馬薇薇 郭長青 蘆 娟 杜寧宇 梁靖蓉 吳 桐 盧勝春

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京,100029; 2 江西省德興市勝春醫(yī)院,江西,334200)

針刀干預(yù)對帕金森病模型大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞及IL-1β表達(dá)的影響

馬薇薇1郭長青1蘆 娟1杜寧宇1梁靖蓉1吳 桐1盧勝春2

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,北京,100029; 2 江西省德興市勝春醫(yī)院,江西,334200)

目的:探討針刀療法治療帕金森病(Parkinson′s Disease,PD)的炎性作用機(jī)制。方法:將48只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、針刀組、電針組。采用立體定位技術(shù)將6-羥基多巴胺(6-DAOH)注入大鼠右側(cè)紋狀體制備PD大鼠模型。針刀組于枕下肌群和C1-2橫突處進(jìn)行松解干預(yù),2次/周,連續(xù)4周;電針組選“百會”“太陽”穴,由“百會”透刺“太陽”穴進(jìn)行電針干預(yù),3次/周,連續(xù)4周。采用HE染色光鏡下觀察神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目及小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目變化,酶聯(lián)免疫吸附法(ELisa)檢測IL-1β的水平。結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠損毀側(cè)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少,小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多,IL-1β水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,針刀組和電針組大鼠損毀側(cè)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增多,小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少,IL-1β水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:針刀療法可以改善多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目,其機(jī)制可能是通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的炎性反應(yīng),降低炎性因子IL-1β的含量,從而治療PD。

帕金森病;針刀;6-羥基多巴胺(6-DAOH);白介素-1

帕金森病(Parkinson′s Disease,PD)是老年人多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,其特征性病理學(xué)表現(xiàn)是中腦黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元細(xì)胞的變性和丟失。迄今為止,其病因尚未完全明確,神經(jīng)系統(tǒng)老化、遺傳因素、內(nèi)外環(huán)境因素、氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫異常、線粒體功能障礙與細(xì)胞凋亡等假說較為流行[1],其中神經(jīng)炎性反應(yīng)在PD發(fā)病過程中持續(xù)發(fā)揮作用,理由可歸結(jié)如下:非甾體類抗炎藥物可降低PD的患病率[2];炎性反應(yīng)信號通路MAPKs及HLA基因位點(diǎn)與PD患病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性[3-4];應(yīng)用追蹤劑PK11195標(biāo)記活體PD大鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞,并使用PET-CT掃描證實(shí)了小膠質(zhì)細(xì)胞被激活[5];PD患者尸檢顯示存在促炎性遞質(zhì)[6]。故認(rèn)為炎性因子水平的升高是導(dǎo)致PD的重要因素之一。臨床上已有實(shí)踐證明,針刀治療PD具有很好的效果[7],但相關(guān)的實(shí)驗(yàn)性研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用立體定位技術(shù)將6-羥基多巴胺(6-DAOH)注入大鼠右側(cè)紋狀體制備PD大鼠模型,觀察針刀干預(yù)對小膠質(zhì)細(xì)胞及白介素細(xì)胞1(IL-1β)表達(dá)的影響,探討針刀治療PD的炎性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用SPF級的健康雄性SD大鼠共48只,周齡12周,重量為(200±20) g,購買于北京維通利華公司實(shí)驗(yàn)動物中心,該動物許可證號為SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)前1周選購大鼠,并將大鼠隨機(jī)分為模型組、正常組、針刀組、電針組4組,于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自由進(jìn)食飲水。第2周進(jìn)行實(shí)驗(yàn),術(shù)前12 h內(nèi)禁食不禁水。

1.1.2 試劑與儀器 6-羥基多巴胺(6-DAOH)和阿撲嗎啡(APO)(美國Sigma),水合氯醛(天津科密歐化學(xué)試劑中心),多聚甲醛(常德市華生醫(yī)療器械有限公司),HE染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);0.9%氯化鈉溶液(哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司)。漢章系列一次性針刀:規(guī)格0.4 mm×40 mm(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司);中研太和牌針灸針:規(guī)格0.25 mm×25 mm(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司);韓氏電針治療儀;5 mL微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠);腦立體定位儀(美國Stoelting公司),AE-160電子天平(瑞士MET-TLER公司),人IL-1β試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 48只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、針刀組和針灸組。以10%的水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉,用剃毛機(jī)剔除顱頂部鼠毛,將動物頭部固定在立體定位儀上,頭部備皮碘伏消毒后,用手術(shù)刀片在右耳前做長1.5 cm的切口,處理切口面至暴露出前囟,確定前囟坐標(biāo)。按照包新民[8]的《大鼠腦立體定向圖譜》定位注射靶點(diǎn)坐標(biāo)如下:1)第1點(diǎn)為前囟前0.7 mm,頂正中線右3.0 mm,深度為4.5 mm(不包括顱骨的厚度);2)第2點(diǎn)為前囟后0.2 mm,頂正中線右2.6 mm,深度為6.0 mm[3]。打開微型電鉆,采用持筆式持微型電鉆,電鉆保持與大鼠大腦骨面垂直,并按上述坐標(biāo)鉆孔,將15 μg的6-OHDA溶于3 μL的生理鹽水(含0.2%維生素C)中,以5 μL微量注射器向腦內(nèi)2個預(yù)定靶點(diǎn)緩緩注入,注完后留針約10 min。退針時(shí),以1 mm/min的速度緩緩出針,并用手術(shù)彎鑷鑷取適當(dāng)大小的海綿明膠填塞鉆孔,用手術(shù)線縫合。腹腔注射青霉素鈉8萬U后將大鼠放回籠中保溫修養(yǎng)。正常組不作任何處理。術(shù)后4周腹腔注0.01%的APO(0.5 mL/kg),開始觀察并記錄大鼠旋轉(zhuǎn)的啟動時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、啟動后60 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù),記錄大鼠注射后的行為變化,記錄標(biāo)準(zhǔn)為頭尾相接并向健側(cè)恒定旋轉(zhuǎn),若大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為7次/min以上,則視為造模成功。

1.2.2 干預(yù)方法 正常組、模型組正常飼養(yǎng)不予以治療,共4周。針刀組選用漢章系列一次性使用針刀,規(guī)格0.4 mm×40 mm(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司)。治療點(diǎn)及操作步驟:選取枕下肌群和C1-2橫突點(diǎn),用紫藥水在進(jìn)針刀部位做“×”型記號,進(jìn)針刀時(shí)刀口線的方向與脊柱方向平行,刀體與大鼠皮毛面垂直刺入,針刺至枕骨骨面和C1-2橫突處,當(dāng)?shù)犊诮佑|骨面時(shí),按刀口線方向縱行疏剝,迅速出刀并加壓片刻,防止出血,治療2次/周,共治療4周。電針組參照文獻(xiàn)全國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會制定的“實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜”[6],選取“百會”“太陽”位置,用0.25 mm×25 mm毫針針刺,沿皮由百會透刺單側(cè)太陽,刺畢接韓氏電針治療儀,疏密波,頻率100 Hz,強(qiáng)度約2 mA,電針強(qiáng)度以大鼠頭部微顫為宜,使動物不掙扎嘶叫保持安靜為度,治療3次/周,20 min/次,共治療4周。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 病理標(biāo)本制備 取各組大鼠4只,腹腔注射10%的水合氯醛,麻醉后,先用生理鹽水灌注心腔內(nèi),后以提前配制好的多聚甲醛進(jìn)行固定,固定好后立即斷頭取腦,在冰袋上迅速分離出大鼠的紋狀體,并將其置于4%的多聚甲醛溶液中進(jìn)行后固定。常規(guī)脫水,石蠟包埋,連續(xù)冠狀切片,采用HE染色光鏡下觀察黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)。另外取各組8只大鼠麻醉狀態(tài)下處死后快速斷頭取腦,在冰面上迅速分離出右側(cè)紋狀體,用0.32 mmol/L含蛋白酶抑制劑的蔗糖液制作組織勻漿,15 000 r/min離心10 min,采用酶聯(lián)免疫吸附Elisa法檢測上清液白介素細(xì)胞-1(IL-1β)的水平。

1.2.3.2 HE染色檢測步驟 石蠟切片脫蠟至水;用蘇木精液在室溫條件下染色5 min,自來水充分沖洗1 min;鹽酸分化30 s;水稍洗至促藍(lán)液返藍(lán);置于1%的伊紅液染2 min;梯度乙醇常規(guī)脫水,透明,封片。結(jié)果顯示:胞質(zhì)呈粉紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察,正常組的DA神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞及神經(jīng)纖維排列較整齊,核呈現(xiàn)卵圓形或椎形,且細(xì)胞核大,較為清晰,核仁較明顯;模型組:DA神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯減少,部分細(xì)胞固縮且體積較正常組小,神經(jīng)纖維排列散亂,細(xì)胞核形態(tài)大小不一,且偏居一側(cè),核仁不清晰,此外在脫失的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞周圍,分布著大量核小、深染,呈扁圓形或三角形的小膠質(zhì)細(xì)胞;電針組:神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增多,小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少,神經(jīng)纖維排列較整齊;針刀組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增多,小膠質(zhì)細(xì)胞減少,較模型組改善明顯。

圖1 各組大鼠紋狀體多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(HE染色,4×20倍)

表1 白介素細(xì)胞1(IL-1β)含量比較

注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01,▲▲P<0.01。

2.2 白介素細(xì)胞1(IL-1β)含量比較 結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠紋狀體內(nèi)IL-1β水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,針刀組、電針組大鼠紋狀體內(nèi)IL-1β水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說明電針治療和針刀干預(yù)能有效降低大鼠紋狀體內(nèi)IL-1β的含量;針刀組大鼠紋狀體內(nèi)IL-1β的含量略低于電針組,2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。3 討論

通過諸多參考文獻(xiàn)顯示,PD模型的選擇是制備大鼠PD模型的關(guān)鍵,目前常用的方法是利用物理或化學(xué)的方法損毀多巴胺能系統(tǒng)。建立該模型,一種是淺靜脈注入甲基-苯基-四氫毗咤制備模型,通常選擇C57BL/6J的小鼠作為造模對象;另一種采用大腦立體定位儀將6-OHDA注入大鼠中腦紋狀體中制備模型,一般選取大鼠作為造模對象。因小鼠個體小,取腦組織研究相對困難,而且針刀松解剝離范圍較大,損傷程度亦大,針刺時(shí)不容易精準(zhǔn)定位,所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,本實(shí)驗(yàn)選取個體大,容易精準(zhǔn)定位的大鼠進(jìn)行6-OHDA單側(cè)紋狀體進(jìn)行模型制備,采用單側(cè)而非雙側(cè)是根據(jù)王剛等人的研究認(rèn)為單側(cè)損毀的方法成熟、操作相對容易、死亡率較低且模型穩(wěn)定性高[9]。Ungerstedt于1968年首先報(bào)道了采用6-OHDA制作PD動物模型,他提出,動物的旋轉(zhuǎn)模型特點(diǎn)與人類PD發(fā)病的特點(diǎn)相似[10]。研究表明注入6-OHDA后對紋狀體黑質(zhì)的損傷在6個月到10個月內(nèi)無顯著的改變,且不存在紋狀體再生現(xiàn)象,證明本模型穩(wěn)定性較高[11]。

近年來的臨床醫(yī)家治療PD主要是以頭針為主,配合腹針、中藥、拔罐等多種針法綜合治療在改善PD癥狀方面療效較為肯定[12-14]。亦有醫(yī)家運(yùn)用針刀療法治療PD取得良好的效果,如肖德華[15]選取頸背部為治療點(diǎn),治療PD療效顯著。周蕾[16]等人運(yùn)用頭皮電針結(jié)合督脈接力針、針刀綜合治療PD療效佳,安全性好。本實(shí)驗(yàn)以枕下肌群和C1-2橫突點(diǎn)為進(jìn)針刀點(diǎn),是通過松解枕下肌群和觸激頸上交感神經(jīng)節(jié),改善頸部肌肉痙攣引起的腦血循環(huán)和代謝障礙。有學(xué)者從影像學(xué)證實(shí)了寰枕段和橫突段容易受頸軟組織炎性壓迫等因素刺激導(dǎo)致血管痙攣出現(xiàn)眩暈、頭痛、惡心、嘔吐、視覺障礙等缺血癥狀[17]。由于頸上神經(jīng)節(jié)支配頸內(nèi)動脈,而頸內(nèi)動脈的分支大腦中脈是中腦血供的主要動脈,所以大腦中動脈的供血間接受頸上交感神節(jié)經(jīng)影響。肖德華[18]認(rèn)為在PD患者中,黑質(zhì)內(nèi)多巴胺含量的不足與腦供血相關(guān),因合成多巴胺的原料來源于血液,而原料的缺乏是導(dǎo)致黑質(zhì)內(nèi)多巴胺含量不足的主要原因。由此我們推測,通過刺激枕下肌群和C1-2橫突,能改善PD患者寰枕段肌肉軟組織損傷及頸上交感神經(jīng)節(jié)壓迫狀態(tài),直接或間接的影響大腦中動脈供應(yīng)黑質(zhì)的血運(yùn),增加腦內(nèi)多巴胺的合成原料,從而減輕PD的癥狀。

腦內(nèi)IL-1有IL-1α和IL-1β 2種亞型,但以IL-1β為主,可參與免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎性反應(yīng)等。許多外源性刺激或病理狀態(tài)可以使IL-1β的分泌水平明顯升高。Mogi[19]等人經(jīng)活檢發(fā)現(xiàn),PD患者紋狀體尾狀核、殼核處的IL-1β等炎性細(xì)胞因子的濃度高于大腦皮質(zhì)區(qū)。楊海華[20]等認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病過程中細(xì)胞因子水平持續(xù)升高,會對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用,其中對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用的主要有TNF-α、NO、IL-1β、TNF-γ。大量體外研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞表面都有相應(yīng)受體的表達(dá),既可以直接對表達(dá)相應(yīng)受體的神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,也可以通過進(jìn)一步活化小膠質(zhì)細(xì)胞這樣一個間接的途徑,產(chǎn)生一系列神經(jīng)毒性物質(zhì)。由于小膠質(zhì)細(xì)胞是IL-1β的主要來源,IL-1β可上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性,使小膠質(zhì)細(xì)胞分泌更多的前炎性細(xì)胞因子,導(dǎo)致炎性損害進(jìn)一步加重。Griffin[21]等人研究認(rèn)為IL-1β基因的多態(tài)性可以使AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加6倍。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎性因子白介素的釋放在PD的發(fā)病機(jī)制和其慢性病程發(fā)展中起重要作用[22]。所以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎性反應(yīng)是緩解PD進(jìn)程的之一。

在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,與正常組比較,模型組PD大鼠的DA神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯減少,部分細(xì)胞固縮且體積減小,神經(jīng)纖維排列較散亂,細(xì)胞核形態(tài)不一,核仁不清晰,變性的神經(jīng)元細(xì)胞周圍存在大量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,ELisa檢測顯示IL-1β細(xì)胞表達(dá)上調(diào);電針組和針刀組大鼠多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)得到改善,ELisa檢測顯示IL-1β細(xì)胞表達(dá)下降。結(jié)果說明6-OHDA介導(dǎo)的模型大鼠中多巴胺能神經(jīng)元存在著嚴(yán)重?fù)p害,而針刀治療能顯著提高模型大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量,改善神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài),反應(yīng)出針刀干預(yù)對模型大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用。此外,炎性反應(yīng)細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)可能造成神經(jīng)元細(xì)胞變性丟失,參與了PD的發(fā)病過程。模型組和針刀組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的變化提示小膠質(zhì)細(xì)胞被激活也可能是IL-1β的主要來源。說明針刀調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的變性是通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的炎性反應(yīng),下調(diào)細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)來減輕神經(jīng)元損傷的。針刀可通過降低大鼠紋狀體內(nèi)IL-1β的表達(dá),減輕炎性反應(yīng)對多巴胺能神經(jīng)元的損傷,一定程度上阻止多巴胺能神經(jīng)元變性丟失進(jìn)程從而治療PD。

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(2016-09-06收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effects of Acupotomy on Microglic and the Expression of IL-1Β in Parkinson′s Diseases

Ma Weiwei1,Guo Changqin1,Lu Juan1，Du Ningyu1， Liang Jingrong1， Wu Tong1，Lu Shengchun2

(1CollegeofAcupunctureandMoxibustion，BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029，China; 2ShengchunhospitolofDexingcity,Jiangxi334200,China)

Objective: To explore the mechanism of acpotomy in Parkinson′s disease (PD). Methods: Fourty-eight rats were randomly divided into a model group, a normal group, an acupuncture group and an acupotomy group. Using the technology of Stereo-positioning to inject the 6-hydroxy dopamine (DAOH) into the right striatum of rats to build PD rats model; Rats in the acupotomy group were treated by disposable acupotomy at suboccipital muscle group and transverse process of C1-2, twice a week for continued four weeks. Electroacupuncture (EA) group were treated by acupuncture at Baihui and Taiyang, to strike Taiyang from Baihui, third a week for four weeks. HE staining method was used for observation of morphology, quantity of neurons and quantity of microglia, and Elisa method was used for testing the expression of IL-1β. Results: Compared with the nomal group, the quantity of the dopaminegic neurons in the damaged side of PD model group obviously decreased, while microglic increased, and the level of IL-1β was improved with significant difference(P<0.05).Compared with the model group, the quantity of the dopaminegic neurons in the damaged side of the acpotomy and EA group increased obviously, while microglic decreased, and the level of IL-1β was alleviated with significant difference(P<0.05).Conclusion: Acupotomy can improve the morphology and quantity of dopaminergic neurons and its mechanism may be mediated by inhibition of microglia activation of inflammatory reaction, reducinf the content of inflammatory cytokines IL-1 beta, thus to treat PD.

Parkinson′s disease; Acpotomy; 6-hydroxy dopamine;IL-1β

企事業(yè)單位委托科技項(xiàng)目(編號:535104032)——針刀治療帕金森病機(jī)制的研究

馬薇薇(1991.06—),女,碩士研究生三年級,研究方向:針刀理論與臨床研究,E-mail:244296978@qq.com

郭長青(1959.01—),男,碩士,教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向:針刀理論與臨床研究,Tel:(010)64286687,E-mail:guochangqing66@163.com

R245.31

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.05.041