鄒艷，李俊杰，夏詩棋，管斌*，孔青

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

高生物量富硒產(chǎn)朊假絲酵母菌株的選育

鄒艷，李俊杰，夏詩棋，管斌*，孔青

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

從5株優(yōu)良的發(fā)酵酵母菌中篩選出耐硒和富硒能力較好的產(chǎn)朊假絲酵母，采用耐酸馴化和梯度濃度的耐硒馴化增加菌株的抗性。研究表明，產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ的富硒能力更好。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)復(fù)合誘變、亞硒酸鈉抗性平板初篩和搖瓶復(fù)篩，篩選出生物量和含硒量都較高的菌株D-5，再將突變株D-5進(jìn)行紫外誘變，篩選出1株高生物量和高含硒量的菌株U-16，其菌株生物量為5.86 g/L，總硒量為1 575.40 μg/g，有機(jī)硒量為1 500.90 μg/g，其有機(jī)硒占胞內(nèi)總硒比重的95.26%。與出發(fā)菌株相比，篩選菌株的生物量提高了67.90%，有機(jī)硒量增加了95.95%。

有機(jī)硒；產(chǎn)朊假絲酵母；誘變；生物量

ZOU Yan,LI Junjie,XIA Shiqi,GUAN Bin*,KONG Qing
(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

硒是維持生物體正常代謝所必需的微量元素[1-3]。盡管每日所需的攝入量非常少，但卻在人體中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]，缺硒會引起克山病[5]。而我國是一個缺硒大國[6]，經(jīng)過取樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國土面積的72%都屬于缺硒地區(qū)，缺硒地區(qū)的人口占到我國總?cè)丝诘?/3。硒源可分為兩大類：有機(jī)硒和無機(jī)硒。與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒具有毒性小[7]，機(jī)體吸收率高[8]，有利于在動物體內(nèi)吸收利用[9]等優(yōu)點(diǎn)。有機(jī)硒在生物體中主要以硒蛋白和硒代氨基酸的形式存在，是一些抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）[10]的組成部分，有保護(hù)細(xì)胞免受自由基破壞的作用[11-12]。酵母能將環(huán)境中的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒[13]，具有較強(qiáng)的富硒能力。同時，酵母含有多種氨基酸、維生素和豐富的輔酶以及生物活性物質(zhì)[14]如還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）。因此硒酵母在醫(yī)療保健領(lǐng)域中受到了廣泛的關(guān)注。

誘變是指利用一些化學(xué)、物理或者生物因素誘發(fā)生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，并且基因的突變頻率比自發(fā)突變率高[15]，因此可利用微生物誘變育種篩選發(fā)生正向突變富硒能力強(qiáng)的菌株[16]。

本試驗(yàn)通過耐硒和富硒試驗(yàn)，從5株酵母菌中選出一株富硒能力強(qiáng)的酵母菌，并對此菌株進(jìn)行化學(xué)-紫外復(fù)合誘變提高酵母的富硒和耐硒能力，從而獲得一株高生物量的富硒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）Ⅰ和Ⅱ：中國科學(xué)院微生物保藏中心，熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、球擬酵母（Tetragenococcus halophila）：保存于本研究室。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH6.0。

斜面固體培養(yǎng)基、固體分離培養(yǎng)基：酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基，在液體種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加瓊脂粉2 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉5 g/L，硫酸銨8 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，在培養(yǎng)12 h時加入亞硒酸鈉25 μg/mL（直徑為0.2 μm的濾膜過濾除菌），pH6.0。

1.2 儀器與設(shè)備

SPS202F型電子分析天平：梅特勒-托利多承重設(shè)備有限公司；PHS-2F型數(shù)字pH計、722N型可見分光光度計：上海精科電子有限公司；G2X-9137MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱：東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；ZDX-35BI型高壓蒸汽滅菌鍋、BCM-1000型超凈工作臺：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

菌種活化：將保存于斜面上的菌種接種到斜面固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)36 h，置于冰箱中保藏備用。

種子培養(yǎng)：斜面種子經(jīng)活化培養(yǎng)后，向種子培養(yǎng)基（100 mL/500 mL）中接入菌體，培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基（50mL/250mL）中接入10%的種子液，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)48 h。1.3.2不同菌株耐硒能力比較

通過將5株酵母菌接種到初始亞硒酸鈉質(zhì)量濃度分別為0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36 h，測定酵母的生物量。

1.3.3 不同菌株富硒能力比較

將5株酵母菌接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再按接種量10%的比例接種到亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為25 μg/mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，然后測定酵母的有機(jī)硒含量和有機(jī)硒比重，選出一株富硒能力強(qiáng)的酵母，保藏備用。

1.3.4 菌種的抗性馴化

耐酸馴化：按照10%的接種量將種子液分別接種于pH值為5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，觀察生長情況以此確定馴化起點(diǎn)。再按照參考文獻(xiàn)[17]的步驟進(jìn)行馴化。

耐硒馴化：選用增加梯度濃度的方法來馴化酵母菌，馴化步驟如下：斜面菌種→搖瓶培養(yǎng)（亞硒酸鈉含量為5 μg/mL）→梯度稀釋涂平板（亞硒酸鈉含量為10μg/mL）→挑單菌落于斜面搖瓶培養(yǎng)（亞硒酸鈉含量為10μg/mL）……重復(fù)上述過程，直到培養(yǎng)基中亞硒酸鈉含量為60 μg/mL為止。從兩株產(chǎn)朊假絲酵母中選出一株經(jīng)耐酸和耐硒馴化后生物量和富硒量都較好的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 化學(xué)-紫外復(fù)合誘變試驗(yàn)

菌懸液的制備：馴化后在斜面活化兩次，接至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h至對數(shù)期。取10 mL培養(yǎng)液離心，然后用0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）洗滌離心兩次，加入20 mL緩沖液移至三角瓶中，加入滅好菌的玻璃珠，在搖床里150 r/min振蕩10 min。將分散好的菌懸液在血球計數(shù)板上計數(shù)，稀釋到107CFU/mL，待誘變。

化學(xué)誘變濃度的確定：在10 mL離心管中加入4 mL菌懸液，再加入硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES），使DES在總體系中的含量分別達(dá)到0.5%、1.0%、1.5%、2.0%進(jìn)行誘變，每個濃度設(shè)置兩個時間20 min和30 min，不同濃度、不同時間設(shè)置三個平行測定死亡率。

化學(xué)誘變時間的確定：確定最佳誘變濃度后，分別處理20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min，計算死亡率，制作致死率曲線，致死率在80%～90%的為最佳誘變時間[22]。

平板初篩：取在最佳誘變劑量下誘變的菌懸液，用無菌生理鹽水制成不同稀釋度的菌懸液，取0.1 mL直接涂布于硒含量為60 μg/mL平皿上，于28℃恒溫培養(yǎng)2 d。以未經(jīng)化學(xué)誘變的菌落作對照皿，挑取菌落較大且顏色較淺呈粉紅色[23]的進(jìn)行復(fù)篩。

搖瓶復(fù)篩：挑取菌落較大、顏色較淺呈粉紅色的菌落，經(jīng)斜面?zhèn)鞔?次后，再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，測定其生物量、含硒量。選取含硒量和生物量高的菌株傳代5次測其遺傳穩(wěn)定性。

紫外誘變：將紫外燈預(yù)熱20 min使光源穩(wěn)定，取制備好的菌懸液5 mL置于直徑為6 cm的無菌平皿內(nèi)，放入無菌磁力攪拌棒，置磁力攪拌器上，15 W紫外燈下30 cm[24]處分別照射30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s。將處理的菌懸液稀釋10-4倍涂布平皿，于28℃避光培養(yǎng)2 d后，與未經(jīng)處理的菌液對比計算致死率，確定最佳誘變時間。

紫外誘變平板初篩和搖瓶復(fù)篩同化學(xué)誘變，經(jīng)紫外誘變后平板初篩需要避光培養(yǎng)[25]。

1.3.6 測定方法

生物量檢測方法：參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。

胞內(nèi)有機(jī)硒檢測方法：試樣的消化、胞內(nèi)總硒和胞內(nèi)無機(jī)硒的測定方法參照文獻(xiàn)[18-20]的方法進(jìn)行。胞內(nèi)有機(jī)硒含量的計算公式如下：

胞內(nèi)有機(jī)硒含量=胞內(nèi)總硒含量-胞內(nèi)無機(jī)硒含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株的耐硒和富硒能力比較

以生物量作為菌株耐硒的指標(biāo)，菌株對硒的耐受性越強(qiáng)，則生物量越大。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加梯度濃度的亞硒酸鈉，在發(fā)酵結(jié)束后測得各株酵母的生物量如圖1所示。

從圖1可看出，球擬酵母在未添加亞硒酸鈉時的生物量最大，可是當(dāng)亞硒酸鈉含量超過5 μg/mL時，其生物量下降趨勢非常明顯，而熱帶假絲酵母和魯氏酵母下降趨勢比較平緩。亞硒酸鈉含量為10μg/mL時，產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ和Ⅱ的生物量受到很小的影響。

圖1 不同亞硒酸鈉含量對酵母生物量的影響Fig.1 Effects of different sodium selenite contents on yeast biomass

將5株酵母菌接種到亞硒酸鈉含量為25 μg/mL的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后酵母的有機(jī)硒含量和有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率見表1。

表1 不同菌株富硒能力的比較Table 1 Comparison of different strains on selenium-enriched ability

由表1可知，產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ的有機(jī)硒含量最高，熱帶假絲酵母的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為最高，但是由于熱帶假絲酵母的有機(jī)硒含量太低不能作為出發(fā)菌株。產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ和Ⅱ的有機(jī)硒含量和有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率都較高，可先選出這兩株菌進(jìn)行后續(xù)的馴化試驗(yàn)。

2.2 抗性馴化后菌株的生物量和富硒量

將種子液分別接種于pH值為5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h后，得到的生物量如圖2所示。

圖2 不同pH值對酵母生物量的影響Fig.2 Effect of different pH on yeast biomass

從圖2可看出，產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ和Ⅱ在pH值＜4.5時生物量有了明顯的下降，因此可確定耐酸馴化的起點(diǎn)為pH=4.5。

經(jīng)過耐酸馴化和耐硒馴化后，兩株菌在馴化前和耐酸馴化、耐硒馴化后在亞硒酸鈉含量為25 μg/mL的發(fā)酵液中培養(yǎng)，其生物量和富硒量分別見圖3和圖4。

圖3 馴化后菌株生物量比較Fig.3 Comparison of biomass of strains after domestication

圖4 馴化后菌株富硒能力比較Fig.4 Comparison of selenium-enriched ability of strains after domestication

從圖3和圖4可看出，與馴化前相比，在耐酸馴化后酵母菌的生物量沒有明顯的提高，而有機(jī)硒含量有提高，產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ提高了83.03 μg/g，產(chǎn)朊假絲酵母Ⅱ提高了58.81 μg/g，說明耐酸馴化對酵母富集有機(jī)硒有一定的促進(jìn)作用。而經(jīng)過耐硒馴化后，酵母對無機(jī)硒有了一定的耐受性，因此生物量都有增加，有機(jī)硒含量分別增加為769.88 μg/g和697.63 μg/g。其中產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ生物量和富硒量較Ⅱ來說，都較高一些，因此選用產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ做后續(xù)的誘變實(shí)驗(yàn)。

2.3 化學(xué)誘變篩選菌株

在誘變之前需要確定誘變劑DES的濃度和誘變的時間，出發(fā)菌株的致死率如圖5和圖6所示。

由圖5可知，當(dāng)DES含量為1.0%時，2個時間段的致死率變化不大，繪制致死曲線時效果不好；DES含量為2.0%時，2個時間段的致死率過高，突變較少。DES含量為1.5%時，2個時間段的致死率大約在50%～60%，誘變效果最好。

由圖6可知，用1.5%的DES處理50 min時致死率在86.32%，處理60 min時致死率在95.31%，再增加誘變時間致死率可達(dá)100%，當(dāng)致死率達(dá)到95%以上時突變率比較高，但大多數(shù)為負(fù)突變，活菌數(shù)太少導(dǎo)致正突變菌株太少，因此在選擇誘變時間為50 min。

圖5DES誘變劑和處理時間對菌株致死率的影響Fig.5 Effect of DES mutagenic agents and treatment time on strains mortality

圖61 .5%DES誘變不同時間的菌株致死率曲線Fig.6 Lethality curve of strains treated by 1.5%DES with different time

將在此條件下得到的誘變菌株在亞硒酸鈉含量為60 μg/mL的抗性平板上進(jìn)行篩選，挑選出了8株長勢良好的菌株進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)過反復(fù)的初篩和復(fù)篩，最終篩選出1株富硒量和生物量都較高的菌株D-5，生物量為4.39 g/L，總硒量為1 201.92 μg/g，有機(jī)硒量為1 152.72 μg/g。生物量提高不明顯，但是有機(jī)硒量比出發(fā)菌株提高了49.73%。

2.4 紫外誘變篩選菌株

菌株D-5經(jīng)傳代穩(wěn)定培養(yǎng)后經(jīng)過預(yù)處理后分別在紫外線下照射不同的時間，致死率曲線如圖7所示。

圖7 紫外照射的致死率曲線Fig.7 Lethality curve of cell treated by UV

從圖7可看出，隨著照射時間的延長，致死率升高；當(dāng)照射時間為150 s時，死亡率高達(dá)97.3%，致死率太高不利于菌株的篩選，因此選擇照射時間120 s進(jìn)行紫外誘變。

將紫外誘變后的菌株涂布于抗性平板上，挑選出了28株長勢良好的菌株進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)過反復(fù)的初篩和復(fù)篩，最終篩選出1株富硒量和生物量都較高的菌株U-16，其生物量為5.86g/L，總硒量為1575.40μg/g，有機(jī)硒量為1 500.90 μg/g，有機(jī)硒比重為95.26%。與紫外誘變前的出發(fā)菌株D-5相比，有機(jī)硒量提高了30.2%，比出發(fā)菌株的生物量提高了67.90%，有機(jī)硒量增加了95.95%。

2.5 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性研究

將突變株U-16在斜面固體培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，測每一代的生物量和含硒量如表2所示。

表2 菌株U-16的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of strain U-16

由表2可知，突變株U-16的生物量、有機(jī)硒量、總硒量都沒有明顯的下降，說明此突變株遺傳穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究通過比較產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ、Ⅱ和熱帶假絲酵母、魯氏酵母、球擬酵母5株酵母菌的耐硒和富硒能力，篩選出了產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ和Ⅱ作為出發(fā)菌株，通過耐酸馴化和耐硒馴化提高菌株的抗性，同時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)朊假絲酵母Ⅰ生物量和產(chǎn)硒量更高。

在確定好育種出發(fā)菌株后，進(jìn)行化學(xué)-紫外復(fù)合誘變，得到的U-16菌株，其生物量提高到了5.86 g/L，總硒量為1 575.40 μg/g，有機(jī)硒量為1 500.90 μg/g，有機(jī)硒比重為95.26%。比出發(fā)菌株的生物量提高了67.90%，有機(jī)硒量增加了95.95%，且傳代培養(yǎng)后菌株穩(wěn)定性較好?？蔀楦晃湍傅墓I(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種，后期經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)條件等生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，可進(jìn)一步提高其生物量和富硒能力，以降低生產(chǎn)成本。作為一種優(yōu)質(zhì)有機(jī)硒源，在食品、飼料生產(chǎn)中將得到更廣泛的應(yīng)用。

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Q93-331

0254-5071（2017）05-0085-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.018

2017-01-22

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃（2013BAD10B02-06）；山東省科技計劃項目（2014GSF121029）

鄒艷（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：管斌（1957-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。