崔云華 沈文賓 吳煥淦 周次利 雷 菲 黃立師 趙 琛 李 璟

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海,200030; 2 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,201203; 3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海,200437)

實驗研究

艾灸對亞急性衰老大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)的影響

崔云華1沈文賓1吳煥淦1周次利1雷 菲1黃立師1趙 琛2李 璟3

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海,200030; 2 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,201203; 3 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海,200437)

目的:通過觀察IL-2及相關(guān)受體蛋白水平的變化情況,探討艾灸對亞急性衰老大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞的影響。方法:采用D-半乳糖致亞急性衰老大鼠模型。24只清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)分為:正常組,模型組和艾灸組。艾灸組溫和灸雙側(cè)腎俞穴5 min/次,共計40 d。采用免疫磁珠法分離胸腺CD4+T細(xì)胞,并再用Western Blot方法檢測各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB的蛋白表達(dá)量。結(jié)果:模型組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB蛋白的表達(dá)量較正常組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);艾灸組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB蛋白表達(dá)量升高,與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:艾灸腎俞穴可上調(diào)胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB、I-κB的表達(dá)。

亞急性衰老；IL-2；IL-2Rα；NF-κB；I-κB；艾灸

衰老是自然界中廣泛發(fā)生的一種自然規(guī)律,是生命體伴隨年齡增長整個機(jī)體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能逐步衰退的總現(xiàn)象[1]。隨著社會的發(fā)展,生活水平得以提高,醫(yī)療條件大有改善,人類的平均壽命不斷延長,老年人口所占的比例也隨之?dāng)U大。目前,我國已經(jīng)步入了老齡化社會[2],據(jù)國家統(tǒng)計局于2016年2月29日發(fā)布的《2015年國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展統(tǒng)計公報》數(shù)據(jù)顯示截至2015年底,中國60歲及以上人口數(shù)為22 200萬人,占全國總?cè)丝诘?6.1%;65周歲及以上人口數(shù)為14 386萬人,占比10.5%。衰老及衰老相關(guān)的疾病成為了全世界范圍內(nèi)越來越重視的問題,因此研究衰老機(jī)制,探討有效延緩衰老的方法成為了國內(nèi)外研究的熱點。

Walford于1969年提出免疫系統(tǒng)功能衰退是導(dǎo)致衰老的重要因素,免疫系統(tǒng)在機(jī)體的衰老中起著根本性的作用[3]。免疫系統(tǒng)功能衰退包括胸腺增齡性退化,T細(xì)胞表型和功能改變及細(xì)胞因子分泌改變等。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本,與人體的生長、發(fā)育、衰老密切相關(guān),《素問·上古天真論》認(rèn)為人體整個生命過程其實是腎氣逐漸充盛、衰減、枯竭的過程。腎氣有余,則能體健長壽,腎氣不足,則發(fā)生衰老,從而確立了“腎”在中醫(yī)衰老學(xué)說中的地位。正如《醫(yī)學(xué)正傳·命門主壽夭》中所說:“人之壽夭不齊,何輿？……是故腎元盛則壽延,腎元衰則壽夭”。因此,通過補腎達(dá)到延年益壽的目的成為了歷代醫(yī)家的首要選擇。

艾灸療法是中醫(yī)學(xué)中固本培元,保健延年的重要方法之一。艾灸療法在古人預(yù)防保健的方法中占有非常重要的地位,例如在《扁鵲心書·住世之法》中就有“保命之法,灼艾第一,丹藥第二,附子第三”之說,《醫(yī)學(xué)入門》則認(rèn)為“凡一年四季各要熏一次,元氣堅固,百病不生”。有研究表明艾灸腎俞穴可以提高免疫系統(tǒng)功能[4],起到延年益壽的作用。

CD4+T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中一類重要的免疫細(xì)胞,根據(jù)表面標(biāo)志的不同可分為不同亞群,各個亞群均能分泌多種細(xì)胞因子,參與細(xì)胞免疫。正常情況下,各個亞群之間分化狀態(tài)保持動態(tài)平衡。研究表明白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)是調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化平衡狀態(tài)的關(guān)鍵因子之一[5]。T細(xì)胞只有在活化后才能合成并分泌IL-2,分泌的IL-2能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞介素2受體(Interleukin-2 receptor,IL-2R)α鏈的表達(dá),而IL-2/IL-2R信號環(huán)路可以進(jìn)一步活化T細(xì)胞,促進(jìn)T細(xì)胞的增殖,進(jìn)而增加IL-2表達(dá)?？梢奍L-2的表達(dá)調(diào)控可決定T細(xì)胞活化程度,影響CD4+T細(xì)胞分化,進(jìn)而影響機(jī)體免疫功能。

核因子-κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)是一種能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的核因子,在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在,參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)NF-κB被激活后,發(fā)生核易位,與IL-2基因的啟動子區(qū)結(jié)合,IL-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)得以啟動。有研究顯示,糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)可引發(fā)CD4+T細(xì)胞亞群極化分布,CD4+T細(xì)胞亞群極化分布又反饋性引起下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)功能的異常[6]。其機(jī)制可能是糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合后,通過蛋白-蛋白相互作用直接結(jié)合NF-κB,或通過調(diào)節(jié)NF-κB抑制蛋白κB(Inhibitor Protein κB,I-κB)表達(dá),NF-κB入核受阻[7],活性抑制,下調(diào)IL-2基因表達(dá)。

本實驗擬通過觀察IL-2及其受體蛋白水平的變化情況,研究艾灸對亞急性衰老大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 24只清潔級雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(合格證編號:2008001635133),體質(zhì)量(200±20)g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心(動物使用許可證號:SYXK(滬)2009-0069)提供。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜節(jié)律交替,室溫保持在18～22 ℃,相對濕度55%～65%。24只大鼠分裝于6只等大(50 cm×35 cm×20 cm)動物籠中,每周消毒籠具及房間1次。給予自由進(jìn)食,進(jìn)水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗,本研究的動物實驗倫理審查由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)及監(jiān)督。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基,Hyclone;Running buffer,Miltenyi Biotec,德國;LS柱,Miltenyi Biotec,德國;CD4 MicroBeads,Miltenyi Biotec,德國;淋巴細(xì)胞分離液,北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;IL-2Rα Antibody,Abcam,英國;IL-2 Antibody,Santa Cruz,美國;Phospho-NF-κB p65 Antibody,Cell Signaling Technology;Phospho-IκBα Antibody,Cell Signaling Technology。QuadroMACS磁珠分選器,Miltenyi Biotec,德國;通用臺式高速冷凍離心機(jī),ST16R,Thermo Fisher,美國;通用臺式離心機(jī),ST16,Thermo Fisher,美國;漩渦振蕩器,Scientic Industries,美國。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,無不良反應(yīng),飲食飲水正常者,即納入實驗。采用SPSS 18.0 for Windows軟件生成隨機(jī)數(shù)字表,完全隨機(jī)分成3個組:正常組,模型組和艾灸組,每組8只。本研究采用D-半乳糖致亞急性衰老模型,按125 mg/(kg·次)的劑量每天在大鼠頸背部皮下注射,正常組大鼠注射等量生理鹽水,連續(xù)注射40 d。

1.2.2 干預(yù)方法 采用特制艾條(直徑0.3 cm,長20 cm),點燃艾條一端,燃端距離穴位的垂直高度約3～5 cm(根據(jù)大鼠是否掙扎調(diào)整高度),1次/d,雙側(cè)腎俞穴同時艾灸,灸5 min/次,連續(xù)治療40 d。艾灸組進(jìn)行艾灸治療,正常組和模型組只做相同的抓取固定動作,不做艾灸。

1.2.3 標(biāo)本采集與處理 實驗結(jié)束后取胸腺,去除結(jié)締組織,制備胸腺單細(xì)胞懸液,免疫磁珠法分離純化CD4+T細(xì)胞,待測。

1.2.4 檢測指標(biāo)與方法 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2蛋白表達(dá)量 與正常組比較,模型組大鼠IL-2蛋白的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而艾灸組大鼠IL-2蛋白的表達(dá)量較模型組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2蛋白表達(dá)量

表1 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2蛋白表達(dá)量的比較

注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,△P<0.01。

2.2 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2Rα蛋白表達(dá)量 與正常組比較,模型組大鼠IL-2Rα蛋白的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而艾灸組大鼠IL-2Rα蛋白的表達(dá)量較模型組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量 與正常組比較,模型組大鼠NF-κB蛋白的表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而艾灸組大鼠NF-κB蛋白的表達(dá)量較模型組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2蛋白表達(dá)量

注：與正常組比較，#P<0.01;與模型組比較，▲P<0.01。

圖3 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2Rα蛋白表達(dá)量

表2 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2Rα蛋白表達(dá)量的比較

注:與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05。

圖4 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中IL-2Rα蛋白表達(dá)量

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,▲P<0.05。

圖5 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量

表3 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量的比較

注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,△P<0.05。

圖6 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)量

注：與正常組比較,#P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05。

圖7 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中I-κB蛋白表達(dá)量

表4 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中I-κB蛋白表達(dá)量的比較

注:與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較,△P<0.05。

圖8 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中I-κB蛋白表達(dá)量

注：與正常組比較，#P<0.01;與模型組比較，▲P<0.05。

2.4 各組大鼠胸腺CD4+T細(xì)胞中I-κB蛋白表達(dá)量 與正常組比較,模型組大鼠I-κB蛋白的表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而艾灸組大鼠I-κB蛋白的表達(dá)量較模型組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

3.1 D-半乳糖致衰老模型 D-半乳糖致衰老動物模型制備方法是短時間內(nèi)將大劑量的D-半乳糖連續(xù)注射到動物體內(nèi),加速動物衰老,最終形成與自然衰老相似的動物模型,通過此種方法制備的衰老動物模型是目前使用最為廣泛的[8]。D-半乳糖是體內(nèi)的一種正常代謝產(chǎn)物,正常情況下可以轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟菂⑴c體內(nèi)糖代謝的過程,但在過量的情況下能夠引起機(jī)體代謝紊亂[9]。D-半乳糖致衰老動物模型正是利用了這一點,具體機(jī)制可能是動物體內(nèi)的D-半乳糖短期內(nèi)大量快速累積,在醛糖還原酶的催化作用下,D-半乳糖大量轉(zhuǎn)變成半乳糖醇,但此種物質(zhì)不能被細(xì)胞繼續(xù)代謝,故而堆積在細(xì)胞內(nèi),影響細(xì)胞的正常滲透壓,導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)腫脹并喪失原有的功能,最終使機(jī)體出現(xiàn)衰老[10]。這種方法能夠引起與自然衰老相似的生化改變、免疫功能低下、基因表達(dá)與調(diào)控異常、細(xì)胞生長繁殖能力下降、細(xì)胞退行性變及認(rèn)知障礙等表現(xiàn)[11]。劉克明[12]等比較了D-半乳糖致衰老模型鼠和自然衰老鼠的多種衰老指標(biāo)的不同,發(fā)現(xiàn)自然衰老小鼠和D-半乳糖模型小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)低于正常對照組,D-半乳糖模型小鼠體液免疫功能較正常對照組有所降低,自然衰老組和D-半乳糖模型組SOD活性均低于對照組(P<0.01)。自然衰老組和D-半乳糖模型組MDA含量均高于其對照組(P<0.05)。張常娥[13]等發(fā)現(xiàn)D-半乳糖致衰老模型大鼠的一般情況同自然衰老大鼠癥狀相似,提示半乳糖組大鼠出現(xiàn)明顯的衰老體征,D-半乳糖組雄性大鼠體重比青年對照組的體重顯著性減輕(P<0.05),D-半乳糖組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力比青年對照組顯著降低(P<0.05),且與老年組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。D-半乳糖注射組大鼠的胸腺指數(shù)較青年對照組有非常顯著的降低(P<0.05),而脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高希言[14]等證實D-半乳糖致衰老模型小鼠的CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+的比值較空白組均降低,CD8+T細(xì)胞的比例上升,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示D-半乳糖致衰老模型小鼠的T細(xì)胞亞群比例失調(diào)。

本課題所采用的衰老動物模型即是在大鼠頸背部皮下連續(xù)注射D-半乳糖所造成的亞急性衰老模型,實驗結(jié)果表明模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力較正常組大鼠顯著降低,模型組大鼠的一般情況不如正常組,且體重增長速度較慢,脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)較正常組也有所降低,提示本次實驗所造成的亞急性衰老大鼠模型是成功的。

3.2 艾灸改善免疫功能延緩衰老 艾灸療法具有簡便易行、經(jīng)濟(jì)實用、無不良反應(yīng)、不易產(chǎn)生耐受性等優(yōu)點,應(yīng)用于延緩衰老具有其獨特的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn),艾灸延緩衰老是通過艾灸的溫?zé)嶙饔?、藥物作用與腧穴的特殊作用相結(jié)合而產(chǎn)生一種“綜合效應(yīng)”起作用的[15]。

免疫系統(tǒng)的功能會隨著年齡的增長逐漸衰退,從而使老年人比年輕人更容易遭受疾病的侵襲,尤其是一些免疫缺陷性疾病,例如流感,肺炎,系統(tǒng)性紅斑狼瘡,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,惡性腫瘤,老年癡呆和帕金森病等[16-19]。免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)和衰老的關(guān)系密切,故而改善免疫系統(tǒng)功能可以有效的延緩衰老。高希言等對不同強(qiáng)壯要穴施灸,可以使衰老小鼠的免疫器官萎縮退化速度顯著降低,失衡的T淋巴細(xì)胞亞群分布恢復(fù)正常,同時可以調(diào)節(jié)sIL-2R的含量,達(dá)到改善免疫系統(tǒng)功能的目的,從而延緩衰老[20-21]。IL-2是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子,不僅能誘導(dǎo)T細(xì)胞活化,還能刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,對免疫系統(tǒng)功能影響巨大。而IL-6的主要作用是加速胸腺萎縮,誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生,增強(qiáng)炎性反應(yīng),造成骨質(zhì)疏松等,是導(dǎo)致機(jī)體衰老的重要因子。艾灸能使衰老大鼠血清IL-2水平顯著升高的同時降低血清IL-6的水平,使衰老引起的免疫功能衰退得以改善[22]。趙粹英[23]等采用隔藥餅灸治療了223例老年人,與治療前比較,治療后細(xì)胞免疫功能明顯增強(qiáng),T淋巴細(xì)胞的總數(shù)有所增加,CD4+/CD8+的比值上升至正常?？梢?艾灸能明顯改善免疫系統(tǒng)功能延緩衰老。

3.3 艾灸調(diào)節(jié)衰老機(jī)體IL-2及其受體延緩衰老的機(jī)制探討

隨著年齡的增長,機(jī)體的免疫功能逐漸衰退,表現(xiàn)為免疫器官萎縮退化,免疫細(xì)胞數(shù)量減少及功能受損和細(xì)胞因子分泌紊亂等。IL-2主要是由T細(xì)胞(特別是CD4+T細(xì)胞)在受到抗原或絲裂原刺激后合成分泌的,是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中起著非常重要的作用。多項研究證實,IL-2及其受體的表達(dá)能力隨著機(jī)體衰老逐漸下降[24-25]。用艾灸進(jìn)行保健強(qiáng)身,延年益壽的方法古已有之,現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn),艾灸可以顯著升高伴隨衰老而降低的IL-2及其受體的表達(dá)能力。

3.3.1 IL-2和IL-2R系統(tǒng) IL-2是一種具有多向性作用的細(xì)胞因子,不僅可刺激輔助性T細(xì)胞增殖,還能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Lymphocyte,CTL)增殖,對機(jī)體的免疫應(yīng)答和抗病毒感染等有重要作用。此外,IL-2還參與了抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視。IL-2的靶細(xì)胞包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞及單核-巨噬細(xì)胞等,這些細(xì)胞表面均可表達(dá)IL-2R,IL-2通過作用于細(xì)胞膜上的IL-2R來發(fā)揮其生物活性。IL-2R包含3條多肽鏈:1條為α鏈,分子量55KD;1條為β鏈,分子量75KD;另1條為γ鏈,分子量64KD[26]。3種肽鏈單獨與IL-2結(jié)合親和力較低,只有同時表達(dá)才能產(chǎn)生高度親和力,只表達(dá)α鏈的細(xì)胞以低親和力與IL-2結(jié)合,且無法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),當(dāng)α鏈與β鏈和γ鏈共同構(gòu)成三聚體型IL-2R時,可以將IL-2R與IL-2結(jié)合的親和力提高10～100倍,β和γ都屬于I型細(xì)胞因子受體超家族,γ亞基不單獨與IL-2結(jié)合,但與β亞基結(jié)合可構(gòu)成低親和力二聚體型IL-2R,共同成為IL-2R信號的組成部分[27-28]。β和γ亞基在它們胞質(zhì)內(nèi)的尾部都攜帶信號序列,其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通過多種細(xì)胞內(nèi)通路,如酪氨酸蛋白激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子激活通路(JAK/STAT)、磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B通路(PI3K/Akt)及絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPKs)[29],γ鏈不僅對IL-2有應(yīng)答,對IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21也有應(yīng)答[30],因此IL-2及其受體信號系統(tǒng)介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng),隨細(xì)胞表面表達(dá)IL-2受體構(gòu)型和數(shù)量的不同產(chǎn)生明顯差異,并與周圍環(huán)境IL-2的濃度、持續(xù)作用的時間、有無其他相關(guān)細(xì)胞因子的參與等多種因素密切相關(guān)[31-32]。

IL-2通過與IL-2R的結(jié)合產(chǎn)生多種生物學(xué)功能:1)刺激T細(xì)胞增殖:各種刺激物活化的T細(xì)胞一般不能在體外培養(yǎng)中長期存活,加入IL-2則能其長期持續(xù)增殖。靜止的T細(xì)胞表面不表達(dá)IL-2R,對IL-2沒有反應(yīng);受絲裂原或其他刺激活化后T細(xì)胞才能表達(dá)IL-2R,成為IL-2的靶細(xì)胞;而IL-2又可誘導(dǎo)靶細(xì)胞增加IL-2R的表達(dá)。在活體內(nèi),IL-2對CD4+T細(xì)胞的作用是通過自分泌途徑實現(xiàn)的,因為活化的CD4+T細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的IL-2;而CD8+T細(xì)胞則通過旁分泌途徑來維持細(xì)胞的生長。2)誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用:a.接受了預(yù)刺激信號的CD8+T細(xì)胞可以受IL-2的作用活化為CTL,發(fā)揮細(xì)胞毒作用;在一定條件下,CD4+T細(xì)胞也可被IL-2誘導(dǎo)為具有殺傷作用的細(xì)胞。b.NK細(xì)胞是唯一正常情況下表達(dá)IL-2R的淋巴樣細(xì)胞,因此始終對IL-2保持反應(yīng)性。然而靜止的NK細(xì)胞上只表達(dá)IL-2R的β鏈和γ鏈,對IL-2的親和力低,只能對高濃度的IL-2發(fā)生反應(yīng)。一旦NK細(xì)胞活化,就表達(dá)IL-2R的α鏈,成為高親和力的受體;因此,大劑量的IL-2誘導(dǎo)的淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(Lymphokine Activated Killer Cells,LAK)主要為NK細(xì)胞。c.使T細(xì)胞作NK細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子β(Tumor Necrosis Factor-β,TNF-β)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等因子,促進(jìn)非特異性細(xì)胞毒素的合成和分泌;還可誘導(dǎo)產(chǎn)生某些B細(xì)胞生長因子以及造血生長因子等,從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。3)對B細(xì)胞的作用:IL-2對B細(xì)胞的生長及分化均有一定的促進(jìn)作用?；罨幕驉鹤兊腂細(xì)胞表面表達(dá)高親和力的IL-2R,但密度較低;較高濃度的IL-2可誘導(dǎo)B細(xì)胞生長繁殖,促進(jìn)抗體分泌,并誘使B細(xì)胞由分泌IgM向著分泌IgG2轉(zhuǎn)換。

3.3.2 衰老對機(jī)體IL-2及其受體的影響 IL-2和IL-2R在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用,其與衰老之間的關(guān)系已有大量的研究報道。王敏[33]等采用放射免疫法測定了D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-2含量,流式細(xì)胞術(shù)測定了脾淋巴細(xì)胞膜IL-2R的表達(dá),結(jié)果表明與正常對照組比較,模型對照組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-2表達(dá)和脾淋巴細(xì)胞膜IL-2R陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而另一項研究則證實亞急性衰老模型大鼠血清IL-2含量明顯低于青年對照組(P<0.01)。謝紅林等的研究也得出了同樣的結(jié)論。在自然衰老動物模型中也出現(xiàn)了類似的表現(xiàn),吳志奎[34]等比較了自然衰老小鼠和D-半乳糖致衰老小鼠2種模型,發(fā)現(xiàn)2種模型小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力和產(chǎn)生IL-2的能力下降,同時IL-2R表達(dá)能力亦出現(xiàn)下降。

臨床實驗也有同樣的報道,趙粹英[35]等報道了223例老年人外周血IL-2的活性較青年組明顯下降,淋巴細(xì)胞表面IL-2R百分率增加。另一項研究[36]選取了18名健康老年人和12名青年人,抽取外周血后經(jīng)PHA刺激,采用MTT法測定IL-2活性和流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-2R,結(jié)果表明老年組的IL-2活性比青年組下降了48.0%,IL-2R陽性細(xì)胞數(shù)也下降了28.6%。王舒[37]等分析了17名健康老年人和7名健康青年人的外周血淋巴細(xì)胞增殖能力和IL-2Rγ鏈的表達(dá),結(jié)果顯示青年組的淋巴細(xì)胞增殖能力平均為(0.279±0.054),老年組平均為(0.199±0.055),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);老年組IL-2Rγ鏈陽性的細(xì)胞百分比明顯低于青年組(P<0.001);且老年人淋巴細(xì)胞活化后IL-2Rγ鏈mRNA的表達(dá)低于青年人。

3.3.3 艾灸對衰老機(jī)體IL-2及其受體的調(diào)節(jié)機(jī)制 艾灸能夠?qū)λダ蠙C(jī)體受影響的IL-2及IL-2R信號系統(tǒng)起到改善作用。唐志勇等比較了溫和灸足三里、腎俞穴一段時間后中老年人和青年人外周血中IL-2的含量,在針灸前老年組IL-2含量明顯低于青年組,針灸后老年組的IL-2含量明顯上調(diào)。另一項以隔藥餅灸為治療手段的研究也證實艾灸可以顯著提高老年人外周血中IL-2活性[38]。大量的動物實驗研究也證實了艾灸的這一作用,趙偉康[39]等對自然衰老大鼠關(guān)元穴進(jìn)行艾灸治療,治療結(jié)束后測定脾臟IL-2活性,結(jié)果表明艾灸可明顯提高老年大鼠脾臟IL-2活性。李麗紅等的研究采用的是D-半乳糖致衰老大鼠模型,選取“足三里”“腎俞”和“關(guān)元”溫和灸20次,治療后測定大鼠血清IL-2含量,結(jié)果顯示艾灸組大鼠血清IL-2含量明顯高于模型組。另一項研究[40]則選取小鼠在頸背部皮下注射D-半乳糖造成亞急性衰老模型,并對關(guān)元、足三里穴進(jìn)行艾灸,隔日1次,共進(jìn)行六周,治療結(jié)束后比較各組大鼠血清IL-2含量,與模型組比較,艾灸組血清IL-2含量明顯升高(P<0.05)。詹睿[41]的研究則發(fā)現(xiàn)逆灸關(guān)元穴可顯著升高更年期大鼠血清和子宮IL-2的含量,且脾臟和子宮IL-2RmRNA的表達(dá)也呈增高趨勢。

衰老機(jī)體IL-2含量降低的原因之一是消耗過多,血清中的可溶性IL-2受體(sIL-2R)能與IL-2結(jié)合加速廓清IL-2,使激活的T細(xì)胞復(fù)原為靜息狀態(tài),從而使IL-2R的表達(dá)也出現(xiàn)下降,有研究發(fā)現(xiàn)亞急性衰老小鼠模型的sIL-2R含量較對照組明顯升高;另一個原因是產(chǎn)生減少,抑制IL-2產(chǎn)生的其中一個因素是糖皮質(zhì)激素(大鼠為皮質(zhì)酮),研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠的血清皮質(zhì)酮含量較青年對照組明顯升高[42],高濃度的糖皮質(zhì)激素與靶器官糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合形成GC-R復(fù)合物,該復(fù)合物可通過蛋白-蛋白相互作用直接與NF-κB等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合,影響I-κB的磷酸化和降解,使NF-κB的磷酸化過程受到抑制,從而阻礙其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移[43],抑制轉(zhuǎn)錄活性,下調(diào)IL-2基因的表達(dá)。

本課題組前期研究結(jié)果表明,與正常組大鼠比較,D-半乳糖所致的亞急性衰老模型大鼠血清皮質(zhì)酮含量升高,胸腺糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)降低[44]。本次研究進(jìn)一步表明胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)量均下降;而艾灸組大鼠血清皮質(zhì)酮含量較模型組降低,胸腺糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)及胸腺CD4+T細(xì)胞IL-2、IL-2Rα、NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)量較模型組明顯升高,說明艾灸可能是通過降低血清中的皮質(zhì)酮含量,減少胸腺淋巴細(xì)胞中GC-R復(fù)合物的形成,降低其與NF-κB的結(jié)合幾率,促進(jìn)NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移,提高轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)IL-2基因的表達(dá),使淋巴細(xì)胞激活,IL-2R的表達(dá)增多。

[1]鄭集.衰老與抗衰老[M].北京:科學(xué)出版社,1999:1.

[2]中國老年學(xué)學(xué)會衰老與抗衰老科學(xué)委員會.中國衰老與抗衰老專家共識(2013年)[J].中國老年學(xué)雜志,2013,33(22):5505-5506.

[3]Walford RL.The immunologic theory of aging[M].Copenhagen:Munksgaard Press,1969.

[4]楊杰,張玲莉,陳炳霖,等.艾灸腎俞穴對男子散打運動員血清睪酮和免疫球蛋白的影響[J].上海體育學(xué)院學(xué)報,2014,38(5):61-64,78.

[5]Tavel JA,Babiker A,Fox L,et al.Effects of intermittent IL-2 alone or with peri-cycle antiretroviral therapy in early HIV infection:the STALWART study[J].PLoS One,2010,5(2):e9334.

[6]van den Akker EL,Russcher H,van Rossum EF,et al.Glucocorticoid receptor polymorphism affects transrepression but not transactivation[J].J Clin Endocrinol Metab,2006,91(7):2800-2803.

[7]Huang MC,Liao JJ,Bonasera S,et al.Nuclear factor-B-dependent reversal of aging-induced alterations in T cell cytokines[J].J FASEB,2008,22:2142-2150.

[8]王少康,孫桂菊,張建新,等.亞急性衰老動物模型的建立及評價[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2002,21(3):217-220.

[9]Ho SC,Liu JH,Wu RY.Establishment of the mimetic aging effect in mice caused by D-galactose[J].Biogerontology,2003,4(1):15-18.

[10]張熙,李方彬,張炳烈.D-半乳糖亞急性中毒大鼠擬衰老生化改變[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1990,21(4):309-310.

[11]Cui X,Zuo P,Zhang Q,et al.Chronic systemic D-galactose exposure induces memory loss,neurodegeneration,and oxidative damage in mice:protective effects of R-alpha-lipoic acid[J].J Neurosci Res,2006,84(3):647-654.

[12]劉克明,王春花,李國星,等.D-半乳糖模型鼠與自然衰老鼠的比較研究[J].衛(wèi)生研究,2007,36(6):685-688.

[13]張常娥,魏偉,劉英華,等.D-半乳糖亞急性衰老大鼠模型的建立及評價[J].中國老年學(xué)雜志,2012,32(4):742-745.

[14]高希言,王燕.艾灸督脈穴對D-半乳糖致亞急性衰老小鼠免疫功能的影響[J].中國針灸,2004,24(7):488-490.

[15]吳煥淦,劉立公,陳躍來,等.灸法的繼承與創(chuàng)新[J].上海針灸雜志,2007,26(12):39-41.

[16]Solana R,Tarazona R,Gayoso I,et al.Innate immuno-senescence:effect of aging on cells and receptors of the innate immune systeminhumans[J].Semin Immunol,2012,24:331-341.

[17]Hajishengallis G.Too old to fight?Aging and its toll on innate immunity[J].Mol Oral Microbiol,2010,25(1):25-37.

[18]Weiskopf D,Weinberger B,Grubeck-Loebenstein B,et al.The aging of the immune system[J].Transplant Int,2009,22(11):1041-1050.

[19]Weksler ME,Pawelec G,Franceschi C.Immune therapy for age-related diseases[J].Trends Immunol,2009,30(7):344-350.

[20]高希言,王燕.艾灸督脈穴對D-半乳糖致亞急性衰老小鼠免疫功能的影響[J].中國針灸,2004,24(7):488-490.

[21]高希言,王燕.艾灸強(qiáng)壯要穴對衰老小鼠免疫功能的影響[J].河南中醫(yī),2005,25(11):24-26.

[22]李麗紅,李麗,趙志恩,等.艾灸、中藥對衰老模型大鼠線粒體DNA、血清IL-2、IL-6含量的影響[J].中國針灸,2008,28(9):681-684.

[23]ZHAO CY,YANG L,CHEN HP,et al.Clinical study on anti-aging action of herbal cake-partition moxibustion[J].Journal of Acupuncture and Tuina Science,2009,7(1):37-40.

[24]Nagelkerken L,Hertogh-Huijbregts A,Dobber R,et al.Age-related changes in lymphokine production related to a decreased number of CD45RBhi CD4+T cells[J].Eur J Immunol,1991,21(2):273-281.

[25]于淼,姚辛敏,王春雷,等.補腎丹對D-gal致衰老模型大鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-6的影響[J].中醫(yī)學(xué)報,2010,25(2):251-252.

[26]王敏,王平,韓永明,等.固本延衰方對亞急性衰老模型小鼠IL-2及其受體表達(dá)的影響[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2005,28(4):40-42.

[27]Taniguchi T,Minami Y.The IL-2/IL-2 receptor system:a current overview[J].Cell,1993,73(1):5-8.

[28]Wang X,Rickert M,Garcia KC.Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha,beta,and gammac receptors[J].Science,2005,310(5751):1159-1163.

[29]Lin JX,Leonard WJ.Signaling from the IL-2 receptor to the nucleus[J].Cytokine Growth Factor Rev,1997,8(4):313-332.

[30]Boyman O,Sprent J.The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system[J].Nat Rev Immunol,2012,12(3):180-190.

[31]Boyman O,Kovar M,Rubinstein MP,et al.Selective stimulation of T cell subsets with antibody-cytokine immune complexes[J].Science,2006,311(5769):1924-1927.

[32]Fehniger TA,Bluman EM,Porter MM,et al.Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy[J].J Clin Invest,2000,106(1):117-124.

[33]王敏,王平,洪小平,等.從IL-2及其受體表達(dá)探討黨參在延緩衰老中的作用[J].中華中醫(yī)藥雜志,2006,21(10):629-630.

[34]吳志奎,陳智松,陳玉英,等.從補腎生血藥對衰老小鼠IL-2、IL-2R的效應(yīng)探討腎生髓與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系[J].深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志,2001,11(4):200-203.

[35]趙粹英,陳漢平,居賢水,等.隔藥餅灸延緩衰老的臨床和免疫學(xué)機(jī)制研究[J].中國針灸,1998,18(1):5-8.

[36]王蓉蓉,劉素賓.補腎化瘀復(fù)方對老年人淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素-2分泌及白細(xì)胞介素-2受體表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2002,22(1):25-27.

[37]王舒,李玉梅,蔣桂蘭,等.老年人淋巴細(xì)胞IL-2Rγ鏈的表達(dá)及其意義[J].中國免疫學(xué)雜志,2001,17(2):99-102,104.

[38]肖達(dá),陳漢平,趙粹英,等.艾灸對老年人IL-2及其受體的影響[J].上海免疫學(xué)雜志,1997,17(3):184-185.

[39]趙偉康,張洪度,金國琴,等.艾灸關(guān)元穴對老年大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸和IL-2的影響[J].上海針灸雜志,1996,15(3):28-30.

[40]謝甦,李麗紅.艾灸關(guān)元、足三里對衰老小鼠免疫功能影響的實驗研究[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,25(2):44-46.

[41]詹睿.逆針逆灸關(guān)元穴對更年期大鼠IL-2RmRNA表達(dá)及相關(guān)因子影響的實驗研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2006.

[42]康湘萍,金國琴,董獻(xiàn)文,等.補腎方藥對老年大鼠血清皮質(zhì)酮含量、LTP及空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2011,31(24):4815-4818.

[43]Huang MC,Liao JJ,Bonasera S,et al.Nuclear factor-kappaB-dependent reversal of aging-induced alterations in T cell cytokines[J].FASEB J,2008,22(7):2142-2150.

[44]Lei Fei,Shen Wen-bin,Cui Yun-hua,et al.Effect of moxibustion at Shenshu (BL 23) on the ethology,corticosterone and glucocorticoid receptor in aging rats[J].J Acupunct Tuina Sci,2016,14(4):250-256.

(2017-04-19收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effects of Moxibustion on the Expression of IL-2, IL-2Rα, NF-κB and I-κB in Thymus CD4+T Cells of Subacute Aging Rats

Cui Yunhua1, Shen Wenbin1, Wu Huangan1, Zhou Cili1, Lei Fei1, Huang Lishi1, Zhao Chen2, Li Jing3

(1ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMeridan,ShanghaiUniversityOfTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China; 2ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 3DepartmentofAcupuncture,YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China)

Objective:To observe the effect of moxibustion on CD4+T cells of thymus in subacute aging rats by recording the changes of IL-2 and related receptor protein levels. Methods:Use D-galactose induced subacute aging rat model. Twenty-four male SD rats were randomly divided into normal group, model group and moxibustion group. In moxibustion group, use mild moxibustion on Shenshu Point(BL23) bilateral for 40 days, 5 minutes each day each time. To separate CD4+T cells by MACS method, and access the expression of IL-2, IL-2Rα, NF-κB and I-κB in CD4+T cell by Western Blot. Results:Western Blot assay shows that comparing to the control group, the expression of IL-2, IL-2Rα, NF-κB and I-κB in CD4+T cell of model group significantly decreased (P<0.05). However, in the moxibustion group, those increased with significant difference (P<0.05). Conclusion:In subacute aging rats, moxibustion on BL23 can improve the expression of IL-2, IL-2Rα, NF-κB and I-κB in thymic CD4+T cell.

Subacute aging; IL-2; IL-2Rα; NF-κB; I-κB; Moxibustion

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(“973”計劃)資助項目(編號:2009CB522900;2015CB554501);國家自然科學(xué)基金項目(編號:81303029;81373752)

吳煥淦(1956.11—),男,博士,上海中醫(yī)藥大學(xué)首席教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向:針灸作用的基本原理與應(yīng)用規(guī)律研究,E-mail:wuhuangan@126.com;李璟(1968.03—),女,博士,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師,研究方向:針灸胃腸疾病的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mial:1971921250@qq.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.036