唐 榮,張彩麗,孫博文,劉尊英

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

模擬常溫物流下大菱鲆菌相變化規(guī)律與優(yōu)勢腐敗菌鑒定

唐 榮,張彩麗,孫博文,劉尊英*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

以大菱鲆為研究對象,將傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基法和16S rDNA序列分析法相結(jié)合,并通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析,探索模擬常溫物流下大菱鲆的菌相變化規(guī)律及優(yōu)勢腐敗菌。結(jié)果表明:模擬常溫物流下,傳統(tǒng)分析與16S rDNA序列分析均表明,大菱鲆初始菌相與貯藏末期菌相明顯不同。經(jīng)16S rDNA序列、NCBI數(shù)據(jù)庫比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建表明,大菱鲆末期菌相主要有氣單胞菌(Ameromonassp.)、腸桿菌(Enterobacteriaceaesp.)、紅桿菌(Rhodobacteraceaesp.)、發(fā)光桿菌(Photobacteriumsp.)、變形桿菌(Gammaproteobacteriasp.)、希瓦氏菌(Shewanellasp.)、擬桿菌(Bacteroidalessp.)和腈基降解菌(Nitriliruptoraceaesp.),其中氣單胞菌(Aeromonassp.)和腸桿菌中的檸檬酸桿菌(Citrobactersp.)和哈夫尼氏菌(Hafniasp.)為大菱鲆模擬常溫物流下的優(yōu)勢腐敗菌。

大菱鲆,優(yōu)勢腐敗菌,16S rDNA,選擇性培養(yǎng)基

水產(chǎn)品在養(yǎng)殖、加工、貯藏等過程中容易受到物理、化學、微生物等因素的影響而腐敗變質(zhì)。其中,微生物生長和代謝是導致水產(chǎn)品腐敗的主要原因。由于生長環(huán)境、加工過程和貯藏過程的不同,優(yōu)勢腐敗菌能較好地生長并逐漸占優(yōu)勢,導致食品的腐敗[1-2]。因此優(yōu)勢腐敗菌對于預測產(chǎn)品貨架期、控制產(chǎn)品腐敗變質(zhì)具有重要作用。

大菱鲆(Psetta maxima)屬海底層肉食性的鲆鰈魚類[3],1992年,我國開始引進并進行了工廠化養(yǎng)殖[4]。大菱鲆膠質(zhì)蛋白含量高,味道鮮美,營養(yǎng)豐富。近年來隨著大菱鲆產(chǎn)量的不斷增加,大菱鲆物流保鮮問題日益突出。本文采用傳統(tǒng)分析法和16S rDNA序列分析相結(jié)合,探索模擬常溫物流下大菱鲆的菌相變化規(guī)律與優(yōu)勢腐敗菌,以期提高大菱鲆在貯藏過程中的品質(zhì),延長大菱鲆的貨架期,為常溫物流、短途物流提供基礎性研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活大菱鲆 青島市南山水產(chǎn)市場,單只重量(747±47) g,有水充氧快速運輸至實驗室;假單胞菌、氣單胞菌與葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基、鐵瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂 青島海博生物技術有限公司;2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、引物 27f、1492r、TANamp細菌基因組DNA提取盒、DL2000Marker 上海生物工程有限公司。

表1 感官評分標準

LDZX-40型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ系列醫(yī)用型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;SHP-2500型低溫生化培養(yǎng)箱 上海精密宏實驗設備有限公司;真空包裝機 諸城中佳食品包裝機械有限公司;A300基因擴增儀 杭州朗基科學儀器有限公司。

表2 各選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)條件

1.2 實驗方法

1.2.1 大菱鲆的前處理 鮮活大菱鲆于低溫環(huán)境下切斷脊椎放血,去鰓去內(nèi)臟,用自來水沖洗血液與殘留物,置于0～4 ℃冷風中瀝干后,真空包裝。將包裝好的大菱鲆置于泡沫箱(聚氨酯,隔熱系數(shù):0.024 W/M·K,34 cm×30 cm×14 cm)中,每個箱子中放兩條魚,兩個冰袋(質(zhì)量為(428±11) g),按照冰-魚-魚-冰的方式排列,泡沫箱置于25±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏50 h,于貯藏初期(0 h)和貯藏末期(50 h)取樣進行細菌菌相檢測與鑒定,并每隔3～5 h用溫度計測量泡沫箱內(nèi)的溫度變化情況。

1.2.2 感官評價 感官評價標準如表1所示。由7名經(jīng)過標準培訓的感官評價人員對大菱鲆的體表粘液、氣味、肌肉顏色、肌肉彈性、蒸煮后滋味、蒸煮后湯汁形態(tài)進行打分,評分范圍為1～5分,其中1分代表品質(zhì)最差,5分代表品質(zhì)最好,3分代表感官可接受的臨界值。取平均分計入最后結(jié)果。

1.2.3 菌落總數(shù)、TVB-N值 菌落總數(shù)測定方法參照GB 47892-2010;TVB-N值測定方法參照SC/T 3032-2007。

1.2.4 大菱鲆菌相的選擇性培養(yǎng)基分析方法 稱取大菱鲆背部肌肉25 g,置于225 mL生理鹽水中,用滅菌的打漿機均勻打碎,魚肉懸浮后,取下清液,10倍系列梯度稀釋后,用于各菌落計數(shù)。各選擇性培養(yǎng)基分別用于假單胞菌、乳酸菌、氣單胞菌、腸桿菌、葡萄球菌、霉菌酵母菌、菌落總數(shù)的測定,其具體培養(yǎng)條件如表2所示。

1.2.5 16S rDNA高通量測序分析 稱取大菱鲆背部肌肉25 g,置于225 mL生理鹽水中,用滅菌的打漿機均勻打碎。打漿液經(jīng)4層滅菌紗布過濾后8000 r/min離心5 min,棄上清液。取100 mg沉淀物至2 mL離心管,加入200 μL溶菌酶,漩渦混合均勻后37 ℃水浴40 min。按照試劑盒步驟提取DNA,提取的DNA用于PCR擴增和測序。

1.2.6 16S rDNA單一菌落測序分析 選取貯藏末期菌落數(shù)為30～300的平板,根據(jù)菌落基本形態(tài)特征將平板上的菌落分為若干組,并對每組進行計數(shù)。經(jīng)平板純化、NB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)至對數(shù)期后,離心獲得菌體沉淀用于DNA提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳和測序。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 登錄NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),將測序獲得的16S rDNA序列通過BLAST與基因庫中已有的序列進行比對。選取基因庫中與測序片段比對結(jié)果相似度大于98%的序列,通過MEGA5.1進行多重序列比對,構建Neighbor-Joining-analysis(近鄰結(jié)合法)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 統(tǒng)計方法

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)的記錄,采用IBM SPSS Statistics 19軟件中的單因素ANOVA進行顯著性差異(p<0.05)分析,采用Origin8.5軟件作圖,采用MEGA5.1進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬常溫物流下新鮮度指標的測定

2.1.1 模擬常溫物流下溫度的變化 用溫度計對泡沫箱內(nèi)溫度的變化進行監(jiān)控,溫度變化曲線如圖1所示。結(jié)果表明,隨著時間的延長,溫度呈先升高然后平穩(wěn)最后又升高的趨勢。0 h為4 ℃,然后不斷升高,30 h達到18 ℃,平穩(wěn)一段時間后,54 h后繼續(xù)升高至室溫條件。

圖1 貯藏過程中溫度的變化Fig.1 The change of temperature during storage

2.1.2 模擬常溫物流下感官評分的變化 模擬常溫物流下的感官評分結(jié)果如圖2所示。根據(jù)感官評分結(jié)果可知,隨著時間延長,大菱鲆新鮮度逐漸下降,且呈現(xiàn)先緩慢后迅速的趨勢。大菱鲆在0、18、30 h時感官評分較高,新鮮度較好,三者之間沒有顯著性差異(p>0.05);42 h感官評分顯著降低(p<0.05),新鮮度有所下降;54 h感官評分進一步降低,感官評分低于感官評分的臨界值。因此,選擇50 h作為感官可接受的終點。

圖2 貯藏過程中感官評分的變化Fig.2 The change of sensory score during storage注：標注不同字母表示顯著差異(p<0.05)。

2.1.3 模擬常溫物流下菌落總數(shù)的變化 微生物是導致食品腐敗的主要原因[5],每年世界上有三分之一的食品腐敗是由于微生物的作用[6]。模擬常溫物流下菌落總數(shù)變化如圖3所示。隨著時間的延長,菌落總數(shù)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。若以6 logCFU/g為水產(chǎn)品貨架期的標準,則大菱鲆在50 h已達到6 logCFU/g,達到貨架期,這與2.1.2中的感官評分結(jié)果相一致。

圖3 貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig.3 The change of total viable counts during storage

2.1.4 模擬常溫物流下TVB-N值的變化 TVB-N值的增長與多種因素有關,如核酸和游離氨基酸的降解、微生物活動、自溶反應等[7]。模擬常溫物流下TVB-N值如圖4所示。隨著時間的延長,TVB-N值與為微生物增長趨勢一致。以20 mg/100 g 為水產(chǎn)品腐敗的標準,則大菱鲆在50 h左右達到產(chǎn)品貨架期。

圖4 貯藏過程中TVB-N值的變化Fig.4 The change of TVB-N value during storage

總之,感官評分、菌落總數(shù)和TVB-N值結(jié)果均表明,大菱鲆在模擬常溫物流下50 h時達到貨架期的終點。因此選用貯藏50 h作為大菱鲆模擬常溫物流條件下的末期菌相(腐敗菌相)。

2.2 模擬常溫物流下大菱鲆的初始菌相與末期菌相

采用選擇性培養(yǎng)基分析大菱鲆貯藏過程的菌相變化,結(jié)果如圖5與圖6所示。貯藏初期,腸桿菌比例較高,占到了菌落總數(shù)的46.74%,乳酸菌占菌落總數(shù)的7.93%,其余四類菌假單胞菌、氣單胞菌、霉菌酵母菌、葡萄球菌分別占菌落總數(shù)的不足1%。貯藏末期,腸桿菌的比例增長到了69.6%,乳酸菌的種類稍有下降,占菌落總數(shù)的6.83%,假單胞菌的比例增大,占菌落總數(shù)的16.19%,氣單胞菌的比例有所增加,占菌落總數(shù)的0.9%,其余菌的比例為6.48%。

圖5 大菱鲆貯藏初期菌相組成Fig.5 Bacterial flora composition in fresh turbot

圖6 大菱鲆貯藏末期菌相組成Fig. 6 Bacterial flora composition of turbot at the end of the storage

采用16S rDNA高通量測序分析大菱鲆貯藏過程的菌相變化,結(jié)果如表3所示。貯藏初期,腸桿菌、紅桿菌、氣單胞菌比例較高,分別占總數(shù)的50.51%、17.04%、和10.06%。其次是希瓦氏菌、腈基降解菌、擬桿菌和放線菌等;貯藏末期,菌相組成發(fā)生了明顯變化,氣單胞菌和腸桿菌比例較高,分別占總數(shù)的30.37%、28.50%。其次為紅桿菌、發(fā)光桿菌、變形桿菌、希瓦氏菌、擬桿菌和腈基降解菌等。

表3 大菱鲆貯藏過程中的菌相組成

比較選擇性培養(yǎng)與16S rDNA高通量測序的方法,在初始菌相中,兩種分析方法均表明腸桿菌占據(jù)優(yōu)勢,分別占總數(shù)的46.74%和50.51%。貯藏末期,兩種方法的結(jié)果有一定的差異。選擇性培養(yǎng)中,腸桿菌和假單胞菌為優(yōu)勢菌,而16S rDNA高通量測序中氣單胞菌和腸桿菌比例較高。這些差異可能與傳統(tǒng)鑒定方法培養(yǎng)出的生物多樣性偏低,致使部分微生物不能夠檢測出有關[8]。

2.3 模擬常溫物流下大菱鲆優(yōu)勢腐敗菌鑒定

根據(jù)菌落基本形態(tài)特征,如:菌落大小、菌落顏色、菌落透明度、菌落隆起程度、菌落邊緣形態(tài)以及菌落光澤度等的不同,從貯藏末期的平板上共挑取26株菌。經(jīng)過分離純化擴大培養(yǎng)后進行PCR擴增,對擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,PCR產(chǎn)物的電泳條帶清晰穩(wěn)定,重復性好,片段長度約為1600 bp,可以用于16S rDNA的序列分析。

圖7 菌株的16S rDNA電泳圖譜Fig.7 Elevtrophoresis analysis of PCR amplified products of 16S rDNA gene fragments注：M為Maker DL2000,X1、X2、X3分別為 哈夫尼氏菌、檸檬酸桿菌、氣單胞菌。

通過16S rDNA序列分析表明,模擬常溫物流下,大菱鲆的優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌和腸桿菌,分別占到了腐敗末期菌落總數(shù)的30.37%、28.50%(表3)。其中腸桿菌經(jīng)進一步分析,主要菌為檸檬酸桿菌和哈夫尼氏菌,分別占腸桿菌的53%和38%(表4)。

表4 大菱鲆優(yōu)勢腐敗菌腸桿菌組成

2.4 大菱鲆優(yōu)勢腐敗菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

研究認為,同源性≥98%即可認為是同一菌種[9]。由圖8可以看出,X1菌株和吉林檸檬酸桿菌(Citrobacter gillenii)(登錄號:KM515970.1)的同源性最高,可以達到98%,說明X1與吉林檸檬酸桿菌親緣關系最近;X2菌株與蜂窩哈夫尼氏菌(Hafnia alvei genomosp.2)(登錄號:FM179944.1)同源性最高,可以達到96%,說明X2與蜂窩哈夫尼氏菌親緣關系最近;X3菌株與溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)(登錄號:JN555613.1)同源性最高,可以達到99%,說明X3菌株與溫和氣單胞菌親緣關系最近。說明模擬常溫物流下大菱鲆的優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌、檸檬酸桿菌和哈夫尼氏菌。

圖8 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

本研究中的大菱鲆的腐敗菌主要為氣單胞菌、檸檬酸桿菌和哈夫尼氏菌,這與前人在低溫條件下研究的海水魚的優(yōu)勢腐敗菌有所差別。蔣慧亮等[10]研究表明,大菱鲆在0 ℃與25 ℃條件下優(yōu)勢腐敗菌分別為假單胞菌與腐敗希瓦氏菌。Gram等[11]認為冷藏條件下海水魚、氣調(diào)或者真空包裝魚及淡水魚的優(yōu)勢腐敗菌分別為腐敗希瓦氏菌、發(fā)光桿菌和假單胞菌。Surendran等[12]認為相比于溫帶水域細菌組成,熱帶魚類革蘭氏陽性菌與腸桿菌含量偏高。鄭振霄等[13]研究表明,冷水魚冷藏過程中,希瓦氏菌屬與腸桿菌屬在腐敗過程中占主導地位。本研究結(jié)果與這些研究差異的原因可能與貯藏原料不同與貯藏條件不同有關。

3 結(jié)論

模擬常溫物流過程中,泡沫箱加冰環(huán)境的溫度從0 h的4 ℃逐漸上升到30 h的18 ℃,30 h至50 h貯藏末期溫度保持平穩(wěn);結(jié)合傳統(tǒng)分析與16S rDNA序列分析的結(jié)果,最終確定模擬常溫物流下大菱鲆的優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌、檸檬酸桿菌和哈夫尼氏菌。

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Changes of bacterial flora composition and identification of the dominant spoilage bacteria in turbot under simulated of room temperature logistics

TANG Rong,ZHANG Cai-li,SUN Bo-wen,LIU Zun-ying*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Turbots stored under simulated of room temperature logistics were studied in this essay. Selective medium method and 16S rDNA sequence analysis technology were used to study the change of bacterial flora composition in turbot during simulated of room temperature logistics. The results showed that the micro flora composition of turbot were different before and after storage. The 16S rDNA analysis,NCBI database and phylogenetic tree showed that the micro flora composition wereAmeromonassp.、Enterobacteriaceaesp.、Rhodobacteraceaesp.、Photobacteriumsp.、Gammaproteobacteriasp.、Shewanellasp.、Bacteroidalessp.andNitriliruptoraceaesp.. The dominant spoilage bacteria of turbot stored in simulated of room temperature logistics wereAeromonassp.、Citrobactersp.andHafniasp..

Turbot;dominant spoilage organism;16S rDNA;selective medium

2016-07-12

唐榮(1992-),女,碩士生,研究方向：水產(chǎn)品高值化利用,E-mail:956336816@qq.com。

*通訊作者:劉尊英(1974-),女,博士,副教授,研究方向：水產(chǎn)品保鮮與加工,E-mail:naturefoods@163.com。

國家科技型中小企業(yè)科技技術創(chuàng)新基金(14C26213712172)。

TS254.4

A

1002-0306(2017)05-0334-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.055