高 婷詹江華陳 揚(yáng)張愛(ài)華衛(wèi)園園

膽道閉鎖與肝移植專(zhuān)題·論著·

JNK2、TIMP-1及CollagenⅢ在膽道閉鎖肝纖維化中的作用研究

高 婷1詹江華2陳 揚(yáng)1張愛(ài)華2衛(wèi)園園1

目的 研究c—Jun氨基末端激酶2（c—Jun N-terminal kinase，JNK2）、金屬蛋白酶組織抑制劑—1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase 1，TIMP—1）及CollagenⅢ在膽道閉鎖（BA）肝組織中的表達(dá)情況及在肝纖維化進(jìn)程中的作用。 方法 選取膽管擴(kuò)張癥肝活檢病例10例，為膽擴(kuò)組；BA肝活檢病例15例，為BA組；BA晚期因肝功能衰竭而行肝移植患者自體肝活檢10例，為肝移植組。采用HE染色觀察并評(píng)價(jià)肝標(biāo)本纖維化程度；免疫組化染色檢測(cè)JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在肝組織中的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT—PCR）檢測(cè)肝組織中JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ基因表達(dá)情況。 結(jié)果 ①HE染色：膽擴(kuò)組偶可見(jiàn)少許纖維細(xì)胞增生；BA組匯管區(qū)增寬，纖維組織增生、橋接纖維化現(xiàn)象普遍，可見(jiàn)假小葉形成；肝移植組匯管區(qū)明顯增寬，纖維組織增生較重，廣泛橋接纖維組織形成，假小葉顯著。②免疫組化：膽擴(kuò)組JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ表達(dá)為弱陽(yáng)性，BA組及肝移植組JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ蛋白均在肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中陽(yáng)性表達(dá)。③半定量分析：三組JNK2（0.122±0.008、0.182±0.017和0.198±0.033），TIMP—1（0.123±0.009、0.185±0.012和0.201±0.017）和CollagenⅢ（0.126±0.012、0.194±0.008和0.208±0.033）表達(dá)比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；三組中，BA組及肝移植組JNK2、TIMP-1及CollagenⅢ表達(dá)明顯高于膽擴(kuò)組（P＜0.05）；肝移植組JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ蛋白含量與BA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。④qRT—PCR：三組JNK2、TIMP—1和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.221（0.17）vs 1.395（1.22）vs 1.095（1.21），H=17.686，P=0.003；0.439（0.31）vs 1.404（0.85）vs 1.571（0.66），H=20.648，P=0.000；0.917（0.09）vs1.802（1.35）vs1.957（1.30），H=15.555，P=0.007），BA組及肝移植組肝內(nèi)JNK2、TIMP—1及CollagenⅢmRNA表達(dá)含量比膽擴(kuò)組高（P值均小于0.017）。 結(jié)論 JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在BA患兒隨著肝纖維化加重而表達(dá)升高，表明其可能參與并促進(jìn)BA肝纖維化進(jìn)程。

膽道閉鎖；肝硬化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；免疫組織化學(xué)

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是危及嬰幼兒生命的肝膽系統(tǒng)疾病之一，以肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥、纖維性梗阻及膽汁淤積為特點(diǎn)，導(dǎo)致進(jìn)行性肝纖維化和肝硬化，是嬰幼兒時(shí)期肝移植的主要指征［1-2］。BA患兒早期行Kasai手術(shù)雖能緩解膽汁淤積癥狀，但仍有2／3的患兒肝纖維化繼續(xù)進(jìn)展，最終發(fā)展成為肝硬化［3］。有研究證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1（transforming growth factor—β1，TGF—β1）蛋白能夠調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡，TGF-β1／Smads促纖維化通路在BA肝纖維化進(jìn)程中起重要作用［4］；而c—Jun氨基末端激酶2（c-Jun N—terminal kinase，JNK2）對(duì)Smad 2／3蛋白磷酸化等起重要作用［5］；有研究證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitors ofmetalloproteinase—1，TIMP—1）參與肝纖維化過(guò)程中的組織重塑，與肝纖維化程度密切相關(guān)［6］；而CollagenⅢ作為T(mén)GF—β1信號(hào)通路產(chǎn)物，已被證實(shí)在動(dòng)物模型肝纖維化中表達(dá)增多［7］。但以上三種蛋白在BA肝組織中不同纖維化時(shí)期表達(dá)情況尚不十分清晰，本研究旨在檢測(cè)JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ三種蛋白在BA患兒肝組織中的表達(dá)情況，并探討其在BA患兒肝纖維化發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源與分組

本研究收集2014年1月至2016年10月入住天津市兒童醫(yī)院且確診為膽管擴(kuò)張癥的患兒10例（為膽擴(kuò)組），其中男性4例，女性6例，日齡248～2 123 d，平均（1 032±595）d；BA患兒15例（為BA組），其中男性7例，女性8例，日齡19～95 d，平均（54±18）d。另外收集2013年1月至2016年10月在天津市第一中心醫(yī)院行肝移植的患兒（均已行Kasai手術(shù)，后因肝功能衰竭行肝移植）10例（為肝移植組），其中男性6例，女性4例，日齡219～2 176 d，平均（1 033±516）d。本實(shí)驗(yàn)均通過(guò)天津市兒童醫(yī)院及天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，且患兒監(jiān)護(hù)人均簽署了知情同意書(shū)。

二、主要試劑與儀器

TIMP—1一抗工作液，二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔聚合物）、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（3，3—diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。JNK2一抗（1∶200），CollagenⅢ一抗（1∶400）購(gòu)自北京博奧生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT—PCR）引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成，引物序列見(jiàn)表2。主要儀器：IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），手執(zhí)式組織勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）。Fast Quant RTKit（With gDNase）、TRIzol（天根生化公司），Super Real PreMix Plus（SYBR Green）。定量分析所用的ImagePro Plus 5.0自動(dòng)分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Media Cybernetics公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.組織學(xué)檢測(cè)：將蠟塊標(biāo)本連續(xù)4μm切片，分別進(jìn)行HE染色及免疫組化染色。①HE染色。病理切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗，浸染蘇木素5 min，經(jīng)酸化伊紅乙醇液浸染2 min，梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹(shù)膠封片等一系列操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞形態(tài)、肝纖維化程度。②免疫組化染色。病理切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫，PBS緩沖液沖洗5 min×3次，于3%H2O237℃中孵育10 min，再用PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗（JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ），于冰箱中4℃過(guò)夜，次日取出置于室溫，PBS洗5 min×3次，加二抗于37℃下孵育30 min，PBS洗5 min×3次，經(jīng)DAB顯色5～10 min，鏡下觀察染色情況，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，于低倍鏡（×100）下觀察染色（棕色）區(qū)域，高倍鏡（×400）下辨別陽(yáng)性細(xì)胞種類(lèi)及表達(dá)情況。③qRT—PCR。術(shù)中取各組患兒肝右葉前緣為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，置無(wú)菌EP管中儲(chǔ)存在-80℃冰箱，依照TRIzol法研磨并提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，合成cDNA。PCR反應(yīng)體系共20μL，其中包括上、下游引物各0.5μL，cDNA模版1μL，10μL 2×SuperReal PreMix，無(wú)酶水補(bǔ)足到20μL。95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸32 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。分別測(cè)定樣本內(nèi)參（GAPDH）、JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ的基因擴(kuò)增的Ct值，每個(gè)樣本重復(fù)3次，取3次結(jié)果平均值為最終Ct值；ΔCt=每個(gè)基Ct值—內(nèi)參Ct；樣本基因相對(duì)定量=2-ΔCt。

表1 JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ引物序列Table 1 Base sequences of primers for qRT—PCR for JNK2，TIMP—1 and collagenⅢ

四、免疫組化結(jié)果判斷免疫組化陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)［8］

1.定性分析：根據(jù)染色強(qiáng)度分為無(wú)棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽(yáng)性）、棕黃色 （陽(yáng)性）、棕褐色（強(qiáng)陽(yáng)性）。

2.半定量分析：每張切片于陽(yáng)性部位處取5個(gè)不同視野100倍顯微鏡下圖片，經(jīng)IPP（Image proplus）5.0分析圖片計(jì)算JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ蛋白的平均光密度值（AOD），AOD=肝組織陽(yáng)性細(xì)胞光密度總和／陽(yáng)性面積。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，多重比較方差齊性用Bonferroni法，非齊性用Tamhane法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)及四分位數(shù)間距［M（IQR）］表示，多組間比較使用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，多重比較用Bonferroni法進(jìn)行顯著性水平校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HE染色結(jié)果

膽擴(kuò)組肝組織標(biāo)本中可見(jiàn)少許纖維細(xì)胞增生、少量炎癥細(xì)胞；BA組肝組織標(biāo)本中可見(jiàn)肝細(xì)胞變性，偶有壞死，炎細(xì)胞大量增生，匯管區(qū)增寬，纖維組織增生、橋接纖維化普遍，有假小葉形成；肝移植組肝組織標(biāo)本中肝細(xì)胞嚴(yán)重變形、壞死，匯管區(qū)增寬顯著，纖維組織增生較重，廣泛橋接纖維化，假小葉明顯（見(jiàn)圖1）。

二、免疫組化定性分析結(jié)果

JNK2蛋白：在三組肝組織標(biāo)本的肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中均有表達(dá)，在膽擴(kuò)組表達(dá)呈弱陽(yáng)性，在BA組和肝移植組表達(dá)呈陽(yáng)性（圖2A～C）；TIMP—1蛋白：在膽擴(kuò)組肝組織標(biāo)本的肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中呈弱陽(yáng)性表達(dá)；在BA組及肝移植組肝組織標(biāo)本的肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)（圖3A～C）；CollagenⅢ蛋白：在膽擴(kuò)組肝組織標(biāo)本中，僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞胞質(zhì)中有弱陽(yáng)性表達(dá)，而B(niǎo)A組及肝移植組在以上細(xì)胞胞質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)（圖3D～F）。

三、三種蛋白免疫組化半定量分析結(jié)果

JNK2、TIMP—1和CollagenⅢ蛋白在三組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)BA組和肝移植組肝組織標(biāo)本中JNK2、TIMP—1和CollagenⅢ蛋白表達(dá)水平均高于膽擴(kuò)組（P＜0.05），但BA組與肝移植組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞

圖1 各組肝組織標(biāo)本肝纖維化程度比較（HE，×100），A：膽擴(kuò)組；B：BA組；C：肝移植組。黃色箭頭表示肝細(xì)胞空泡樣變；圖2 JNK2在三組肝臟組織標(biāo)本中的表達(dá)情況（IHC，×100），A：JNK2在膽擴(kuò)組的表達(dá)；B：JNK2在BA組的表達(dá)；C：JNK2在肝移植組的表達(dá)。黃色箭頭為膽管上皮細(xì)胞、紅色箭頭為血管內(nèi)皮細(xì)胞、綠色箭頭為肝細(xì)胞； 圖3 TIMP—1及CollagenⅢ在三組肝臟組織標(biāo)本中的表達(dá)情況（IHC，×100），A：TIMP—1在膽擴(kuò)組中的表達(dá)；B：TIMP—1在BA組的表達(dá)；C：TIMP—1在肝移植組的表達(dá)；D：CollagenⅢ在膽擴(kuò)組的表達(dá)；E：CollagenⅢ在BA組的表達(dá)；F：CollagenⅢ在肝移植組的表達(dá)。黃色箭頭為膽管上皮細(xì)胞、紅色箭頭為血管內(nèi)皮細(xì)胞、綠色箭頭為肝細(xì)胞Fig．1 Comparison of fibrosis extent of hepatic tissue specimens among three groups（HE，×100）； Fig．2 Expression patterns of JNK2 in hepatic tissue specimens of three groups（IHC，×100）； Fig．3 The expressions of TIMP-1and CollagenⅢin the liver of three groups（IHC，×100）0.05），見(jiàn)表2。

表2 三組患兒肝內(nèi)JNK2、TIMP—1、CollagenⅢ蛋白半定量表達(dá)Table 2 Semi-quantitative intra-hepatic expressions of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢin three groups

四、肝臟組織標(biāo)本中JNK2、TIMP—1和CollagenⅢmRNA表達(dá)水平比較

JNK2、TIMP—1和CollagenⅢ在三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較發(fā)現(xiàn)BA組及肝移植組肝組織標(biāo)本中表達(dá)水平高于膽擴(kuò)組（P＜0.017），見(jiàn)表3。

表3 三組患兒中JNK2、TIMP—1，CollagenⅢmRNA相對(duì)含量比較［M（IQR）］Table 3 Comparison of expression levels of JNK2 etc.mRNA between three groups M［（IQR）］

討 論

BA患兒以肝內(nèi)外膽管梗阻，肝臟進(jìn)行性炎癥及纖維化為主要病理特征，早期行Kasai手術(shù)可改善膽汁淤積，但不能終止其纖維化進(jìn)程［9］。已有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)TGF—β1信號(hào)通路在BA肝纖維化過(guò)程中起促進(jìn)作用。在BA肝纖維化進(jìn)程中，肝臟內(nèi)TGF—β1信號(hào)通路經(jīng)各種因子刺激下被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Smad 2／3磷酸化，生成磷酸化—Smad 2／3（p—Smad2／3），p—Smad 2／3與Smad 4形成絡(luò)合物，并向細(xì)胞核內(nèi)移動(dòng)，啟動(dòng)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程［2，10-11］。JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ作為T(mén)GF—β1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)蛋白及產(chǎn)物，在肝纖維化中的作用已有研究［5-7］。但其在BA患兒肝臟中的表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)從蛋白水平及基因水平檢測(cè)JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在BA肝內(nèi)表達(dá)情況，探討這幾種因子在BA肝纖維化進(jìn)展的作用。

一、JNK2主要參與TGF—β1信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化及核易位過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。

JNK2是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路中的不同亞型，Jiang Y等研究結(jié)果顯示MAPK信號(hào)蛋白抑制劑通過(guò)阻斷Smad 2／3磷酸化及p—Smad 2／3與Smad 4核易位，阻斷Smad 2／3／4復(fù)合物形成，進(jìn)而導(dǎo)致血漿纖溶酶原激活物抑制劑—1（Plasma plasminogen activator inhibitor—1，PAIχ21）蛋白及mRNA表達(dá)降低，提示JNK2信號(hào)蛋白參與并促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程［12］。p38、ERK1／2蛋白在BA肝纖維化中的作用，已在前期研究中得到證實(shí)［13］。本研究結(jié)果顯示，JNK2在BA患兒肝臟組織中肝細(xì)胞、匯管區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞胞質(zhì)等中陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高，BA組JNK2免疫組化半定量及mRNA表達(dá)量均較對(duì)照組高，提示其可能在BA肝纖維化進(jìn)程中起促進(jìn)作用。

二、TIMP—1參與BA肝纖維化過(guò)程中的的組織重塑過(guò)程

TIMP—1由活化的肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生，其通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和通過(guò)抗細(xì)胞凋亡和增殖來(lái)影響MMP之間的相互作用，具體通過(guò)促進(jìn)可溶性MMP與膜結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用，使可溶性MMP在細(xì)胞—基質(zhì)界面活化，進(jìn)而使細(xì)胞通過(guò)基質(zhì)遷移，活化的MMP通過(guò)降解正常肝臟基質(zhì)和抑制積累的纖維狀膠原蛋白降解，來(lái)促進(jìn)肝纖維化［6，14］。已有研究證實(shí)，在終末期肝硬化患者中，TIMP—1基因表達(dá)和血清水平上調(diào)［15］。而其在BA肝組織中的表達(dá)及與Kasai術(shù)后肝纖維化進(jìn)展的關(guān)系則有不同觀點(diǎn)。本研究結(jié)果證實(shí)，其在BA患兒肝臟組織標(biāo)本中肝細(xì)胞胞質(zhì)、匯管區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)及膽管上皮細(xì)胞等呈陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增高，TIMP—1mRNA表達(dá)量也較對(duì)照組高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TIMP-1可能通過(guò)抑制MMP—9等及影響MMP之間相互作用，進(jìn)而有助于肝臟組織肝纖維化過(guò)程中組織重塑過(guò)程，并加速BA肝纖維化進(jìn)程。

三、CollagenⅢ作為T(mén)GF—β1信號(hào)通路產(chǎn)物，與BA肝纖維化形成直接相關(guān)

在BA肝纖維化進(jìn)展中，肝星狀細(xì)胞具有關(guān)鍵作用，當(dāng)肝組織受損后，在各種細(xì)胞因子及炎癥因子作用下，激活TGF—β1信號(hào)通路，最終使肝星形細(xì)胞轉(zhuǎn)換成肌成纖維細(xì)胞，使富含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量沉積如Collagen，發(fā)生肝纖維化［16］。Sferra R通過(guò)動(dòng)物模型證實(shí)在肝纖維化過(guò)程中，α—平滑肌肌動(dòng)蛋白、CollagenI—Ⅲ和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)增加，同時(shí)伴隨著avβ6、TGFβ1、Smad 3等表達(dá)上調(diào)［7］。Suominen JS等研究證實(shí)CollagenⅠ在BA肝組織中表達(dá)較對(duì)照組高，且Kasai手術(shù)時(shí)表達(dá)量少的自體肝生存率較表達(dá)高者預(yù)后好［17］。而對(duì)于CollagenⅢ在BA的作用目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在膽擴(kuò)組肝組織標(biāo)本中僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及肝細(xì)胞胞質(zhì)中有弱陽(yáng)性表達(dá)；在BA組及肝移植組肝組織標(biāo)本中，以上細(xì)胞胞質(zhì)中呈陽(yáng)性表達(dá)，且CollagenⅢ在BA組及肝移植組無(wú)論在蛋白水平還是基因水平表達(dá)均高于膽擴(kuò)組。由此表明CollagenⅢ作為T(mén)GF—β1信號(hào)通路產(chǎn)物，在肝纖維化進(jìn)程中，可能隨著肝纖維化嚴(yán)重程度增加而持續(xù)增多，說(shuō)明其在肝纖維化后期加速肝硬化進(jìn)程。

綜上所述，TGF—β1在BA患兒肝纖維化中起促進(jìn)作用，在肝纖維化早期階段其促進(jìn)作用大于晚期肝硬化階段。另外，JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在肝纖維化過(guò)程中表達(dá)明顯增高，JNK2可通過(guò)影響TGF—β1信號(hào)通路蛋白磷酸化及核易位進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程；而TIMP—1則有利于肝臟組織肝纖維化過(guò)程中組織重塑，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展；CollagenⅢ作為T(mén)GF—β1信號(hào)通路產(chǎn)物細(xì)胞外基質(zhì)的組成部分之一，尤其是在肝硬化時(shí)期，對(duì)肝纖維化進(jìn)程起直接作用。以上幾種蛋白對(duì)BA肝纖維化不同時(shí)期都有相應(yīng)的促進(jìn)作用，在將來(lái)的研究中，是否可以通過(guò)相關(guān)抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)終止或是延緩肝纖維化進(jìn)程，還有待更進(jìn)一步通過(guò)建立BA小鼠慢性纖維化模型行體外抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究。

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Effects of JNK 2，TIMP—1 and collagenⅢon liver fibrosis in patients w ith biliary

atresia．Gao Ting1，Zhan Jianghua2，Chen Yang1，Zhang Aihua2，Wei Yuanyuan1．1.Graduate School，TianJin Medical University，Tianjin 300070，China；2.Municipal Pediatric Research Institute，Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300134，China.Corresponding author：Zhan Jianghua，E-mail：zhanjianghuatj＠163.com

Objective To explore the expressions of c-Jun N-terminal kinase（JNK2），tissue inhibitor ofmetalloproteinase—1（TIMP—1）and collagenⅢin liver tissues and elucidate their functions in the process of liver fibrosis of biliary atresia（BA）.M ethods Liver biopsy specimenswere collected from congenital biliary dilatation（CBD group，n=10），BA liver biopsy（BA group，n=15），BA children undergoing liver transplantation due to liver failure（liver transplantation group，n=10）.Hematoxylin and eosin（HE）staining was used for evaluating the degree of liver fibrosis.And the expressions of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢin liver tissue were detected by immunohistochemical staining.Quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT—PCR）was used to test the gene expressions of JNK2，TIMP-1 and collagenⅢ.Results①HE staining：Fiber cell hyperplasia in CBD group；Portal area expansion，fibrous tissue proliferation，bridging fibrosis and little few pseudo lobules in Kasaigroup；Portal area becamewidened obviously，fibrous tissue proliferation was heavier，bridging fibrosis generally formed，pseudo-lobular was remarkable in liver transplantation group.②Immunohistochemistry：The expressions of JNK2，TIMP-1 and collagenⅢwere weakly positive in CBD group.The positive expression of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢprotein in hepatocytic cytoplasm，portal area of bile ductepithelial cells and vascular endothelial cells in BA and transplantation groups.Semi-quantitative analysis：The expression levels of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢprotein had significant differences among three groups（0.122±0.008 vs0.182±0.017 vs0.198±0.033，F(xiàn)=75.687，P=0.000；0.123±0.009 vs 0.185±0.012 vs 0.201±0.017，F(xiàn)=99.418，P=0.000；0.126±0.012 vs 0.194±0.008 vs 0.208± 0.033，F(xiàn)=54.001，P=0.000）；BA and liver transplantation groups were significantly higher than that in CBD group（P＜0.05）.No significant differences existed in protein level between BA and transplantation groups（P＞0.05）；qRT—PCR：ThemRNA expression levels of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢhad significant differences among three groups（0.221（0.17）vs 1.395（1.22）vs 1.095（1.21），H=17.686，p= 0.003；0.439（0.31）vs 1.404（0.85）vs 1.571（0.66），H=20.648，P=0.000；0.917（0.09）vs 1.802（1.35）vs1.957（1.30），H=15.555，P=0.007）；ThemRNA expression of JNK2，TIMP-1 and collagenⅢwere higher in BA group and liver transplantation group than those of CBD group（P＜0.017）. Conclusions The expressions of JNK2，TIMP—1 and CollagenⅢincreased in liver of BA during fibrosis.It hints that the expressions of JNK2，TIMP—1 and collagenⅢmay promote the process of liver fibrosis in BA.

Biliary Atresia；Liver Cirrhosis；Transforming Growth Factor beta1；Immunohistochemistry

??華.膽道閉鎖早期篩查現(xiàn)狀及對(duì)策［J］.天津醫(yī)藥，2015，43（1）：1—3.

10.3969／j.issn.0253—9896.2015. 01.001. Zhan JH.The early screening and countermeasures of biliary atresia［J］.Tianjin Med J，2015，43（1）：1—3.DOI：10. 3969／j.issn.0253—9896.2015.01.001.

2016—02—02）

（本文編輯：王愛(ài)蓮 仇 君）

高婷，詹江華，陳揚(yáng)，等.JNK2、TIMP—1及CollagenⅢ在膽道閉鎖肝纖維化中的作用［J］.臨床小兒外科雜志，2017，16（2）：127-132.DOI：10.3969／j. issn.1671—6353.2017.02.006.

Citing this article as：Gao T，Zhan JH，Chen Y，et al. The effects of JNK2、TIMP—1 and CollagenⅢon liver fibrosis in patients with biliary atresia［J］.J Clin Ped Sur，2017，16（2）：127-132.DOI：10.3969／j.issn.1671—6353.2017.02.006.

doi：10.3969／j.issn.1671—6353.2017.02.006

1，國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目號(hào)：81570471）；2，天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（14KG129）

1，天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（天津市，300070）；2，天津市兒童醫(yī)院，天津市兒科研究所（天津市，300134）

詹江華，E-mail：zhanjianghuatj＠163.com