扈麗麗 王宏洪 陶冶 林柏榮 卓侃 廖金鈴

摘 要 松材線蟲是危害松樹的重要病原線蟲，在調(diào)查松材線蟲時(shí)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)其他種類的傘滑刃線蟲，明確中國的傘滑刃線蟲種類有助于松材線蟲的準(zhǔn)確鑒定。2015年在廣東省的黑松（Pinus thunbergii）上分離到的一種傘滑刃線蟲屬線蟲，除體長比東京傘滑刃線蟲（Bursaphelenchus tokyoensis）短及交合傘形狀不同外，其余形態(tài)特征和測(cè)量值基本與東京傘滑刃線蟲一致。此外，rDNA-ITS序列與東京傘滑刃線蟲的rDNA-ITS序列一致性高達(dá)98.2%，基于rDNA-ITS序列的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹表明，該線蟲與東京傘滑刃線蟲以100%的置信度聚在一起，且遺傳距離小。形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果確定該線蟲為東京傘滑刃線蟲。東京傘滑刃線蟲是中國新紀(jì)錄種，黑松是該線蟲的新寄主，同時(shí)該線蟲也是繼原始報(bào)道后的再次發(fā)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 東京傘滑刃線蟲；黑松；中國；新紀(jì)錄

中圖分類號(hào) Q959.17；S432.4+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Bursaphelenchus xylophilus causes serious damage to pines， other Bursaphelenchus species are often found with B. xylophilus in pines. Knowing Bursaphelenchus species of our country can help accurate identification of B. xylophilus. In 2015， one Bursaphelenchus species was isolated from Pinus thunbergii in Guangdong Province， China. Morphological and morphometric data were obtained using light microscopy. The Bursaphelenchus population is generally similar with B. tokyoensis from Japan in most morphometric and morphological characters except for smaller body and different bursa shape. Additionally， rDNA-ITS region of the species was amplified and sequenced， showing 98.2% identity to that of the original Japan population of B. tokyoensis. Bayesian inference method was employed to construct the phylogenetic relationship of the Bursaphelenchus population from China and other related Bursaphelenchus species. Sequences from the two populations of B. tokyoensis formed a high supported clade. Therefore， both morphological characters and molecular analyses show the Bursaphelenchus species found in China is B. tokyoensis. B. tokyoensis is a new record in China and P. thunbergii is a new host record of the nematode. Moreover， it is first record after its original description.

Key words Bursaphelenchus tokyoensis； Pinus thunbergii； China； new record

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.021

傘滑刃線蟲屬（Bursaphelenchus）有100多個(gè)種，其中松材線蟲（B. xylophilus）和椰子紅環(huán)腐線蟲（B. cocophilus）是國際公認(rèn)的重要檢疫對(duì)象[1]。松材線蟲是危害松樹的重要病原線蟲，引起松樹的萎焉病，該線蟲于1983年在中國南京地區(qū)發(fā)現(xiàn)[2]。為了阻止松材線蟲病的擴(kuò)散和蔓延，開展了大量松材線蟲的調(diào)查和檢測(cè)工作。在調(diào)查過程中，發(fā)現(xiàn)了許多其他種類的傘滑刃線蟲，目前在中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了約15種傘滑刃線蟲[3-8]。隨著傘滑刃線蟲種類的增多，人們發(fā)現(xiàn)有些種類在形態(tài)上十分相似，甚至有的種與松材線蟲也不容易區(qū)分，僅依據(jù)形態(tài)特征來鑒定包括松材線蟲在內(nèi)的傘滑刃線蟲難度越來越大。因此，越來越多的學(xué)者在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定傘滑刃線蟲，比如超過50個(gè)種的傘滑刃線蟲已經(jīng)建立了rDNA-ITS-RFLP圖譜[8]。

2015年，本研究從廣東省珠海市的黑松上分離到一種傘滑刃線蟲，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)該線蟲進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，該線蟲為東京傘滑刃線蟲（B. tokyoensis）。東京傘滑刃線蟲是2009年在日本報(bào)道的一個(gè)新種[9]，該線蟲是繼原始報(bào)道后的再次發(fā)現(xiàn)。本文描述的東京傘滑刃線蟲為中國新紀(jì)錄種，豐富了中國的傘滑刃線蟲種類，也為中國傘滑刃線蟲屬線蟲的鑒定提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 線蟲的分離和形態(tài)觀察

將樹木樣品劈成長1～2 cm、寬1 cm左右的薄片，采用貝曼漏斗法進(jìn)行線蟲分離[10]。將分離到的成熟雌蟲和雄蟲熱殺死后在TAF固定液中進(jìn)行固定，采用甘油-乙醇法對(duì)固定后的線蟲進(jìn)行脫水并制作玻片[10]。在光學(xué)顯微鏡（Nikon ECLIPSE 90i）下觀察成熟雌蟲和雄蟲的形態(tài)特征，并采用ACT-U軟件對(duì)線蟲進(jìn)行測(cè)量，其中交合刺的長度沿中弧線進(jìn)行測(cè)量。形態(tài)測(cè)量值的計(jì)算采用De Man公式[8]。

1.2 rDNA-ITS序列擴(kuò)增

采用微量DNA提取法提取線蟲DNA[11]。用引物F194（5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′）[12]和5 368 r（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）[13]對(duì)rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：DNA模板5 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.125 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，加無菌水至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；接著94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，每100 mL瓊脂糖凝膠加入5 μL EB替代物GoldView。用凝膠圖象分析系統(tǒng)照相并保存。

1.3 序列分析

將rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。切膠回收，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化克隆后送交上海英駿生物技術(shù)有限公司，用3730全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定序列，序列結(jié)果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov）上進(jìn)行同源性檢索，序列一致性分析采用DNAStar軟件進(jìn)行[6]。

1.4 分子系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用貝葉斯法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，構(gòu)樹步驟參照文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果

通過形態(tài)學(xué)觀察及測(cè)量，采自廣東珠海黑松上的傘滑刃線蟲為東京傘滑刃線蟲（Bursaphelenchus tokyoensis Kanzaki，Aikawa & Giblin-Davis）。對(duì)該種群描述，其形態(tài)測(cè)量值及與文獻(xiàn)記述的比較見表1。

雄蟲（圖1-B，F(xiàn)-G，J）：蟲體熱殺死后呈J形；體環(huán)細(xì)；側(cè)區(qū)具4條側(cè)線；唇區(qū)與體部顯著縊縮，高1.9～2.2 μm，寬4.6～5.1 μm；口針長11～12 μm，基部略增厚，針錐部占口針全長的40%；中食道球長卵圓形，瓣門位于中食道球中部；排泄孔位于神經(jīng)環(huán)和中食道球中部之間；食道腺從背部覆蓋腸，約為中食道球長度的5倍；單精巢，前伸，長度約為體長的30%～50%；交合刺成對(duì)，長10.0～15.5 μm，踝突小，方形，難以辨認(rèn)；喙突小，鈍尖或圓；交合刺遠(yuǎn)端無刺帽；尾短，呈弓形，長度約為肛門處體寬的2倍；尾乳突7個(gè)：包括1個(gè)小乳突位于泄殖腔前中部；第1對(duì)側(cè)腹乳突位于泄殖腔處；其它兩對(duì)位于泄殖腔后，彼此相鄰排列；具1小的端生交合傘，交合傘末端凹陷。

雌蟲（圖1-A，C-E，H-I）：蟲體熱殺死后強(qiáng)烈腹彎；體前端及表皮特征與雄蟲相似；單卵巢，前伸，長度占體長的30%～45%；陰門具一小的陰門蓋；陰道直，向前傾斜；后陰子宮囊長，約為陰門處體寬的7～9倍，占肛陰距的85%～90%；尾短，圓錐形，向末端漸變細(xì)，末端具一釘狀的突起。

2.2 分子特征

通過DNA擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，結(jié)果表明東京傘滑刃線蟲中國種群rDNA-ITS序列長1 080 bp（GenBank登陸號(hào)為KY646465）。將該序列在NCBI上進(jìn)行Blastn比對(duì)，結(jié)果表明該序列與東京傘滑刃線蟲日本種群的ITS序列（GenBank登錄號(hào)為AB430445）同源性最高，ITS序列一致性達(dá)到98.2%。

為進(jìn)一步確定該種群的地位，利用MrBayes3.2軟件，通過貝葉斯法構(gòu)建了一棵傘滑刃線蟲的rDNA-ITS分子發(fā)育樹（圖2）。從分子發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)東京傘滑刃線蟲中國種群與日本種群以100%的置信度聚在一支上，且遺傳距離小。分子數(shù)據(jù)進(jìn)一步確定該線蟲為東京傘滑刃線蟲。

3 討論

東京傘滑刃線蟲是2009年在日本紅松（Pinus densiflora）上發(fā)現(xiàn)報(bào)道的一個(gè)新種[9]，本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，在中國廣東省珠海的黑松上發(fā)現(xiàn)了東京傘滑刃線蟲，黑松是其新寄主。這也是繼原始報(bào)道之后首次發(fā)現(xiàn)東京傘滑刃線蟲。本研究發(fā)現(xiàn)的東京傘滑刃線蟲中國種群與已報(bào)道的日本種群相比，除了體長較短（雄蟲：478.8～624.8 μm vs 632～768 μm；雌蟲：520.8～695.6 μm vs 706～871 μm）和交合傘形狀不同外，其它形態(tài)特征和測(cè)量值都基本一致。傘滑刃線蟲的交合傘形狀存在種內(nèi)變異的現(xiàn)象，例如梅西傘滑刃線蟲（B. masseyi）存在寬圓形或末端凹陷的交合傘[15]，東京傘滑刃線蟲日本種群的交合傘與梅西傘滑刃線蟲寬圓形交合傘形態(tài)相似，而中國種群則與梅西傘滑刃線蟲末端凹陷的交合傘形態(tài)一致。

植物寄生線蟲存在rDNA-ITS序列種內(nèi)變異[16-18]，在傘滑刃線蟲屬線蟲中，ITS序列種內(nèi)差異可達(dá)到2%[19]。本研究發(fā)現(xiàn)的東京傘滑刃線蟲中國種群與日本種群ITS序列變異<2%，為1.8%。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)，確定該傘滑刃線蟲為東京傘滑刃線蟲。

目前，在傘滑刃線蟲中，普遍認(rèn)為只有松材線蟲和椰子紅環(huán)腐線蟲是重要的植物病原物，然而擬松材線蟲（B. muconatus）中的一些種群對(duì)松樹也具有致病性[20]。在溫室條件下，接種試驗(yàn)表明十二齒小蠹傘滑刃線蟲（B. sexdentati）、利昂傘滑刃線蟲（B. leoni）、安娜摩傘滑刃線蟲（B. anamurius）和瓦里西傘滑刃線蟲（B. vallesianus）均會(huì)對(duì)松樹造成危害，特別是十二齒小蠹傘滑刃線蟲對(duì)松樹具有很強(qiáng)的致病性[21-22]。目前，東京傘滑刃線蟲日本種群和中國種群都是從枯死的松木上分離獲得，到底東京傘滑刃線蟲是在松樹死亡后進(jìn)入松樹取食真菌，還是可寄生松樹使松樹死亡有待進(jìn)一步研究。

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