高玉榮，崔素萍，徐國棟，李大鵬，張麗媛，王欣

Garviecin LG34抗菌機理研究

高玉榮，崔素萍，徐國棟，李大鵬，張麗媛，王欣

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

以金黃色葡萄球菌為指示菌，研究了細菌素Garviecin LG34對革蘭氏陽性菌的抗菌機理。結果表明，Garviecin LG34導致金黃色葡萄球菌細胞內的K+及260 nm和280 nm處紫外吸收物質的大量滲漏，并導致平均通道熒光強度（MnX）的顯著提高。Garviecin LG34導致了金黃色葡萄球菌細胞膜上形成了較大的孔洞，細胞膜的滲透性增大，從而導致細胞死亡。

細菌素；Garviecin LG34；金黃色葡萄球菌；抗菌機理

0 引言

隨著人們健康意識的增強及對食品安全的重視程度逐漸提高，開發(fā)新型安全高效的抗菌劑進行食品防腐保藏已經成為食品工業(yè)的重要發(fā)展方向。乳酸菌細菌素是由乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞外的具有抗菌活性的多肽類物質[1]。與化學防腐劑相比，乳酸菌細菌素在起到抑菌殺菌作用的同時，對人體沒有任何毒副作用，可以被人體的蛋白酶水解成氨基酸，因此被國內外公認為安全的生物防腐劑[2]。

課題組在前期的研究中，從發(fā)酵酸黃瓜中篩選到1株產新型廣譜乳酸菌細菌素的Lactococcus garvieae LG34（格氏乳球菌），并對其產生的細菌素Garviecin LG34（格氏乳球菌素）進行了分離純化，發(fā)現分子量和抑菌譜不同于目前已發(fā)現的格氏乳球菌素，是一種新型廣譜的細菌素，不僅能抑制革蘭氏陽性菌，也能抑制革蘭氏陰性菌，具有作為生物防腐劑的應用前景[3-4]。為了更好地進行Garviecin LG34在食品中的應用研究，試驗以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌為指示菌，探討了Garviecin LG34對革蘭氏陽性菌的抗菌機理，為新型廣譜生物防腐劑的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 Garviecin LG34

將Lactococcus garvieae LG34斜面菌種1~2環(huán)轉接到裝有10mLMRS液體培養(yǎng)基的試管中混合均勻，于28~30℃條件下培養(yǎng)18 h，按2%接種量接入裝有200mL的MRS液體培養(yǎng)基中，于30℃條件下發(fā)酵36 h。將發(fā)酵液離心（6 000 r/min，15 min），將上清液的pH值調整至7.0，用旋蒸儀濃縮10倍。用4倍冷乙醇沉淀處理，取上清液用旋蒸儀濃縮至原體積的1/2。

1.1.2 指示菌

金黃色葡萄球菌ATCC 63589，黑龍江八一農墾大學微生物實驗室保藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 Garviecin LG34對細胞內K+滲漏的影響

將金黃色葡萄球菌ATCC 63589過夜培養(yǎng)的菌懸液，加入Garviecin LG34，終濃度為320 AU/mL。于37℃條件下放置，隔20min取樣，菌液于0℃條件下以轉速10 000 r/min離心7min。采用M5型原子吸收光譜儀測定上清液中的K+濃度。

1.2.2 Garviecin LG34對260 nm紫外吸收物質滲漏的影響

將處于對數期的10 mL OD600為0.8~1.0的金黃色葡萄球菌ATCC 63589，以轉速6 000 r/min離心15 min收集菌體，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5滅菌磷酸緩沖溶液清洗2次。然后用320 AU/mL細菌素Garviecin LG34處理，在37℃條件下處理0，20，40，60，80，100min后，以轉速6 000 r/min離心15 min收集菌體，上清液經0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。于波長260 nm處測定細胞懸浮液的吸光度，以菌體懸浮在不含細菌素的純凈水中作為空白對照[5]。

1.2.3 Garviecin LG34對280 nm紫外吸收物質滲漏的影響

將處于對數期的10 m L OD600為0.8~1.0的金黃色葡萄球菌ATCC 63589，以轉速6 000 r/min離心15 min收集菌體，用10 mL的5 mmol/L pH值6.5滅菌磷酸緩沖溶液清洗2次。然后用320 AU/mL細菌素Garviecin LG34處理，在37℃條件下處理0，20，40，60，80，100min后，以轉速6 000 r/min離心15 min收集菌體，上清液經0.2μm的微孔濾膜過濾除菌。于波長280 nm處測定細胞懸浮液的吸光度，以菌體懸浮在不含細菌素的純凈水中作為空白對照[5]。

1.2.4 Garviecin LG34對細胞內核酸類物質滲漏的影響

處于對數期的10mLOD600為0.8~1.0的金黃色葡萄球菌ATCC 63589，以轉速6 000 r/min離心15min離心收集菌體，用10mL的5mmol/L pH值6.5滅菌磷酸緩沖溶液清洗2次。然后用抑菌Garviecin LG34處理，在37℃條件下處理30 min和60 min后，以轉速6 000 r/min離心15min收集菌體。以菌體懸浮在不含Garviecin LG34的純凈水中作為空白對照，以碘化丙啶（PI）為染色劑，用流式細胞儀分析試驗樣品與對照樣品的PI熒光強度[6]。

2 結果與討論

2.1 Garviecin LG34對細胞內K+滲漏的影響

細胞內K+是否大量滲漏到細胞外，能反映其細胞通透性的提高，為了研究Garviecin LG34對細胞通透性的影響，試驗研究了細菌素作用金黃色葡萄球菌后細胞內K+滲漏的情況。

對金黃色葡萄球菌細胞內K+泄露的影響見圖1。

圖1 對金黃色葡萄球菌細胞內K+泄露的影響

由圖1可知，細菌素Garviecin LG34作用金黃色葡萄球菌20min以后，細胞內的K+大量滲漏到細胞外，與空白對照相比差異顯著；作用80 min后，滲漏減慢。

2.2 Garviecin LG34對細胞內260 nm紫外吸收物質滲漏的影響

核酸類物質的最大吸收峰為260 nm，核酸物質的滲漏情況能反映出細胞膜上大孔洞的形成情況，因此試驗研究了Garviecin LG34對金黃色葡萄球菌細胞內260 nm紫外吸收物質滲漏的影響。

對金黃色葡萄球菌細胞內260 nm紫外吸收物質泄露的影響見圖2。

圖2 對金黃色葡萄球菌細胞內260 nm紫外吸收物質泄露的影響

核酸最大吸收波長為260 nm，于波長260 nm處的光密度通常被用來評價核酸的濃度。由圖2可知，用Garviecin LG34處理金黃色葡萄球菌40 min后，于波長260 nm處的ΔOD顯著高于用蒸餾水處理的空白樣品。結果表明，用Garviecin LG34處理后，細胞內260 nm紫外吸收物質可以大量滲透到細胞外。

2.3 Garviecin LG34對細胞內280 nm紫外吸收物質滲漏的影響

蛋白質的最大吸收波長為280 nm，因此在280 nm的光密度通常被用來評價蛋白質的濃度，細胞內蛋白質的滲漏情況能反映出細胞膜上大孔洞的形成情況，因此試驗研究了Garviecin LG34對金黃色葡萄球菌細胞內280 nm紫外吸收物質滲漏的影響。

對金黃色葡萄球菌細胞內280 nm紫外吸收物質泄露的影響見圖3。

圖3 對金黃色葡萄球菌細胞內280 nm紫外吸收物質泄露的影響

由圖3可知，用Garviecin LG34處理金黃色葡萄球菌40min后，于波長280 nm處的ΔOD顯著高于用蒸餾水處理的空白樣品。這些結果表明用Garviecin LG34處理后，細胞內280 nm紫外吸收物質可以大量滲透到細胞外。

2.4 流式細胞儀測定細胞的通透性

流式細胞儀目前被廣泛用于細胞損傷的研究中，主要的評價指標為平均通道熒光強度（MnX）。試驗研究了用Garviecin LG34處理金黃色葡萄球菌對細胞通透性的影響。

用Garviecin LG34處理后金黃色葡萄球菌的平均通道熒光強度見表1。

表1 用Garviecin LG34處理后金黃色葡萄球菌的平均通道熒光強度

由表1可知，用Garviecin LG34處理30 min和60min后，MnX從2.66分別提高到5.23和6.43。這說明Garviecin LG34的處理導致了金黃色葡萄球菌細胞中碘化丙錠摻入量的增加，說明細胞膜的滲透性增大，在細胞膜上形成了較大的孔洞。

3 結論

細菌素Garviecin LG34作用金黃色葡萄球菌20min以后，細胞內的K+大量滲漏到細胞外，與空白對照相比差異顯著；在作用80 min后，滲漏減慢。用Garviecin LG34處理后，細胞內260 nm和280 nm紫外吸收物質可以大量滲透到細胞外。用Garviecin LG34處理30 min和60 min后，MnX從2.66分別提高到5.23和6.43。這說明Garviecin LG34的處理導致了金黃色葡萄球菌細胞中碘化丙錠摻入量的增加，說明細胞膜的滲透性增大，在細胞膜上形成了較大的孔洞。

[1]劉國榮，李平蘭，王成濤.乳酸菌細菌素作為天然生物防腐劑在食品工業(yè)中的應用進展[J].北京工商大學學報（自然科學版），2012（2）：64-69.

[2]丹彤，張和平.乳酸菌細菌素的分類、生物合成及其應用[J].中國乳品工業(yè)，2013，41（3）：29-32.

[3]Yurong Gao，Dapeng Li，Shan Liu，etal.Garviecin LG34，a novel bacteriocin produced by Lactococcus garvieae isolated from traditional Chinese fermented cucumber[J].Food Control，2015（5）：896-899.

[4]劉姍，高玉榮.格氏乳球菌素LG34生物穩(wěn)定性的研究[J].黑龍江八一農墾大學學報，2013，25（3）：67-70.

[5]翟培，韓晉輝，侯麗霞，等.家蠅抗菌肽的抑菌動力學研究及其機理初探[J].中國生物工程雜志，2006，26（11）：33-39.

[6]喬長庚.溫和壓力對酵母活性與犁頭霉生物轉化的影響[D].天津：天津科技大學，2005.◇

AntimicrobialMechanism of Garviecin LG34

GAO Yurong，CUISuping，XUGuodong，LIDapeng，ZHANG Liyuan，WANG Xin
（Food College，Heilongjiang BayiAgricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

Using Staphylococcusaureus as indicator strain，the antimicrobialmechanism of Garviecin LG34 againstGram-positive bacteria is researched.The results show that Garviecin LG34 led to the great leakage of K+，and cell substance absorbing ultraviolet in 260 nm and 280 nm，and the significant increase in MnX.Garviecin LG34 results in the produce of large hole in the cellmembrane of Staphylococcus aureus and the leakage increase and finially led the cell dead.

bacteriocin；Garviecin LG34；Staphylococcus aureus；antimicrobialmechanism

Q93

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.005

1671-9646（2017）04a-0014-03

2017-03-19

黑龍江省教育廳科學技術研究（面上）項目（12541589）。

高玉榮（1970—），女，博士，教授，碩士生導師，研究方向為食品微生物及發(fā)酵工程方面的教學及研究。