姜立春,王成紅,劉 羽,林壽露,趙麗萍,阮期平

(綿陽(yáng)師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川綿陽(yáng) 621000)

半纖維素降解菌J-25的篩選、鑒定及產(chǎn)酶特性研究

姜立春,王成紅,劉 羽,林壽露,趙麗萍,阮期平*

(綿陽(yáng)師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川綿陽(yáng) 621000)

以腐爛的木材為菌源,經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩,采用半纖維素水解圈法和胞外酶測(cè)定法進(jìn)行菌株篩選獲得一株半纖維素高效降解菌株J-25。通過(guò)對(duì)菌株J-25的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序分析,鑒定為纖維單胞菌屬命名為Cellulomonassp. J-25。對(duì)菌株J-25進(jìn)行產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)研究,結(jié)果表明:菌株J-25發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)化條件為:培養(yǎng)時(shí)間為60 h、溫度30 ℃、初始pH為7.0、麩皮濃度為20 g/L、酵母粉濃度為10 g/L、裝液量為50 mL(250 mL三角瓶),半纖維素酶活性可達(dá)到62.8 U/mL。最適酶反應(yīng)條件為:pH為6.5、溫度為40 ℃、底物濃度為15 g/mL、反應(yīng)時(shí)間為30 min。這些將為半纖維素的生物降解提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

半纖維素,降解菌,產(chǎn)酶條件,酶學(xué)性質(zhì),16S rDNA

半纖維素是植物性材料的有效組成成份之一,約占15%～30%,是陸生植物細(xì)胞壁的一種主要組分,較集中于初級(jí)與次級(jí)細(xì)胞壁中。半纖維素是由己糖與戊糖構(gòu)成的異質(zhì)多糖[1],探討半纖維素生物轉(zhuǎn)化具有重要的實(shí)踐價(jià)值,如在生物制漿,將其轉(zhuǎn)化為單糖和酒精,處理造紙廠廢水的環(huán)境污染等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。半纖維素酶是分解半纖維素的一類酶的總稱,主要由內(nèi)切酶、外切酶和糖苷水解酶組成[3]。微生物產(chǎn)生的半纖維素酶將半纖維素降解產(chǎn)生術(shù)糖和其它少量單糖[4]。有利于廢棄農(nóng)作物還田,改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況,還能夠使農(nóng)作物抵抗某些病原微生物的致病作用,減輕病蟲害,增加產(chǎn)量[5]。全桂靜等[5]使用半纖維素作為唯一碳源,通過(guò)平板水解圈與搖瓶發(fā)酵相結(jié)合方法,篩選分離純化到1株半纖維素酶高產(chǎn)菌株Hc-3,鑒定該菌株屬于曲霉屬(Aspergillus)。張慶芳等[6]以木聚糖作為唯一碳源,分離獲得1株降解半纖維素中木聚糖的高效菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為曲霉屬(Aspergillus)。張寧寧等[7]以半纖維素為唯一碳源,從溫泉中分離到1株降解半纖維素酶的嗜熱菌DT-1,經(jīng)16S rDNA序列比較分析,初步鑒定該菌株屬于Geobacillusthermocatenulatus。

本研究以腐朽木材為菌源,篩選獲得的一株半纖維素降解菌進(jìn)行了菌株鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化,并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析,以期提高半纖維素酶的活性,為纖維的生物降解提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣本采集 使用無(wú)菌取樣鏟采集腐爛木材或長(zhǎng)期存放木材下面的土壤作為篩選菌源,用無(wú)菌袋包裝帶回實(shí)驗(yàn)室,于4 ℃冰箱中保存,備用。

1.1.2 主要儀器和試劑 PCR儀器(Thermol Research Inc);Gel-Doc XR分子凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf);凈化工作臺(tái)(SB-JC-1A);紫外分光光度計(jì)(Uitrospec 3300pro);恒溫培養(yǎng)搖床(HZ-9211K);微量可調(diào)移液器(Eppendorf)等。

pMD18-T試劑盒、X-gal和IPTG、DNA膠回收試劑盒和氨芐青霉素購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,引物的合成和DNA測(cè)序由上海生物工程技術(shù)有限公司完成,DNS試劑、木聚糖溶液。

1.1.3 培養(yǎng)基及配方 初篩培養(yǎng)基(100 mL):木聚糖0.5 g,酵母粉0.1 g,KH2PO40.1 g,NH4NO30.1 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,NaCl 0.5 g,瓊脂1.5 g。

透明圈測(cè)定培養(yǎng)基(100 mL)[8]:K2HPO42.0 g,NH4NO32.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,酵母膏5.0 g,半纖維素20.0 g,pH7.2。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(100 mL):木聚糖0.5 g,KH2PO40.1 g,NH4NO40.4 g,MgSO4·7H2O 0.1 g,NaCl 0.5 g。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5g,瓊脂2.2%,水1000 mL,pH7.4～7.6,固體平板加2.0%瓊脂。上述培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌 20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選 將樣品制成菌懸液。將菌懸液稀釋后均勻涂布于篩選平板上,27 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,將純化后的單菌落點(diǎn)種于透明圈培養(yǎng)基上,27 ℃恒溫培養(yǎng),測(cè)量水解圈的直徑D(mm)及菌落的直徑d(mm),并計(jì)算D/d值,進(jìn)行初篩。復(fù)篩測(cè)定發(fā)酵液酶活力。

1.2.2 菌種鑒定

1.2.2.1 形態(tài)觀察 將細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)32 ℃培養(yǎng)30 h后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察,放于4 ℃冰箱中保存。選擇單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.2.2 生理生化 菌株J-25生理生化實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9]中的方法。依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,對(duì)篩選獲得的菌株J-25進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2.3 DNA提取與擴(kuò)增16S rDNA基因 細(xì)菌基因組DNA提取:提取基因組DNA參考Kim等[10]方法,對(duì)其方法略有修改。0.9%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

采用細(xì)菌通用引物P27f:5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′,P1492r:5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA基因片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:37.5 μL ddH2O、5.0 μL 10×PCR buffer、4 μL dNTPs(各2.5 mmol/L)、1.0 μL P27f引物(20 pmol/μL)、1.0 μL P1492r引物(20 pmol/μL)、2 μL模板、0.5 μL TaqDNA聚合酶,反應(yīng)總體積為50 μL。擴(kuò)增熱循環(huán)體系:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸50 s;經(jīng)35個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸18 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后,其產(chǎn)物回收純化與pMD-19T載體連接,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞JM109,篩選陽(yáng)性重組子郵寄上海英俊生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2.4 16S rRNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將菌株的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast序列比對(duì)與相似性分析,下載與該序列相似性較高的核酸序列用于系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。將在數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的相關(guān)菌株16S rRNA序列,采用Clustal X軟件包[11]進(jìn)行多序列比對(duì)分析,用Mega 6.0軟件程序中的Neighbor-Joining法進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[12]。

1.2.3 半纖維素酶活性測(cè)定 粗酶液1.0 mL,加1.5 mL pH=4.8的1%木聚糖溶液(對(duì)照用1.0 mL稀釋酶液加3.0 mL pH=4.8的醋酸緩沖液,不加木聚糖溶液),50 ℃水溶60 min,取出后,再吸取4.0 mL DNS試劑搖勻,立即沸水浴反應(yīng)10 min,冷卻后,補(bǔ)加水定容到25 mL,于550 nm下測(cè)OD值。一個(gè)半纖維素酶單位定義為:1.0 mL酶液于50 ℃ pH=4.8條件下,每分鐘分解1.0%木聚糖溶液產(chǎn)生一微克還原糖(以木糖)的酶量定義為一個(gè)半纖維素酶活力單位。酶活力計(jì)算公式:U=(A×N×1000)/60,式中:A=OD550 nm下的吸收值相對(duì)應(yīng)的木糖濃度;N=酶的稀釋倍數(shù)。

1.2.4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上通過(guò)改變單一因素,并保持其他發(fā)酵條件不變,以下實(shí)驗(yàn)每個(gè)條件制作三個(gè)平行。培養(yǎng)時(shí)間:將菌株J-25接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(接種量為1%)。置于32 ℃ 160 r/min搖床上進(jìn)行培養(yǎng),觀察并記錄其生長(zhǎng)狀況,每12 h測(cè)定記錄一次,共5 d;碳源(濃度10 g/L)分別為麩皮、玉米粉、半纖維素、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖,在碳源確定的基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)在5、10、15、20、25和30 g/L條件下分析碳源濃度;而氮源(濃度5 g/L)為蛋白胨、豆粕、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨,在氮源確定的基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)在1、5、10、15和20 g/L條件下分析氮源濃度;實(shí)驗(yàn)考察不同初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10),不同裝液量(10、30、50、80、100、120 mL/250 mL三角瓶),不同培養(yǎng)溫度(20、24、27、30、33、37、40 ℃)等條件對(duì)該菌株產(chǎn)酶的影響[13-14]。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)初步研究

1.2.5.1 pH對(duì)酶活力的影響 pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的1.0%木聚糖溶液1.5 mL分別加入粗酶液0.5 mL,搖勻,50 ℃水浴60 min,取出后,用DNS法測(cè)定酶活力。

1.2.5.2 溫度對(duì)酶活力的影響 調(diào)節(jié)最適pH,使酶反應(yīng)體系在10、20、30、40、50、60 ℃下保溫60 min,取出后,用DNS法測(cè)定不同溫度下的酶活力。

1.2.5.3 底物濃度對(duì)酶活力的影響 濃度為1、5、10、15、20 g/L的木聚糖溶液1.5 mL,分別加入粗酶液0.5 mL,搖勻,50 ℃水浴60 min,取出后,用DNS法測(cè)定酶活力。

1.2.5.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響 調(diào)節(jié)最適pH,使酶反應(yīng)體系在50 ℃水浴鍋中分別保溫10、20、30、40、50、60 min,取出后,用DNS法測(cè)定酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)定結(jié)果利用Microsoft Excel軟件制圖以及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)每個(gè)條件制作3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 半纖維素降解菌的篩選

經(jīng)過(guò)平板分離,挑取能產(chǎn)生透明圈的菌株共6株。在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵后測(cè)定酶活性,選出木聚糖酶活性較高的菌株3株,挑取酶活最高的菌株J-25進(jìn)行產(chǎn)酶條件分析和酶學(xué)性質(zhì)研究。菌株J-25在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后,菌落圓形,邊緣整齊,乳白色,凸起圓球狀,革蘭氏染色陽(yáng)性,菌體形態(tài)為短桿狀,呈單個(gè)或成對(duì)排列。

2.2 菌株J-25生理生化鑒定

菌株J-25的V-P反應(yīng)呈陰性,甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性,吲哚實(shí)驗(yàn)呈弱陽(yáng)性,糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的葡萄糖、乳糖和蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性,即菌能分解三種糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣,接觸酶陽(yáng)性。

2.3 菌株J-25系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將克隆得到的半纖維素降解菌株J-25的16S rDNA序列片段經(jīng)過(guò)測(cè)序后,序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知的核酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)和相似性分析。結(jié)果表明,菌株J-25的16S rDNA序列與NCBI基因庫(kù)中纖維單胞菌屬(Cellulomonas)的16S rDNA同源性最為接近,且一致性均大于97%,表明該菌屬于Cellulomonas。通過(guò)CLustal X軟件的多序列比較和MEGA 6.0軟件的分析得到以16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖1。由系統(tǒng)發(fā)育樹表明,在以上15個(gè)菌株中,菌株J-25與Cellulomonassp. RP-3(EU303279)菌株同源性達(dá)99%以上,因此,命名為Cellulomonassp. J-25。

圖1 菌J-25與相近序列比較的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of J-25 and related sequences

2.4 菌株J-25產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)半纖維素酶產(chǎn)生的影響 通過(guò)將菌株J-25培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化后,測(cè)定半纖維素降解酶活,其結(jié)果和數(shù)據(jù)分析見圖2。結(jié)果表明,J-25的酶活力在0～60 h逐漸增大,在60 h時(shí)達(dá)到最大為38.5 U/mL,其后酶活力隨著時(shí)間的增大而呈下降趨勢(shì)。所以確定最適發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為60 h。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of culture time on enzyme production

2.4.2 碳源及濃度對(duì)半纖維素酶產(chǎn)生的影響 以不同碳源為橫坐標(biāo),測(cè)得的酶活力為縱坐標(biāo),其結(jié)果見圖3。結(jié)果表明,碳源麥麩誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶的效果最好,達(dá)到40.6 U/mL;半纖維素次之,為38.1 U/mL;而其它單糖和多糖誘導(dǎo)效果較差。因此,選擇麥麩作為最適碳源。

圖3 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on production of enzymes

碳源則是由于原核生物必須根據(jù)環(huán)境條件的改變合成各種不同的蛋白質(zhì),使得代謝過(guò)程適應(yīng)環(huán)境的變化,才能維持自己的生存和繁衍[15]。以不同濃度的麩皮為碳源發(fā)酵培養(yǎng),其結(jié)果見圖4。麩皮濃度在5～20 g/L時(shí),隨著濃度的增加,產(chǎn)酶活力逐漸增大,當(dāng)濃度在20 g/L時(shí),酶活力最高達(dá)到42.8 U/mL;在濃度高于20 g/L后,酶活力呈下降趨勢(shì),當(dāng)麩皮濃度達(dá)到一定濃度后,培養(yǎng)液混濁度升高,溶氧度降低所致。因此,最適麩皮濃度為20 g/L。

圖4 麩皮濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of bran concentration on production of enzymes

2.4.3 氮源及濃度對(duì)半纖維素酶產(chǎn)生的影響 以不同氮源為橫坐標(biāo),氮源的質(zhì)量濃度為5 g/L;碳源選擇麥麩(15 g/L),對(duì)菌株J-25進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),其結(jié)果見圖5。結(jié)果表明,不同氮源對(duì)菌株J-25產(chǎn)酶活力有一定的影響,其中酵母粉對(duì)產(chǎn)酶活力影響最大,酶活力達(dá)到41.8 U/mL,硫酸銨次之,為40.2 U/mL;而硝酸銨效果最差,為28.3 U/mL。因此,選擇酵母粉作為最適碳源。以不同濃度的酵母粉為氮源發(fā)酵培養(yǎng),其結(jié)果見圖6。酵母粉濃度在1.0～10 g/L時(shí),隨著濃度的增加,產(chǎn)酶活力逐漸增大,當(dāng)濃度在10 g/L時(shí),酶活力最高達(dá)到43.6 U/mL;在濃度高于10 g/L后,酶活力呈略微下降趨勢(shì),可能是當(dāng)酵母粉濃度達(dá)到一定程度后,抑制了培養(yǎng)液的溶解氧的效率,導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。因此,最適酵母粉濃度為10 g/L。

圖5 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on production of enzymes

圖6 酵母粉濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of yeast powder concentration on production of enzymes

2.4.4 初始pH對(duì)半纖維素酶產(chǎn)生的影響 培養(yǎng)基初始pH變化將會(huì)使微生物細(xì)胞原生質(zhì)體膜上電荷隨之發(fā)生改變,從而影響微生物對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌,即影響了半纖維素酶的活性。如圖7所示,當(dāng)初始pH在5.0～7.0時(shí),酶活力隨著pH的升高而增大;在pH為7.0時(shí),酶活力達(dá)到最大為45.8 U/mL;當(dāng)pH高于7后,酶活力則隨pH的升高而減弱,表明偏酸或偏堿的環(huán)境均不適合產(chǎn)酶,故最適產(chǎn)酶pH為7.0。

圖7 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of initial pH on production of enzymes

圖8 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effects of loaded liquid on production of enzymes

2.4.5 培養(yǎng)基裝液量對(duì)半纖維素酶產(chǎn)生的影響 當(dāng)搖瓶中裝液量較少時(shí),通氣好,則菌體旺盛生長(zhǎng),但是過(guò)少的培養(yǎng)基不能滿足其生長(zhǎng)產(chǎn)酶,因此酶活力較低;當(dāng)裝液量過(guò)高時(shí),影響通氣狀況從而影響菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致產(chǎn)酶量發(fā)生變化。結(jié)果如圖8可知,當(dāng)裝液量為10～50 mL時(shí),隨著裝液量的增多,酶的活性逐漸增高,裝液量為50 mL時(shí),產(chǎn)酶活力最高為48.6 U/mL;而裝液量高于50 mL后,產(chǎn)酶活性呈下降趨勢(shì)。故最裝液量為50 mL。

2.4.6 發(fā)酵溫度對(duì)半纖維素酶產(chǎn)生的影響 從酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)來(lái)看,發(fā)酵溫度升高,酶反應(yīng)速率增大,生長(zhǎng)代謝速度加快,但酶本身容易因過(guò)熱而失去活性,表現(xiàn)在菌體容易衰老,發(fā)酵周期縮短,影響最終產(chǎn)物。在發(fā)酵過(guò)程中,溫度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和酶的產(chǎn)生的影響是不同的[16]。如圖9所示,當(dāng)溫度在20～30 ℃時(shí),隨著發(fā)酵溫度升高,產(chǎn)酶活性也逐漸增大;當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃時(shí),半纖維素酶活力達(dá)到最高為62.8 U/mL;溫度繼續(xù)升高反而使產(chǎn)酶活性快速減小。所以,最佳產(chǎn)酶溫度為30 ℃。

圖9 發(fā)酵培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of fermentation temperature on production of enzymes

2.5 酶學(xué)特性研究

2.5.1 pH對(duì)酶反應(yīng)的影響 pH變化會(huì)改變酶分子的空間構(gòu)象,pH過(guò)大或過(guò)小將會(huì)導(dǎo)致酶喪失活性,進(jìn)而使酶解率隨之降低。酶促反應(yīng)在不同pH下,酶分子與底物分子中基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變[17],從而影響酶分子的構(gòu)象以及酶與底物的結(jié)合和催化效率。如圖10所示,當(dāng)pH在5.5～6.5時(shí),隨著pH增大酶活性增高,pH為6.5產(chǎn)酶活力達(dá)到最大為66.8 U/mL;之后隨著pH升高,產(chǎn)酶活力反而下降,可能pH升高抑制了酶的活性。因此,酶促反應(yīng)最適pH為6.5。

圖10 pH對(duì)酶反應(yīng)的影響Fig.10 Effects of pH on reaction of enzymes

2.5.2 溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響 溫度對(duì)酶的活性產(chǎn)生一定的影響,如圖11所示,當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)會(huì)抑制酶的活性,使得酶活力較低,隨著溫度升高,酶活力逐漸升高;當(dāng)溫度升到溫度40 ℃時(shí),酶的活性最大為63.8 U/mL。過(guò)高時(shí),致使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞,酶活力反而下降。因此,酶促反應(yīng)最適溫度為40 ℃。

圖11 發(fā)酵溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響Fig.11 Effects of temperature on reaction of enzymes

2.5.3 底物濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響 如圖12所示,底物濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響也很明顯,酶的活性先隨底物濃度的增加而增加,當(dāng)?shù)竭_(dá)15 g/L時(shí)達(dá)到最大為64.5 U/mL。在底物濃度較低的條件下,酶催化反應(yīng)速度與底物濃度成正比,酶促反應(yīng)速度將隨底物濃度的增加而變快,當(dāng)酶量飽和時(shí),酶活力則不再上升,當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí),反而酶的活性降低,因?yàn)楫a(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)有了抑制作用。由此可知,最適底物濃度為15 g/L。

圖12 底物濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響Fig.12 Effects of substrate concentration on reaction of enzymes

2.5.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶反應(yīng)的影響 隨著酶促反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng),酶的活性增大,但反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)已不能有效地增加酶促反應(yīng)活力。由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng),酶分子已充分與底物接觸,結(jié)合后酶分子的有效濃度下降,且反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)有一定的抑制作用,導(dǎo)致酶促反應(yīng)變化并不明顯。由圖13所示,當(dāng)30 min時(shí),酶的活力最高為67.9 U/mL;而在隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),酶活力變化幾乎不大。因此,酶促反應(yīng)最適時(shí)間為30 min。

圖13 時(shí)間對(duì)酶反應(yīng)的影響Fig.13 Effects of time on reaction of enzymes

3 結(jié)論

篩選到一株半纖維素高效降解菌J-25,該菌株V-P反應(yīng)呈陰性,甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性,吲哚實(shí)驗(yàn)呈弱陽(yáng)性,能分解葡萄糖、乳糖和蔗糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣,鑒定為纖維單胞菌,命名為Cellulomonassp. J-25。半纖維素降解菌J-25的最佳產(chǎn)酶條件為:培養(yǎng)時(shí)間為60 h、溫度為30 ℃、麩皮濃度為20 g/L、酵母粉濃度為10 g/L、初始pH為7.0、裝液量為50 mL,在此培養(yǎng)條件下,酶的活性可達(dá)到62.8 U/mL。菌株J-25所產(chǎn)半纖維素酶的最適反應(yīng)條件為:pH為6.5,溫度為40 ℃,底物濃度為15 g/L,反應(yīng)時(shí)間為30 min。

國(guó)內(nèi)對(duì)半纖維素降解菌定量分析報(bào)道還較少,一些研究學(xué)者只做了定性分析[18-19];張寧寧等[20]以溫泉水樣作為研究材料,分離嗜熱菌株DT-1的半纖維素酶活僅達(dá)到200 U/L;劉多濤等[21]以石油井附近的石油污染區(qū)域土樣,獲得菌株DT83半纖維素酶活可達(dá)70 U/mL以上;徐有權(quán)等[22]以田間富含腐爛稻稈的泥土為樣本,篩選獲得短小芽胞桿菌,產(chǎn)半纖維素酶活可達(dá)85.12 U/mL;而本實(shí)驗(yàn)獲得的纖維單胞菌J-25,培養(yǎng)60 h后,其酶活性能夠達(dá)到62.8 U/mL,具有較高的降解半纖維活性。由于Cellulomonassp. J-25對(duì)半纖維的降解與菌株分泌的降解酶有關(guān),因此,其降解途徑和機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果豐富了半纖維的生物降解資源庫(kù),為進(jìn)一步研究半纖維的生物降解提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Screening,identification and enzymatic analysis of hemicellulose-degrading strain J-25

IANG Li-chun,WANG Cheng-hong,LIU Yu,LIN Shou-lu,ZHAO Li-ping,RUAN Qi-ping*

(Key Laboratory for Molecular Biology and Biopharmaceutics,Mianyang Normal University,Mianyang 621000，China)

A hemicellulose degrading bacteria was isolated with rotting wood as a source. Hydrolysis spot diameter measurement of hemicellulose plate and extracellular enzyme activity was used. The strain J-25 was identified asCellulomonasby 16S rDNA sequencing analysis,namedCellulomonassp. J-25. And characteristics of enzyme production and enzymatic properties were studied. The results indicated that fermentation conditions for enzyme production of strain J-25 was:temperature 30 ℃,the initial pH of 7.0,bran concentration of 20 g/L,yeast powder concentration of 10 g/L,liquid volume of 50 mL(250 mL flask),hemicellulose activity may reach 62.8 U/mL. The optimum enzyme reaction conditions were as follows:pH6.5,temperature of 40 ℃,substrate concentration of 15 g/mL,the reaction time of 30 min. These will provide experimental evidence for hemicellulose biodegradation.

hemicellulose;degrading-bacteria;fermentation conditions;enzymatic properties;16S rDNA

2016-09-28

姜立春(1977-)，男，博士，副教授，從事應(yīng)用微生物學(xué)與分子生物學(xué)方面研究，E-mail:jiang_lichun @126.com。

*通訊作者:阮期平(1961-)，男，博士，教授，從事微生物學(xué)與生化藥學(xué)方面研究，E-mail: qpruan20141230@163.com。

四川省科技廳項(xiàng)目(2016JY0038)；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510639010,201510639066)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0145-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.019