōu)化培養(yǎng)基溶氧濃度，使BC產(chǎn)量最高可達(dá)15 g/L（干重）。Carolina等[7]克隆了Ga.hansenii ATCC23769纖維素合成酶操縱子中的部分基因，并過表達(dá)這些基因以期提高BC產(chǎn)量。馬承鑄[8]和賈士儒[9]分別通過自然選育獲得了BC高產(chǎn)菌株。余曉斌等[10]和楊甲平[11]分別通過紫外誘變和高靜水壓誘變方法實(shí)現(xiàn)了BC高產(chǎn)突變株的成功選育。盡管BC生物合成的研究在各個(gè)方面都取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但從源頭上自然篩選出性能穩(wěn)定的BC高產(chǎn)菌株、優(yōu)化其發(fā)酵條件、表征所產(chǎn)BC性能指標(biāo)，仍具有重要的研究意義。本研究對(duì)前期成功篩選的1株性能優(yōu)良的BC高產(chǎn)菌株J2進(jìn)行分類鑒定，然后優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，使BC產(chǎn)量大大提高，為后續(xù)通過誘變或基因工程方法選育優(yōu)良的BC產(chǎn)生菌株奠定了基礎(chǔ)，也可為BC的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

蕎麥醋：陜西學(xué)前師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院綜合實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA marker、Ex Taq酶：日本TakaRa公司；DNA膠純化及回收試劑盒：美國(guó)Amersham Biosciences公司；細(xì)菌16S rRNA通用擴(kuò)增引物F9/R1510及測(cè)序引物F9，R1510和F520[12]：上海生工（Sangon Biotech）合成；其它試劑均為分析級(jí)或生物級(jí)。

1.3 主要培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖70 g/L，酵母膏10 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 15 g/L，無水乙醇2%。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 10 g/L，無水乙醇2%。

所有培養(yǎng)基均在121℃高壓滅菌15 min后備用。

2 方法

2.1 菌種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：取活化菌體，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)；同時(shí)，取活化菌體，接種于種子培養(yǎng)基平板，30℃恒溫培養(yǎng)3 d～5 d，觀察菌落形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：提取BC產(chǎn)生菌基因組DNA，以之為模板，F(xiàn)9/R1510為引物擴(kuò)增16S rRNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工測(cè)序。序列在國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI）中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，用MEGA4繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定其生物學(xué)地位。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)：根據(jù)筆者前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取葡萄糖/蔗糖、酵母膏、FeSO4、ZnSO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、蘋果酸和無水乙醇等8個(gè)因素為發(fā)酵生產(chǎn)BC的關(guān)鍵影響因素設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)，因素水平及編碼見表1。

表1 PB試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1Levels and code of variables for PB design

以所產(chǎn)BC濕重為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用Design Expert分析數(shù)據(jù)及建立模型。

Box-Behnken（BB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)：選取PB試驗(yàn)確定的顯著影響B(tài)C產(chǎn)量的因素，即酵母膏、ZnSO4、無水乙醇，為BB試驗(yàn)考察的變量，因素水平及編碼見表2。

表2 BB試驗(yàn)因素水平及編碼表Table 2Levels and code of variables for BB design

3 結(jié)果與討論

3.1 菌種鑒定

菌株J2細(xì)胞形態(tài)（×1000）和菌落形態(tài)見圖1。

圖1 菌株J2細(xì)胞形態(tài)（×1000）和菌落形態(tài)Fig.1Cell shape and colony shape（×1000）of strain J2

形態(tài)學(xué)特征如圖1，J2菌體細(xì)胞呈桿狀，單個(gè)或成對(duì)，大小為（2.12 μm～4.18 μm）×（0.81 μm～0.92 μm）；菌落為圓形，不透明的乳白色，表面光滑但有凸起，大小為0.9 mm～1.4 mm。對(duì)照《微生物學(xué)試驗(yàn)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步確定菌株J2為醋酸桿菌屬。

菌株J2的16S rRNA基因凝膠電泳圖見圖2，菌株J2的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖2 菌株J2的16S rRNA基因Fig.216S rRNA genes of strain J2

圖3 菌株J2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3Phylogenetic tree of strain J2

分子生物學(xué)鑒定如圖2和圖3，對(duì)菌株J2的16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可知，菌株J2與菌株Ga.hansenii NBRC14817、Ga.hansenii NBRC14816和Ga.hansenii NBRC14820同枝，相似度達(dá)100%。此方法是通過分析生物的決定表型特征的遺傳特征DNA或RNA進(jìn)而得到生物的遺傳相關(guān)性，故而更客觀可信。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，可以確定，菌株J2是漢森氏葡糖醋桿菌（Ga.hansenii）。

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

3.2.1 主要影響因素的篩選

3.2.1.1 PB試驗(yàn)

PB試驗(yàn)主效應(yīng)分析見表3。

表3 PB試驗(yàn)主效應(yīng)分析Table 3Analysis of the main effects for the PB design

由表3可知，在菌株J2發(fā)酵生產(chǎn)BC的所有影響因素中，酵母膏和無水乙醇對(duì)BC產(chǎn)量影響極顯著，ZnSO4影響顯著。因此，選擇這3個(gè)因素作為菌株J2發(fā)酵生產(chǎn)BC的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行BB試驗(yàn)。

3.2.1.2 BB試驗(yàn)

BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表4。

表4 BB設(shè)計(jì)及BC產(chǎn)量Table 4BB design and yield of BC

多項(xiàng)式擬合可得BC產(chǎn)量Y對(duì)自變量無水乙醇x1、酵母膏x2、ZnSO4x3的回歸方程為：Y=9.38+1.36x1+ 0.78x2-0.44-0.97-0.60-0.42x1x3。

發(fā)酵培養(yǎng)基多元二次方程方差分析見表5，發(fā)酵培養(yǎng)基回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表6。

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基多元二次方程方差分析表Table 5Anova table for the regression equation of cultivation

表6 發(fā)酵培養(yǎng)基回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6Regression coefficients and significance of the cultivation

由表5可知，所建模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值高度相關(guān)，說明該模型與實(shí)際擬合良好，可用于菌株J2發(fā)酵生產(chǎn)BC的分析和預(yù)測(cè)。

由表6可知，在模型參數(shù)中，x1、x3、x12、x22對(duì)BC產(chǎn)量影響極顯著，x32，以及x2和x3之間的交互作用對(duì)BC產(chǎn)量影響顯著。對(duì)方程各自變量（x1、x2、x3）求極值，得到極值點(diǎn)為：x1=0.310，x2=-0.151，x3=1，即酵母膏3.3 g/L，ZnSO40.9 g/L，無水乙醇0.7%。在此最優(yōu)條件下，預(yù)測(cè)BC的最大產(chǎn)量為9.12 g/100 mL。用預(yù)測(cè)的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方做驗(yàn)證試驗(yàn)，所得BC產(chǎn)量為10.41 g/100 mL，證明所建模型能夠預(yù)見菌株J2的實(shí)際發(fā)酵情況。菌株J2的BC產(chǎn)量是優(yōu)化前的（8.52 g/100 mL）1.22倍。

3.2.2 動(dòng)力學(xué)曲線

菌株J2產(chǎn)BC動(dòng)力學(xué)曲線見圖4。

圖4 菌株J2產(chǎn)BC動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4Kinetic curve of BC-producing of strain J2

由圖4可知，菌株J2靜態(tài)發(fā)酵2 d后，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從第7天開始進(jìn)入穩(wěn)定期，此后BC產(chǎn)量增長(zhǎng)緩慢。所以，最佳發(fā)酵時(shí)間可確定為7 d。

4 結(jié)論

本研究對(duì)前期篩選的BC高產(chǎn)菌株J2鑒定，確定為漢森氏葡糖醋桿菌（Ga.hansenii，GenBank登錄號(hào)為GU213109）。通過PB和BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化菌株J2的發(fā)酵培養(yǎng)條件，結(jié)果表明，培養(yǎng)基中酵母膏和無水乙醇的含量對(duì)BC產(chǎn)量影響極顯著，ZnSO4的含量影響顯著；BC產(chǎn)量Y對(duì)自變量無水乙醇x1、酵母膏x2、ZnSO4x3的回歸方程為Y=9.38+1.36x1+0.78x2-0.44x12-0.97x22-0.60x32-0.42x1x3。通過發(fā)酵培養(yǎng)基多元二次方程方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，表明所建模型與實(shí)際擬合良好，且發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后配方中酵母膏3.3 g/L，ZnSO40.9 g/L，無水乙醇0.7%；使用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，菌株J2的BC產(chǎn)量增加到10.41 g/100 mL，提高了22.18%；發(fā)酵動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明，菌株J2最佳發(fā)酵時(shí)間為7 d，此時(shí)，BC產(chǎn)量約達(dá)12 g/100 mL。

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Identification and Fermentation Conditions Optimizing of A High-yield Bacterial Cellulose-producing Strain

GE Han-jing，YANG Miao-miao
（College of Life Science and Food Engineering，Shaanxi Xueqian Normal University，Xi'an 710100，Shaanxi，China）

A high-yield bacterial cellulose（BC）-producing strain named J2 was isolated from lab homemade vinegar.It was identified as Gluconacetobacter hansenii（GenBank accession GU213109）by morphological characteristics and molecular biological identification.Additionally，the fermentation conditions of strain J2 were studied by PB and BB experiments.The results showed that the contents of yeast extract and anhydrous alcohol had extremely significant influence on BC yield.Moreover，the data of regression equation of cultivation and regression coefficients and significance of the cultivation indicated that the established model agreed well with the practice，and the optimum fermentation medium contained yeast extract 3.3 g/L，ZnSO40.9 g/L and anhydrous alcohol 0.7%.Under the optimum fermentation conditions，BC yield could reach to 10.41 g/100 mL，which increased by 22.18%.Finally，the results of fermenting kinetic experiment showed that the optimum fermentation time was 7 d，and BC yield was about 12 g/100 mL at this time.

bacterial cellulose；identification；fermentation conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.038

2016-08-08

陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2016JQ3036）；陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目（2012JC03）；陜西省科技廳農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目（2016NY-204）；陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（15JK1183）

葛含靜（1981—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：糧食加工與發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新。