王越,呂鑫,郭煒

(山西大學 化學化工學院,山西 太原 030006)

一種選擇性生物硫醇熒光探針

王越,呂鑫,郭煒*

(山西大學 化學化工學院,山西 太原 030006)

利用生物硫醇獨特的親核性,以5(6)-羧基羅丹明為熒光團,7-硝基苯呋咱基團為硫醇反應單元,構(gòu)建了一個生物硫醇熒光探針。該探針具有良好的水溶性,在PBS緩沖中能選擇性檢測半胱氨酸,熒光增強240倍,檢出限可達2.8×10-8mol/L。

熒光探針;生物硫醇;5(6)-羧基羅丹明;7-硝基苯呋咱

0 引言

半胱氨酸(Cys),同型半胱氨酸(Hcy)以及還原型谷胱甘肽(GSH)等生物硫醇在維持細胞內(nèi)氧化還原平衡、信號傳導、基因調(diào)控等諸多生理過程中扮演了重要角色[1-3],其不正常的表達與許多疾病相關。例如,人體內(nèi)半胱氨酸水平的異?？梢鹕L緩慢、水腫、嗜睡、肝功能損傷、肌肉松弛和肥胖等[4-6],同型半胱氨酸水平的異常與某些先天性疾病、老年認知障礙、心血管病、阿爾茨海默氏病有關[7-9],谷胱甘肽的濃度異常與癌癥、阿爾茨海默氏癥和心血管等疾病密切相關[10-14]。因此,開發(fā)高選擇性檢測生物硫醇的檢測方法對研究生物硫醇的生理病理功能具有重要意義。傳統(tǒng)的生物硫醇檢測方法主要有電化學法與高效液相色譜法,但此類方法操作煩瑣,并且對樣品具有破壞性,因而不適于生物樣品內(nèi)生物硫醇的實時檢測。相比之下,熒光探針法具有操作簡單、高靈敏度、檢出限低、可視化、非侵入性等優(yōu)點[15],因此在生物硫醇的檢測和生物影像方面具有獨特的優(yōu)勢。

許多化學反應能被用來構(gòu)建選擇性生物硫醇熒光探針。這些反應主要利用了生物硫醇的親核反應性,包括與醛基的環(huán)化反應[16]、邁克爾加成反應[17]、磺酰胺與磺酸酯的裂解反應[18]、親核取代反應[19]、二硫鍵交換反應[20]、裂解NBD醚[21-23]等[24]。盡管許多生物硫醇熒光探針近年來被陸續(xù)報道,但仍然存在合成煩瑣、靈敏度低、水溶性差等缺點。本文設計并合成了一種基于裂解7-硝基苯呋咱(NBD)胺機理的硫醇熒光探針1,該探針以5(6)-羧基-羅丹明為信號單元,7-硝基苯呋咱作為硫醇識別單元。由于存在由熒光團到識別單元的d-PET過程,探針幾乎沒有熒光,加入硫醇后,NBD胺單元被硫醇裂解,從而釋放出羅丹明信號單元,產(chǎn)生強的紅色熒光。探針1的結(jié)構(gòu)及對硫醇的傳感機理如圖1所示。

Fig.1 Structure and sensing mechanism of probe 1 for biothiols.圖1 探針1的結(jié)構(gòu)及生物硫醇傳感機理

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

熒光光譜儀Hitach F-7000,紫外-可見分光光度計Varian Carry-4000,核磁共振儀Bruker-600 MHz,質(zhì)譜儀Varian QFT-ESI。DMF為色譜純,其余所用試劑均為分析純試劑,水為去離子水。

1.2 探針1的合成

主體化合物的合成步驟如下:

氮氣保護下,將7-羥基-1,2,3,4-四氫喹啉 (1.12 g, 7.5 mmol) 溶解于20 mL甲醇中,然后加入4-氯-7-硝基苯呋咱(1.00 g,5 mmol),加熱回流反應4 h。冷卻后旋干溶劑,柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)得到暗紅色固體化合物3(0.31 g, 1.0 mmol), 產(chǎn)率20%。1H-NMR (DMSO-d6, 600MHz) δ (ppm): 9.41 (s, 1H); 8.55 (d, 1H,J=9.0 Hz); 7.11 (d, 1H,J=8.4 Hz); 7.01 (d, 1H,J=9.0 Hz); 6.74 (d, 1H,J=2.4 Hz); 6,65 (d, 1H,J=2.4 Hz); 4.25 (t, 2H,J=6.6 Hz); 2.71 (t, 2H,J=6.6 Hz); 2.00 (m, 2H,J1=6.6 Hz,J2=12.6 Hz).13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz): 156.1, 146.4, 145.2, 144.8, 140.1, 135.9, 130.5, 124.9, 123.5, 114.2, 110.4, 109.8, 50.9, 25.4, 24.2. ESI-MS: calculated for [M-H]-: 311.07858, found: 311.07858.

將間二乙氨基苯酚(6.6 g, 40 mmol)溶解于500 mL干燥的甲苯中,然后加入1,2,4-苯三酸酐(7.7 g,40 mmol),混合物加熱回流過夜,然后將反應液冷卻至室溫,真空抽濾,濾餅用二氯甲烷洗滌得到黃色固體。粗品化合物經(jīng)柱層析分離(石油醚∶乙酸乙酯=1∶4)得到黃色固體化合物4 (8.2 g,23 mmol),該化合物為異構(gòu)體4a和4b的混合物,產(chǎn)率57%。1H-NMR ((CD3)2CO, 400 MHz) δ(ppm): 8.69 (d, 1H,J=1.6 Hz), 8.31 (dd,1H,J1=8.0 Hz,J2=1.6 Hz), 8.22 (dd, 1H,J1=8.0 Hz,J2=1.6 Hz), 8.16 (d, 1H,J=8.0 Hz), 7.98 (d, 1H,J=1.6 Hz), 7.55(d, 1H,J=8.0 Hz), 6.91(d, 1H,J=9.2 Hz), 6.87 (d, 1H,J=8.8 Hz), 6.21-6.17 (m, 2H), 6.09 (s, 2H), 3.44 (q, 8H,J=7.2 Hz), 1.16 (12H, t,J=7.2Hz). ESI-MS: calculated for [M+H]+: 358.1285, found: 358.1286.

氮氣保護下,將化合物4(0.12 g,0.32 mmol)溶解于3 mL甲磺酸中,然后加入中間體3(0.10 g,0.32 mmol),加熱至100℃反應5 h。冷卻后將反應液倒入100 mL冰水中,緩慢攪拌析出紫黑色固體,過濾,真空干燥,得粗品化合物1。該化合物經(jīng)柱層析分離(二氯甲烷∶甲醇=20∶1),得到紫紅色固體化合物1(0.13 g,0.2 mmol),產(chǎn)率62.5%。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz) δ (ppm): 8.62 (d, 1H,J=8.4 Hz); 8.25 (d, 1H,J=8.4 Hz); 8.13 (d, 1H,J=7.8 Hz); 7.69 (s, 1H); 7.31 (s, 1H); 7.26 (d, 1H,J=8.4 Hz); 6.74 (s, 1H); 6.52 (d, 1H,J=9.0 Hz,); 6.46 (d, 1H,J=9.0 Hz); 6.37 (s, 1H); 4.15 (q, 2H,J=6.0 Hz); 3.39 (q, 4H,J=7.2 Hz); 2.70 (m, 2H,J=6.0 Hz); 1.97 (t, 2H,J=6.0 Hz); 1.08 (t, 6H,J=7.2 Hz).13C-NMR (DMSO-d6, 150MHz): 168.5, 166.6, 152.9, 152.5, 149.9, 149.8, 146.7, 145.1, 144.0, 142.1, 135.7, 131.4, 129.2, 128.3, 128.0, 127.1, 125.6, 124.8, 115.4, 113.2, 110.1, 109.2, 104.2, 97.2, 83.9, 50.6, 44.2, 25.6, 23.6, 12.7. ESI-MS: calculated for [M+H]+: 634.1932; found: 634.1924.

1.3 光譜測定

配制 5 mmol/L探針1的DMF儲備液,將此儲備液用PBS緩沖液(0.01 mol/L,pH=7.4)稀釋到5 μmol/L作為檢測液。將2 mL的檢測液轉(zhuǎn)移至1 cm的石英池中,在室溫下分別加入生物硫醇以及其它氨基酸溶液,混合均勻,放置40 min后進行光譜測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針1與半胱氨酸反應的吸收和熒光光譜研究

圖2為探針1與半胱氨酸作用前后的吸收光譜與熒光光譜。 探針1在360 nm、480 nm、597 nm處顯示了三個主要的吸收峰,加入200 μmol/L的半胱氨酸后,597 nm與480 nm處的吸收峰逐漸減低,并在554 nm處出現(xiàn)新的吸收峰,其強度隨時間逐漸增加,表明該探針與半胱氨酸發(fā)生了反應。498 nm和574 nm 處等吸收點的產(chǎn)生進一步表明該反應產(chǎn)生了穩(wěn)定的產(chǎn)物(圖2a)。在熒光光譜中,探針1本身幾乎沒有任何明顯的熒光發(fā)射,加入半胱氨酸后,在585 nm處出現(xiàn)了一個新的熒光峰,其強度隨時間逐漸增加,約40 min后達到飽和(圖2b)。這些實驗表明探針1與半胱氨酸能夠發(fā)生反應,并且該反應可用于熒光檢測半胱氨酸。

Fig.2 Time-dependent absorption (a) and fluorescence (b) spectra of probe 1(5 μmol/L) in the presence of 40 equiv of Cys. Inset: plot of fluorescence intensity vs reaction time圖2 探針1與半胱氨酸作用前后的紫外-可見吸收光譜 (a)及熒光光譜(b)。插圖:探針在585 nm處的熒光強度隨時間變化圖

為了驗證探針1與半胱氨酸的作用機制,我們使用高分辨質(zhì)譜儀對反應過程進行了監(jiān)測。在質(zhì)譜圖中,測試值m/z=634.192 44對應為探針1的[M+H]+峰(圖3a);加入半胱氨酸后,出現(xiàn)m/z=471.19 183新峰,對應為裂解產(chǎn)物2的M+峰(圖3b)。該結(jié)果與圖1所示機理是一致的。

Fig.3 HRMS chart of probe 1 (a) and probe 1 treated with Cys (b)圖3 探針1(a)以及探針1與半胱氨酸作用后的質(zhì)譜圖(b)

2.2 探針1與半胱氨酸反應的動力學研究

圖4為向含有探針的溶液中加入200 μmol/L的半胱氨酸后,585 nm處的熒光強度隨時間的變化關系圖。利用單指數(shù)函數(shù)關系對其進行擬合可以到反應的準一級反應速率常數(shù)kobs=0.048 min-1,進一步計算得到反應的二級速率常數(shù)k2=4.0 mol/L-1s-1。

Fig.4 Time course experiment of probe 1 (5 μmol/L) reacting with Cys (200 μmol/L) in PBS buffer圖4 探針1(5 μmol/L)與半胱氨酸(200 μmol/L)作用后熒光強度隨時間變化

2.3 探針1對半胱氨酸的檢出限研究

如圖5a所示,在PBS溶液中,探針自身幾乎沒有熒光,加入半胱氨酸后,585 nm處出現(xiàn)新的發(fā)射峰,其熒光強度隨著半胱氨酸的加入(0～220 μmol/L)而逐漸增加,當半胱氨酸的加入量達到200 μmol/L時,熒光強度達到最大。從圖5b中可以發(fā)現(xiàn),在半胱氨酸濃度為0～80 μmol/L范圍內(nèi),熒光強度與半胱氨酸濃度呈良好的線性關系,線性擬合方程為Y=16.160 7X+14.705 1 (Y表示585 nm處的熒光強度,X表示加入半胱氨酸的濃度),R=0.999 4?；谌兜男旁氡?計算得到探針1對半胱氨酸的檢出限為2.8×10-8mol/L。

Fig.5 (a) Fluorescence spectra changes of probe 1(5 μmol/L) treated with Cys (0～220 μmol/L) Inset: plot of fluorescence intensities of probe 1 at 585 nm vs Cys concentrations (b) Liner relationship between the fluorescence intensity and Cys concentrations (0～80 μmol/L)圖5 (a)探針1(5 μmol/L)與不同濃度的半胱氨酸(0～220 μmol/L)作用的熒光光譜變化。 插圖:585 nm處的熒光強度隨半胱氨酸濃度變化點狀圖;(b)585 nm處熒光強度隨半胱氨酸濃度變化線性關系

2.4 探針1的選擇性研究

Fig.6 (a)Fluorescence spectra changes of probe 1(5 μmol/L) treated with various amino acids (200 μmol/L) (b) Fluorescence intensity ratios of probe 1(5 μmol/L) treated with various amino acids (200 μmol/L)圖6 (a)探針1(5 μmol/L)與各種氨基酸(200 μmol/L)作用后的熒光光譜變化;(b)探針1與各種氨基酸作用后的熒光增強響應圖

向探針1的溶液中分別加入200 μmol/L的各種氨基酸后,測定其熒光光譜變化。如圖6a所示,加入各種氨基酸后,只有半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽引起明顯的熒光變化,而其他氨基酸均未引起任何明顯的熒光響應。探針1與半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽作用后,熒光強度分別增加240,36和44倍 (圖6b),表明該探針與這三種生物硫醇的反應活性次序為半胱氨酸>谷胱甘肽>同型半胱氨酸。該差異的產(chǎn)生主要歸咎于三者的巰基具有不同的pKa值,半胱氨酸(～8.2)、同型半胱氨酸(～10.0)、谷胱甘肽(～9.2),即巰基的pKa值越小,則越容易電離出親核性的巰基陰離子,該硫醇的親核性也越強[25]。另外,硫化氫(H2S)作為一種最簡單的生物硫醇在生物體內(nèi)也扮演著重要角色[26],因此我們進一步研究了探針對硫化氫的選擇性。當硫化氫濃度為200 μmol/L時,體系熒光增強約65倍,遠低于對半胱氨酸的240倍,表明探針1能夠選擇性識別生物硫醇,并對半胱氨酸具有最高的選擇性。

2.5 探針1的pH響應研究

Fig.7 Fluorescence intensity at 585 nm of probe 1 (5 μmol/L) in the absence and presence of Cys (200 μmol/L) at varied pH values圖7 pH值對探針1(5 μmol/L)及探針與半胱氨酸(200 μmol/L)作用的影響

如圖7所示,探針1在pH 2-9 范圍內(nèi)熒光均很弱,說明探針在此pH范圍內(nèi)可以穩(wěn)定存在。向體系中加入半胱氨酸后,在pH 6-9 范圍內(nèi)發(fā)生明顯的熒光增強。當pH=7.0時,熒光增強最顯著,說明探針1可以用于生理條件下對半胱氨酸的檢測。

3 結(jié)論

基于硫醇裂解7-硝基苯呋咱(NBD)胺機理,以5(6)-羧基-羅丹明為信號單元,7-硝基苯呋咱為硫醇識別單元,設計合成了一種新的熒光增強型硫醇熒光探針,并通過核磁、質(zhì)譜、熒光光譜、紫外-可見吸收光譜對其進行了表征。該探針對生物硫醇表現(xiàn)出良好的選擇性識別,不受其他氨基酸的干擾,對半胱氨酸的檢出限達到2.8×10-8mol/L。與文獻報道的同類型硫醇熒光探針相比[21-23],該探針具有更好的水溶性及靈敏度,有望用于生物樣品中硫醇的檢測。

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A Highly Selective Fluorescence Probe for Biothiols

WANG Yue,Lü Xin,GUO Wei*

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)

A new biothiol fluorescent probe bearing 5(6)-carboxy-rhodamine as fluorophore and 7-nitro-1,2,3-benzoxadiazole as biothiols reaction group was designed and synthesized based on the thiolysis of 7-nitro-1,2,3-benzoxadiazole (NBD) amine reaction group. The probe is water soluble, and could selectively detect cysteine with a big fluorescence enhancement of 240-fold and a low detection limit of 2.8×10-8mol/L.

fluorescent probe;biothiols;5(6)-carboxy-rhodamine;7-nitro-1,2,3-benzoxadiazole

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.01.021

2016-09-14；

2016-12-08

國家自然科學基金 (21172137; 21302114)

王越(1988- )，男，山西太原人，博士研究生，研究領域為有機化學。E-mail:2006294063@163.com

*通信作者：郭煒(GUO Wei)， E-mail:guow@sxu.edu.cn

O657

A

0253-2395(2017)01-0123-07