蘇海蘭,魏 娟,畢 陽,*,李霽昕,Yury Zubarev,Alexander Kanarskiy

(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.“利沙文科”西伯利亞園藝研究所,巴爾瑙爾 656045)

中國沙棘乙醇提取物的體外及對HepG2細胞的抗氧化活性

蘇海蘭1,魏 娟1,畢 陽1,*,李霽昕1,Yury Zubarev2,Alexander Kanarskiy2

(1.甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.“利沙文科”西伯利亞園藝研究所,巴爾瑙爾 656045)

本文從生化角度全面分析了中國沙棘乙醇提取物的體外抗氧化活性,并在評價細胞毒性的基礎上,以HepG2細胞為模型,利用流式細胞儀評估了提取物的細胞抗氧化能力。結果表明,中國沙棘乙醇提取物對ABTS自由基具有良好的清除效果,當濃度為5 mg/mL時,其清除能力與陽性對照BHT相當;中國沙棘乙醇提取物對NO自由基也有良好的清除效果,但其整體清除能力不及BHT;當濃度為5 mg/mL時,中國沙棘乙醇提取物對亞油酸脂質過氧化表現抑制,但其抑制效果低于BHT;中國沙棘乙醇提取物的總抗氧化能力隨濃度的增大而增強,當濃度為5 mg/mL時,其總抗氧化能力與同濃度下的BHT接近。在濃度為0.05～5 mg/mL范圍內,中國沙棘乙醇提取物對HepG2細胞不顯示毒性;當處理濃度為0.5、1、5 mg/mL時,中國沙棘乙醇提取物的陽性細胞率與陽性對照相比分別降低了75.22%、72.36%和78.2%。中國沙棘乙醇提取物不僅在體外條件下具有良好的抗氧化活性,而且在HepG2細胞內表現出良好的抗氧化能力。

沙棘,乙醇提取物,抗氧化,HepG2細胞

中國沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp. Sinensis)屬胡頹子科沙棘屬灌木[1]。廣泛分布于我國的西北和華北等地,是我國栽培沙棘的主要品種。中國沙棘漿果富含維生素、黃酮及類胡蘿卜素等多種活性成分[2],具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗衰老以及調節(jié)免疫等功能[3]。

抗氧化是多種沙棘活性成分的重要特性。范惠玲等[2]發(fā)現,中國沙棘漿果甲醇提取液能有效清除NO自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基,顯示出較好的抗氧化活性。中國沙棘果渣總黃酮能夠有效抑制油脂氧化、可清除超氧陰離子和羥自由基[4]。俄羅斯大果沙棘(H.rhamnoidesssp. Russia)漿果提取物不僅具有較好的體外抗氧化活性,而且可抑制癌細胞的增殖[5]。大果沙棘果渣黃酮可抑制結腸癌 HT29 細胞的生長,對該細胞DNA表現致損[6]。此外,印度柳葉沙棘(H.salicifoliaD. Don)漿果和葉片乙醇提取物也具有良好的自由基清除能力及抑制脂質過氧化作用,對人類神經細胞IMR32的氧化應激損傷具有保護作用[7]。同樣,俄羅斯大果沙棘漿果黃酮對ABTS+·、DPPH·、羥自由基、超氧自由基均有很好的抑制效果[8]。然而,中國沙棘在生化水平的抗氧化評價并不系統,在細胞水平上也僅限于抑制細胞的生長?；贖epG2細胞模型反映中國沙棘細胞抗氧化活性的研究尚未見報道。

本文通過中國沙棘漿果乙醇提取物對ABTS、NO自由基清除效果、總抗氧化能力、抗亞油酸脂質過氧化能力的測定,以及對HepG2細胞內抗氧化能力的研究,驗證中國沙棘乙醇提取物的抗氧化功能。以期擴大中國沙棘的應用范圍,為篩選天然抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘漿果于2012年11月采自甘肅華池高原圣果基地,紙箱包裝次日運至本實驗室于-80 ℃下貯藏待用;HepG2(人肝癌細胞) 上海拜力生物有限公司,液氮凍存;MTS Promega公司;FBS、DMEM、0.25%胰酶(含EDTA) Hyclone公司;ABTS、DCFH-DA Sigma-Aldrich公司;2,6-二叔丁基對甲苯酚(BHT)及其余試劑 國產分析純。

UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津公司;V111584 型iMARK酶標儀 美國BIO-RAD公司;Cell Lab Quanta SC型流式細胞儀 美國Beckman公司;DH-1850R型高速臺式冷凍離心機 上海德洋意邦儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇提取物的制備 參照梁楷等[9]方法,準確稱取2.0 g沙棘漿果置于研缽中,研磨搗碎,采用乙醇濃度51%,料液比1∶22,在86 ℃下水浴回流提取1 h,離心收集于4 ℃避光保存。

1.2.2 HepG2細胞培養(yǎng) 參照Wen等[10]方法,將HepG2細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,且將其置于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d用含0.25% EDTA的胰酶消化傳代。當細胞生長狀態(tài)良好,呈對數生長期時進行實驗。

1.2.3 乙醇提取物清除ABTS自由基的測定 參照Chun等[11]方法。將5 mL的7 mmol/L ABTS和88 μL的140 mmol/L高硫酸鉀混合,在室溫,避光的條件下靜置過夜,形成ABTS自由基儲備液。使用前用無水乙醇(1∶88)稀釋成工作液,后將工作液于30 ℃、734 nm波長下確定其吸光值是否在0.70±0.02。若在0.70±0.02內,則可進行實驗。用51%乙醇分別配制濃度為0.5、1、2、3、4、5 mg/mL的沙棘乙醇提取物樣品溶液,以抗氧化劑BHT溶液(0.5、1、2、3、4、5 mg/mL)作為陽性對照。取0.1 mL樣液,加入4 mL ABTS自由基溶液,30 ℃下混合10 s,在734 nm測其吸光值A。51%乙醇替代樣液作為陰性對照組,于734 nm處測定吸光值A0。清除率由式(1)計算:

式(1)

1.2.4 乙醇提取物清除NO自由基的測定 參照Dong等[12]的方法。在反應中,取10 mmol/L亞硝基鐵氰化鈉溶液5 mL加入試管中,再分別加入10 mg/mL樣品(沙棘乙醇提取物)0.5、1、2、3、4、5 mL,補蒸餾水至10 mL,混合均勻后,在室溫下反應150 min。51%乙醇取代樣液作為陰性對照組,以BHT作為陽性對照。溶液反應后,添加Griess試劑(l%對氨基苯磺酸,2%磷酸,0.1% N-1-萘乙二胺鹽酸鹽)0.5 mL。在546 nm下,測定所形成的發(fā)色基團的吸光值。清除率計算見式(2):

式(2)

其中:A0為空白組的吸光度,A為加沙棘乙醇提取物后的吸光度。

1.2.5 乙醇提取物抑制亞油酸脂質過氧化的測定 參照張京芳等[13]的方法。分別配制5 mg/mL的沙棘乙醇提取物溶液、BHT溶液作為樣品液,取1 mL樣品液于具塞試管中,然后分別加入1 mL 2.5%亞油酸(v/v)溶液,2 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH7.0),1 mL蒸餾水,于40 ℃恒溫下培養(yǎng)。取培養(yǎng)液0.1 mL,按順序加入4.7 mL乙醇(75%)、0.1 mL硫氰酸銨(30%)、0.1 mL氯化亞鐵(0.02 mol/L,用3.5%鹽酸配制),混合均勻后,室溫下準確反應3 min,在波長500 nm下測吸光值A,51%乙醇取代替樣液作為陰性對照組A0。抑制率計算見公式(3):

式(3)

1.2.6 乙醇提取物總抗氧化能力的測定 參照Prieto等[14]的方法稍作修改。取0.4mL樣品液(0.5、1、2、3、4、5mg/mL),再加入4mL磷鉬試劑(內含0.6mol/L濃硫酸、28mmol/L磷酸鈉、4mmol/L鉬酸銨),混合均勻后,于95 ℃水浴中保溫90min,取出冷卻至室溫,陰性對照液用0.4mL溶劑代替樣品液。以BHT為陽性對照,于 695nm波長處測定吸光度。依據吸光度變化來檢測總抗氧化性能的高低。

圖1 中國沙棘乙醇提取物對ABTS自由基(A), NO自由基(B), 亞油酸脂質過氧化(C),總抗氧化能力(D)的影響 Fig.1 Effects of ethanol extracts of Chinese seabuckthorn on ABTS free radicals(A), NO free radicals(B),linoleic acid lipid peroxidation(C),total antioxidant capacity(D)

1.2.7 乙醇提取物對HepG2細胞毒性的測定 參照顧梅等[15]的方法稍作修改。收集對數期HepG2細胞,調整細胞懸液濃度,將其接種于96孔培養(yǎng)板中,接種使待測細胞密度1000～10000cells/孔,置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使其貼壁,培養(yǎng)24h后加入不同濃度的沙棘乙醇提取物,每個濃度設6個復孔,于5% CO2,37 ℃繼續(xù)孵育24 h;然后加MTS試劑,再繼續(xù)孵育1～3 h后,在490 nm處測量各孔的吸光度值A1,以單純培養(yǎng)液作為空白孔,測定吸光度值為A0,以未做任何處理作為對照,測定吸光度值A。細胞存活率見公式(4)計算:

式(4)

1.2.8 乙醇提取物細胞內抗氧化活性測定 參照張紅城等[16]的方法。取對數期的HepG2細胞,調整細胞懸液濃度接種于6孔培養(yǎng)板中于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后去掉原培養(yǎng)液,用預冷的PBS清洗1次;加入不同濃度的沙棘乙醇提取物處理30 min,之后去掉培養(yǎng)基用預冷的PBS清洗一次,加入25 μmol/L DCFH-DA溶液,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min,去掉培養(yǎng)基后用預冷的PBS清洗3次,以充分洗去未進入細胞內的探針。再加入15 mmol/L H2O2刺激40 min,收集細胞并制成細胞懸液,用流式細胞儀檢測熒光強度,激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為525 nm。

上述各項測定均重復進行3次。

1.3 數據處理

全部數據采用Excel 2007計算平均值及標準偏差。

2 結果與分析

2.1 中國沙棘乙醇提取物的體外抗氧化能力

中國沙棘乙醇提取物對 ABTS自由基具有良好的清除能力,在0～5 mg/mL的濃度范圍內呈良好的線性關系,當濃度為5 mg/mL時,其清除率已接近同濃度陽性對照BHT。陽性對照BHT顯示出更好的 ABTS自由基的清除能力,當濃度為0.5 mg/mL時,其清除率就已達90%(圖1A)。而陰性對照對ABTS自由基始終未表現清除作用。

中國沙棘乙醇提取物對NO自由基也有良好的清除效果,隨著濃度的提高,對NO自由基的清除能力也逐漸增強,但整體清除能力不及陽性對照BHT,當濃度為0.5 mg/mL時,乙醇提取物對NO自由基的清除率低于BHT 12.7%,當濃度為5 mg/mL時,乙醇提取物對NO自由基的清除率是陽性對照BHT的81%(圖1B),而陰性對照對NO自由基始終未表現清除作用。

當濃度為5 mg/mL 時,中國沙棘乙醇提取物和BHT 均對亞油酸的脂質過氧化作用表現抑制,但中國沙棘乙醇提取物的抑制效果不及BHT,而與對照相比,中國沙棘乙醇提取物對亞油酸脂質過氧化的抑制率占對照的61.2%(圖1C)。

中國沙棘乙醇提取物的總抗氧化活性隨濃度的增大而增強,當濃度為5 mg/mL時,其總抗氧化活性與同濃度下的陽性對照BHT接近,但中國沙棘乙醇提取物的總抗氧化活性不及BHT(圖1D)。陰性對照的總抗氧化活性始終維持在較低的水平。

2.2 中國沙棘乙醇提取物對HepG2細胞的毒性及細胞內抗氧化活性的影響

2.2.1 對HepG2細胞的毒性 中國沙棘乙醇提取物在0.05～5 mg/mL時,對HepG2細胞的存活率無抑制作用(圖2);且在0.1～5 mg/mL時,提取物反而對HepG2細胞的存活率有促進作用,但在整個濃度范圍內中國沙棘乙醇提取物對HepG2細胞的存活率與對照組一致,證明在實驗濃度(0.05～5 mg/mL)內對細胞無毒作用,故后繼實驗中提取物濃度選定在5 mg/mL以內進行。

圖2 不同濃度中國沙棘乙醇提取物 對HepG2細胞存活率的影響Fig.2 Effects of ethanol extracts of Chinese seabuckthorn at different concentrations on the viability of HepG2 cells

2.2.2 中國沙棘乙醇提取物的細胞內抗氧化活性 陰性對照(NTC)未經過氧化氫刺激,HepG2細胞陽性細胞率相對較低,僅為6.87%;當用過氧化氫處理后,HepG2細胞內顯示出高含量的活性氧,且陽性對照(PTC)的陽性細胞率達到了84.17%;而HepG2細胞經乙醇提取物(0.5、1、5 mg/mL)處理后,其陽性細胞率與陽性對照相比分別降低了75.22%、72.36%和78.2%。由此表明,中國沙棘乙醇提取物在HepG2細胞內表現出良好的抗氧化能力(圖3)。

圖3 不同濃度中國沙棘乙醇提取物 對HepG2細胞陽性細胞率的影響Fig.3 Effect of ethanol extracts of Chinese seabuckthorn at different concentrations on positive cell ratio of HepG2 cells注：Blank(空白);NTC(陰性對照);PTC(陽性對照); A, B, C分別為0.5,1,5(mg/mL)提取物處理組。

3 結論與討論

沙棘漿果富含類黃酮、多酚、維生素等多種活性成分[17],具有良好的抗氧化性[18]。本研究發(fā)現,中國沙棘漿果乙醇提取物對ABTS、NO自由基具有良好的清除能力,且在濃度為5 mg/mL時，提取物的總抗氧化能力與陽性對照BHT的總抗氧化能力相當。此外,中國沙棘漿果乙醇提取物還能有效清除HepG2細胞內的活性氧。雖然中國沙棘漿果的體外抗氧化研究已有零星報道,但有關中國沙棘漿果乙醇提取物體外生化水平抗氧化活性的系統分析以及應用HepG2細胞模型的細胞抗氧化研究屬首次報道。

本研究結果顯示,中國沙棘表現出的良好抗氧化活性,與采用乙醇處理漿果后大量黃酮等酚類物質溶出密切相關。該結果與前人采用乙醇提取楊梅和葡萄皮渣中的酚類物質結果類似[19-20]。由于乙醇具備良好溶解性及細胞穿透力,當用一定體積分數的乙醇處理果實原料時,使得組織細胞內外的濃度差變大,從而促進了黃酮的溶出[21]。

本研究發(fā)現,中國沙棘漿果乙醇提取物除了對ABTS自由基具有良好的清除作用外,還可抑制亞油酸脂質過氧化。而該結果與俄羅斯大果沙棘黃酮粗提物對ABTS自由基具有清除能力[8],及印度柳葉沙棘漿果乙醇提取物可抑制亞油酸脂質過氧化[7]的結果類似。本研究還發(fā)現,中國沙棘漿果乙醇提取物可有效清除NO自由基,且清除效果明顯優(yōu)于甲醇提取物對NO自由基的清除效果[2]。本研究采用的四種體外抗氧化評價方法均是基于抗氧化劑具有良好的供氫或供電子的能力。而黃酮正是通過分子中的酚羥基提供氫原子與自由基反應產生較穩(wěn)定的半醌式自由基而實現清除自由基的目的[22]。因此,中國沙棘乙醇提取物所表現出良好的抗氧化活性與其中較高的總黃酮含量密切相關[23]。

上述研究均為基于生化水平的體外測定,并不能準確反映抗氧化成分在機體內部的生物利用率、吸收、運輸、代謝及其在機體內有效的作用濃度。因此,一種基于細胞模型的生物方法,即細胞抗氧化(cellular antioxidantactivity,CAA)法被廣泛用于抗氧化活性的評價體系中[24]。與傳統化學法相比,CAA法更能準確預測植物化學物質在機體內的抗氧化效果[25]。本研究結果顯示,中國沙棘乙醇提取物可以有效降低HepG2細胞的陽性細胞率。該結果與印度柳葉沙棘漿果乙醇提取物改善淋巴細胞的抗氧化活性[26],及黑莓粗提物對人類腸道細胞INT-407具有細胞抗氧化能力[27]的結果類似。

有研究表明,葡萄的總抗氧化活性與其總酚及總黃酮含量呈顯著相關性,其CAA活性與葡萄中的總黃酮具有顯著相關性[28]。也有人發(fā)現,具有某些特殊結構的類黃酮的CAA活性較強[29],這些物質包括異鼠李素、山奈酚、楊梅酮等[30]。由于異鼠李素、山奈酚、槲皮素等化合物普遍存在于中國沙棘漿果中[31]。因此,推測中國沙棘漿果的細胞抗氧化活性可能與這些成分密切相關。此外,中國沙棘還含有多糖、有機酸、類胡蘿卜素、維生素等多種抗氧化成分,因此,其良好的抗氧化活性除了與其高含量的總酚及總黃酮相關外,也與這些組分相關,并且是多種組分之間相互協同作用的結果[32]。但何種組分對中國沙棘漿果的抗氧化貢獻最大,這些組分之間如何發(fā)揮抗氧化協同作用尚有待今后進一步研究。

綜上所述,中國沙棘乙醇提取物可有效清除ABTS自由基、NO自由基,在亞油酸脂質過氧化方面具有較好的抑制效果,并表現出良好的總抗氧化能力,當濃度為5 mg/mL時,其ABTS自由基的清除效果及總抗氧化能力與陽性對照BHT相當。此外,中國沙棘乙醇提取物對HepG2細胞也具有良好的抗氧化能力。中國沙棘良好的抗氧化活性與其較高的總酚及總黃酮含量密切相關。

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Antioxidant activity of ethanol extracts from Chinese seabuckthorn berriesinvitroand on HepG2 cells

SU Hai-lan1,WEI Juan1,BI Yang1,*,LI Ji-xin1,Yury Zubarev2,Alexander Kanarskiy2

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Lisavenko Research Institute of Horticulture for Siberia,Barnaul 656045,Russia)

In this research,the antioxidant capacity of ethanol extracts from Chinese seabuckthorn berries was comprehensively analyzedinvitroat biochemical level. On the basis of evaluation of cytotoxicity,flow cytometry method was used to analysis the cellular antioxidant activity of the ethanol extracts in HepG2 cells. The results showed that the extracts had an effectively removal effect on ABTS free radicals,when the concentration reached at 5 mg/mL,the scavenging rate was similar to that of positive control BHT. The extracts also effectively inhibited NO free radicals,however,the inhibition rate was weaker than that of BHT at the same concentration. The extracts at 5 mg/mL significantly inhibited lipid peroxidation,however,the inhibition rate was lower than that of BHT at the same concentration. The total antioxidant capacity was enhanced as the concentration increased,when the concentration reached at 5 mg/mL,the total antioxidant capacity was similar to that of BHT. Among the concentration of 0.05～5 mg/mL,the extracts showed no cytotoxicity. At the concentration of 0.5,1,5 mg/mL,the positive cells rate of extracts was reduced by 75.22%,72.36% and 78.2% compared with the positive control respectively. It is suggested that ethanol extracts from Chinese seabuckthorn not only had a stronger antioxidant capacity at biochemical level,but also had an antioxidant ability at the cellular level.

seabuckthorn;ethanol extracts;antioxidant;HepG2 cells

2016-09-09

蘇海蘭(1992-)，女，碩士研究生，研究方向:果蔬采后生物學與技術,E-mail：18298332380@163.com。

*通訊作者:畢陽(1962-)，男，博士，教授，研究方向:果蔬采后生物學與技術,E-mail：biyang@gsau.edu.cn。

國家科技部國際合作專項2014DFR31230。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0093-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.009