彭大云 賴續(xù)文 張 偉* 陳曉東 賴日權 閆廣寧

全自動免疫組化儀在標準化染色質量控制中的應用

彭大云①賴續(xù)文①張 偉①*陳曉東①賴日權①閆廣寧①

目的：探討全自動免疫組化儀在標準化染色質量控制中的應用。方法：選擇廣譜細胞角蛋白(CKpan)、雌激素受體(ER)、突觸素(Syn)、上皮生長因子受體(EGFR)及C-erbB-2蛋白(HER2)等34種抗體(一抗)，使用統(tǒng)一的第二抗體(二抗)，分別采用手工操作和全自動免疫組化儀兩種方法對340張病理切片進行染色，統(tǒng)計比較兩種方法的染色優(yōu)良率，同時回顧性分析室間質量控制染色評價結果。結果：兩種方法染色質量結果比較：①手工操作的170張病理切片中染色質量優(yōu)等101張(占59.4%)，良49張(占28.8%)，差20張(占11.8%)，優(yōu)良率為88.2%；②全自動免疫組化儀染色的170張病理切片中染色質量優(yōu)等140張(占82.3%)，良28張(占16.5%)，差2張(占1.2%)，優(yōu)良率為98.8%；兩種方法優(yōu)良率比較差異顯著有統(tǒng)計學意義(x2=15.746，P＜0.05)；室間質量控制平均判讀符合率為97.9%，染色符合率為96.0%，整體符合率為93.9%。結論：全自動免疫組化儀染色標準化程度高，染色均勻，定位準確，背景干凈，無邊緣效應，重復性好，能保證染色結果的準確與穩(wěn)定，為臨床病理診斷、判斷預后和指導用藥提供科學、準確及可靠的依據。

臨床病理診斷；免疫組織化學；全自動免疫組化儀；手工操作染色；質量控制

彭大云,男,(1976- ),本科學歷，主管技師。廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科，從事臨床常規(guī)病理、免疫組織化學及分子病理學技術工作。

隨著精準醫(yī)學靶向治療的興起，免疫組織化學染色正逐漸走出單一輔助常規(guī)病理診斷的角色，發(fā)展為科學研究、判斷患者預后以及協(xié)助臨床用藥的重要輔助手段[1-2]。然而，在臨床實際工作中，因環(huán)境、方法及個人操作差異等諸多因素影響到染色結果的準確與穩(wěn)定。全自動免疫組化儀的應用對染色標準化起到了一定的推動，有效解決了人為造成的染色結果假象問題[3-4]。為此，本研究對手工操作和全自動免疫組化儀兩種方法的染色質量結果進行比較，并回顧性分析2012-2015年參加衛(wèi)生計生委病理質量控制中心組織的室間質量控制評價反饋結果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2016年1-9月廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科乳腺癌、肺癌、肝癌、淋巴瘤以及間質瘤等常見手術切除標本，檢測項目涉及34種抗體(一抗)，均同時切2張片，共計340張片，用于手工操作及自動染色儀器染色，各染色170張片；外院室間質控切片由病理質量控制中心統(tǒng)一提供，所有切片厚度均≤3 μm，經恒溫箱58 ℃烤片≥2 h。

1.2 儀器與試劑

(1) Dako Autostainer Link48型全自動免疫組化儀、PTlink脫蠟修復一體機，二抗及DAB顯色系統(tǒng)均為丹麥Dako公司配套產品。CIMO DNP-9052BS-III恒溫箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

(2)一抗試劑：雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、波形蛋白(Vimentin)、CD3、CD20及CD79購于丹麥Dako公司；突觸素(synaptophysin，Syn)、嗜鉻素A (chromogranin A，CgA)、細胞角蛋白19(cytokeratin 19，CK19)、上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、神經元特異性烯醇化酶(neuron specific endolase，NSE)、CD117以及Dog-1購于英國NovocastraTM公司；廣譜細胞角蛋白(cytokeratin pan ，CKpan)、內皮細胞標記(CD34)、癌胚抗原(CEA)、甲狀腺轉錄因子(TTF-1)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein，GFAP)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)、前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)、肝細胞(hepatocyte，HepPar-1)、C-erbB-2蛋白(HER2)以及Ki67等購于美國OriGene公司，均為即用性工作液。

1.3 染色及評估方法

(1)采用EnVision兩步法。質量控制中心所寄切片均由儀器染色；本研究中的340張切片由5名染色技術人員分批采用兩種方法染色同時完成，每張切片均按需設定陰性和陽性對照，染色完成后判讀結果。

(2)由2名經驗豐富的病理醫(yī)師按標準判讀，統(tǒng)一意見給出最終染色質量結果；室間質量控制染色判讀結果登記表和染色切片一同寄回病理質量控制中心，由質量控制中心組織資深病理學專家以雙盲方式集中閱片判讀評分，統(tǒng)計反饋結果。

1.4 評估指標

(1)切片染色質量結果按優(yōu)、良、差3個等級統(tǒng)計，其標準為：①優(yōu)，定位準確，背景干凈，著色均勻，無邊緣效應及非特異性染色；②良，定位較準確，著色較均勻，有少量邊緣效應及非特異性染色；③差，定位不準確，著色不均，非特異性染色嚴重。染色優(yōu)良率計算為公式1：

(2)室間病理質量控制評測中心反饋指標及標準：判讀符合率主要反映該科室評分標準與專家評分標準的一致性。判讀符合率計算為公式2：

(3)染色符合率主要反映該科室染色水平。染色符合率計算為公式3：

(4)整體符合率主要反映該科室實際檢測水平，包括技術人員染色水平和病理醫(yī)生評分水平。整體符合率計算為公式4：

以上3項，即公式(2)、公式(3)及公式(4)指標均≥90%為室間質量控制評測合格。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計數資料兩兩比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法染色質量評估結果比較

CKpan、CEA、HER2、ER、CD20、CD117以及Dog-1等34種一抗分別采用手工和全自動免疫組化儀兩種方法染色，按標準進行判讀評估，染色質量結果按優(yōu)、良、差3個等次進行統(tǒng)計，各種一抗每組具體染色質量評估結果統(tǒng)計見表1。

表1 34種一抗采用手工及儀器兩種染色方法的染色質量評估結果

2.2 兩種方法染色質量結果比較

手工操作和全自動免疫組化儀兩種方法染色質量結果比較：①手工操作，170張病理切片中染色質量優(yōu)101張(占59.4%)，良49張(占28.8%)，差20張(占11.8%)，優(yōu)良率為88.2%(150/170)；②全自動免疫組化儀，170張病理切片中染色質量優(yōu)等140張(占82.3%)，良28張(占16.5%)，差2張(占1.2%)，優(yōu)良率為98.8%(168/170)；兩組方法染色質量結果比較，差異有統(tǒng)計學意義(x2=15.746，P＜0.05)，見表2。

表2 手工與儀器兩種染色方法的染色質量結果比較[張(%)]

2.3 室間病理質量控制中心評測結果

2012-2015年參加廣東省及國家衛(wèi)生計生委病理質量控制中心組織的室間質量控制評測，所有評測項目均由全自動免疫組化儀染色，按標準判讀評估，質量控制中心反饋結果顯示，總體平均判讀符合率為97.9%，染色符合率為96.0%，整體符合率為93.9%，見表3。

表3 2012-2015年參加的室間質量控制評測項目及各評估指標反饋結果

3 討論

免疫組化檢測是一種技術性很強的綜合性技術，其步驟多，時間長，操作過程中難免會因個人手法差異、抗原修復、試劑滴加、切片沖洗以及環(huán)境溫度與濕度等多重因素影響而產生人為的實驗誤差，影響染色結果的準確性與穩(wěn)定性。為得到準確可靠的免疫組化結果，整個檢測過程中進行標準化的質量控制顯得尤為重要[5-6]。

本研究中，切片由5名技術人員在不同時間分批次同時完成手工和全自動免疫組化儀染色，其目的是最大化摸擬不定因素對于染色質量的影響。在兩種染色方法質量結果比較中，結果為優(yōu)的，手工操作占59.4%，全自動免疫組化儀占82.3%；結果為良的，手工操作占28.8%，全自動免疫組化儀占16.5%；結果為差的，手工操作占11.8%，全自動免疫組化儀占1.2%；總體染色優(yōu)良率手工操作為88.2%，全自動免疫組化儀為98.8%；數據比較差異顯著，有統(tǒng)計學意義。由病理質量控制中心反饋的質量控制評價結果顯示，總體平均判讀符合率為97.9%，染色符合率為96.0%，整體符合率為93.9%；因參加國家病理質量控制評價中心的HER2質量控制每輪需染30張切片，其中僅二次因組織掉片、蘇木素過染和醫(yī)生判讀標準未能正確把握而造成符合率＜90%未能通過室間質量控制評價。本研究結果表明，全自動免疫組化儀染色均勻，定位準確，背景干凈，重復性好，為免疫組化染色標準化提供了有利條件[7-8]。同時，解決了外來干擾因素的影響，在節(jié)約人力、物力基礎上，提高了實驗結果的精準度和標準化。本研究與其他文獻報道結論相近，即全自動免疫組化儀染色質量明顯優(yōu)于手工操作[9-14]。

日常實際操作儀器染色過程中為保證結果準確與穩(wěn)定，需要注意以下細節(jié)：①粘附玻片的選擇，盡量選用經過特殊處理帶有正電荷的粘附玻片，便于試劑的彌散對組織的全覆蓋，而本研究發(fā)現應用多聚賴胺酸、APES制成的涂膠片試劑會出現收縮，對較大組織不能全覆蓋，易引起邊緣效應或陰陽臉；②先脫蠟再行PTlink修復，盡管PTlink中的修復液具有脫蠟功能，但在應用過程中發(fā)現染色切片較多時靠后批次的切片脫蠟不徹底，易致染色不均，有非特異性背景，通過摸索發(fā)現，在PTlink修復前經二甲苯脫蠟預處理將較好的改善這一問題；③試劑量的選擇與滴加，本機提供100 μl、150 μl及200 μl等多種選擇，在應用中發(fā)現150 μl的量不論組織大小都足以覆蓋全玻片，而100 μl太少，200 μl太多造成不必要的浪費增加成本，同時應盡量根據組織的撈片位置靈活設置試劑滴加區(qū)域；④清洗與保養(yǎng)，Dako Autostainer Link48染色儀軟件上設置有每染完200張切片就會自動提示進行清洗，為保證染色正常進行，必須即時用配套的DAB-Away試劑清洗，同時要定時聯(lián)系Dako廠商進行全面的系統(tǒng)性維護保養(yǎng)，對切片架進行水平校準；⑤廢液的回收與處理，Dako Autostainer Link48具有廢液回收系統(tǒng)，將有毒的DAB和無毒的Buffer液按不同的管道回收，分別按不同要求專業(yè)化處理，有利于環(huán)保和實驗操作人員健康[15]。

4 結語

全自動免疫組化儀的應用不僅有利于免疫組化的標準化質量控制、保證染色結果的準確與穩(wěn)定、為臨床患者的病理診斷、治療及預后判斷提供準確依據，同時還有利于環(huán)保和健康。但必須結合實際，對于無法購置全自動免疫組化儀的實驗室，在采用手工染色時必須嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，做好質量控制工作。

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Objective: To discuss the application of immunohistochemistry autostainer in the quality control of standardized dyeing. Methods: 34 categories primary antibodies, such as cytokeratin pan (CKpan), estrogen Receptor (ER), synaptophysin (Syn), epidermal growth factor receptor (EGFR), C-erbB-2(HER2) and so on, and uniformly second antibody were used in the manual operation (dyed 170 pathological section) and immunohistochemistry autostainer (dyed 170 pathological section), respectively. And to statistic and compare the excellent rate of dyeing for the two methods, at the same time, retrospective analysis study was used to analyze the dyeing results of external quality control assessment. Results: Quality control of standardized dyeing by manual: 59.4% (101/170) were evaluated as excellent, 28.8% (49/170 ) were evaluated as good and 11.8% (20/170 ) were evaluated as poor; the overall excellent and good rate was 88.2% (150/170). Quality control of standardized dyeing by immunohistochemistry autostainer: 82.3% (140/170)were evaluated as excellent, 16.5% (28/170 ) were evaluated as good and 1.2% (2/170) as poor; the overall excellent and good rate was 98.8% (168/170). The difference between two groups was statistical significant (x2=15.746, P＜0.05). The average interpretation coincidence rate of external quality control was 97.9%, and the dyeing coincidence rate was 96.0% and overall coincidence rate was 93.9%. Conclusion: Immunohistochemistry autostainer is highly standardized, with uniform staining, accurate positive results, clear background and good repeatability, without edge effect; and it can ensured accuracy and stability for dyeing result, which can provide more scientific, accurate and reliable evidences for clinical pathological diagnosis, judgment prognosis and guiding medication.

Clinical pathological diagnosis; Immunohistochemistry; Immunohistochemistry autostainer; Manual operation dyeing; Quality control.

1672-8270(2017)03-0036-04

R446.8

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.03.009

2016-11-09

①廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院病理科 廣東 廣州 510010

*通訊作者：zw54177@126.com

Application of immunohistochemistry autostainer in the quality control of standardized dyeing/ PENG Da-yun, LAI Xu-wen, ZHANG Wei, et al//China Medical Equipment,2017,14(3):36-39.

[First-author’s address] Department of Pathology, General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, China.