黃志明 李晨曦 陳磊 江濤 蘇軍 岡義人 帥鵬

摘 要 為探究毛竹miRNA在種子萌發(fā)過程中相關(guān)調(diào)控機理，利用熒光定量和生物信息學(xué)技術(shù)分析毛竹中可能參與種子萌發(fā)調(diào)控的miRNA，并預(yù)測其潛在靶基因。并對毛竹種子萌發(fā)過程中胚芽萌發(fā)的不同階段的miRNA及其潛在靶基因的表達(dá)模式進(jìn)行驗證分析。結(jié)果顯示，毛竹4個miRNA基因（phe-miRNA156k、phe-miRNA159b、phe-miRNA160a 和phe-miRNA396e）在種子萌發(fā)至形成完整胚芽的3個階段中表達(dá)水平呈上升趨勢。通過miRNA及其靶基因的表達(dá)關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)毛竹這4個miRNA潛在靶基因（phe-miRNA156-T1、phe-miRNA156-T2、phe-miRNA159-T1、phe-miRNA160-T1、phe-miRNA396-T1和phe-miRNA396-T2）的表達(dá)下調(diào)，而這些靶基因可能參與調(diào)節(jié)毛竹種子萌發(fā)、細(xì)胞分化和器官形成等過程。其中根中高表達(dá)的phe-miR396e隨著毛竹萌發(fā)而上調(diào)表達(dá)，其靶基因則表達(dá)下調(diào)，它可能通過抑制其2個生長因子相關(guān)蛋白的靶基因來實現(xiàn)對毛竹萌發(fā)過程的調(diào)控。由此表明，這4個毛竹miRNA在胚芽萌發(fā)過程可能具有重要作用，研究結(jié)果對進(jìn)一步發(fā)展毛竹分子育種提供一定理論參考。

關(guān)鍵詞 毛竹；miRNA；胚芽萌發(fā)

中圖分類號 S795 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract In order to study the role of microRNAs during the process of seed germination and embryo morphogenesis in moso bamboo[Phyllostachys edulis（Carr.）H. De Lehaie]， bamboo miRNAs and their putative targets were found and predicted through the bioinformatics analysis and RT-qPCR results. And the expression pattern of miRNA during different germination stages were analyzed and verified. The results showed that the phe-miRNA156k， phe-miRNA159b， phe-miRNA160a and phe-miRNA396e had a rising expression trend during three stages of the seed germination. Through the association analysis between miRNA and their targets， we found that the 4 miRNAs are mainly negatively regulate their potential target genes phe-miRNA156-T1， phe-miRNA156-T2， phe-miRNA159b-T1， phe-miRNA160-T1， phe-miRNA396-T1 and phe-miRNA396-T2. And these target genes were predicted to be probably participated in the progress of bamboo seed germination， cell differentiation and the formation of organs and other life activities. In addition， phe-miR396e that with a high expression level in root and its target genes showed simultaneous up- and down-regulation of expression during bamboo seed germination. Phe-miR396e maybe achieve control of the process of bamboo germination through inhibit its two target genes which related to growth factor. These results showed that these four miRNAs might plays an important role in bamboo germination and may provide reference for further studies of the bamboo molecular breeding.

Key words Moso bamboo（Phyllostachys edulis）； miRNA； embryo morphogenesis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.019

毛竹[Phyllostachys edulis（Carr.）H. De Lehaie]是禾本科竹亞科剛竹屬的一種散生竹種。其生長快速、材性優(yōu)良、產(chǎn)量高、用途廣泛，是非常重要的森林非木質(zhì)利用資源。在我國，毛竹林面積占全國總竹林面積的約70%，是中國竹林中分布范圍最廣、面積最大的竹種[1-3]。毛竹的開花結(jié)實習(xí)性奇特，其開花周期長、難以預(yù)測，終身開花一次并在種子發(fā)育成熟后死亡，且開花零散，自然結(jié)實率低，質(zhì)量差，種子壽命短[4-5]。由于毛竹種子采收難、保存難、發(fā)芽率低，使得利用種子培育實生苗的研究和應(yīng)用受到了很大的限制。因而，研究毛竹種子的萌發(fā)、生長和發(fā)育等過程中的相關(guān)機制，對毛竹育種和竹林培育具有重要意義。

種子在適宜條件下，幼胚恢復(fù)生長，細(xì)胞基本代謝活動開始運轉(zhuǎn)，形成新的組織和器官，形態(tài)建成逐步完成[6]。從分子生物學(xué)角度來看，種子的萌發(fā)處處都受到相關(guān)基因的調(diào)控。開展種子萌發(fā)相關(guān)的分析特別是在分子層面進(jìn)行相關(guān)的研究，對于指導(dǎo)毛竹實生苗培育和造林工作具有良好的生產(chǎn)實踐意義和借鑒作用。

miRNA是一類約21個核苷酸長度的非編碼小分子RNA，廣泛存在于動物、植物以及一些病毒中[7]。miRNA主要通過堿基互補原則切割靶基因mRNA或抑制其翻譯來實現(xiàn)對靶基因的負(fù)調(diào)控功能[8]。在植物體內(nèi)，miRNA對葉片形成，根系發(fā)育以及成花過程等發(fā)育過程起著重要的調(diào)控作用[9]。Wang等[10]在玉米中發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)的早期，miRNA166、miRNA156和miRNA528都呈現(xiàn)較高的表達(dá)量，可能調(diào)控種子的萌發(fā)過程[10]。同時，有研究報道，擬南芥miRNA159與種子萌發(fā)過程中ABA響應(yīng)的正向調(diào)控因子MYB33和MYB101在種子的休眠和萌發(fā)過程中的表達(dá)存在一定聯(lián)系[11]。miRNA396 （ath-miR396a-3p）則其主要通過抑制生長調(diào)控因子的表達(dá)來參與植物的生長發(fā)育各個階段的調(diào)控[12]。Hu等[13]對百脈根種子萌發(fā)時miRNA的表達(dá)情況的研究發(fā)現(xiàn)，miR156、miR160和miR399的表達(dá)水平顯著升高，結(jié)合Martin等對西紅柿種子萌發(fā)的相關(guān)研究結(jié)果，可推斷出上述miRNA對種子萌發(fā)可能起到重要作用[13]。

近年來高通量測序技術(shù)的興起使得大規(guī)模的發(fā)掘并鑒定毛竹miRNA成為可能。Xu等[14]利用高分辨率的測序接頭，在毛竹根和葉中鑒定并證實了5個新的miRNA。He等[15]在毛竹發(fā)育的莖中進(jìn)行miRNA研究，鑒定出大量可能參與速生過程的miRNA基因。Gao等[16]通過二代測序技術(shù)對毛竹不同開花時期的miRNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)毛竹miRNA在花發(fā)育過程中的作用。王麗麗等[17]發(fā)現(xiàn)毛竹miR164b對靶基因PeNAC1的調(diào)控，與毛竹在應(yīng)對不同非生物脅迫過程密切相關(guān)。而且毛竹miR397 和miR1432 隨著光照、干旱等脅迫以及激素（ABA 和GA3）處理響應(yīng)表達(dá)，這些miRNA可能在毛竹應(yīng)對非生物脅迫中起重要作用[18]。這些毛竹miRNA的發(fā)掘和鑒定為本研究提供可靠的基礎(chǔ)。

本研究主要關(guān)注miR156、miR159、miR160和miR396這4個miRNA及其靶基因在毛竹種子萌發(fā)過程中胚芽內(nèi)的表達(dá)情況。同時研究毛竹實生苗根莖葉三部位中這4個miRNA及其靶基因的表達(dá)水平情況。初步探究毛竹胚芽萌發(fā)、生長過程相關(guān)響應(yīng)的miRNA及其靶基因可能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建省林業(yè)科學(xué)院提供的當(dāng)年采收的毛竹種子為材料，毛竹種子剝?nèi)シN殼，用清水浸泡過夜，自來水沖洗2 h去除殘留雜質(zhì)，然后用0.1%的高錳酸鉀溶液消毒1 h，蒸餾水沖洗干凈后置于無菌濾紙上，以適量蒸餾水在黑暗條件下進(jìn)行萌發(fā)，每日觀察記錄毛竹種子萌發(fā)狀態(tài)。依據(jù)種子胚芽萌發(fā)的狀態(tài)將毛竹種子的萌發(fā)過程分為胚芽萌發(fā)第1階段（7 d）、胚芽萌發(fā)第2階段（15 d）和胚芽萌發(fā)第3階段（21 d）。分別取3個萌發(fā)階段完整的毛竹胚芽，迅速置于液氮中冷凍，然后-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 miRNA成熟體序列獲得 通過同源序列比對并參考現(xiàn)有毛竹miRNA研究[19]，從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫BambooGDB： Bamboo Genome Database（http：//www.bamboogdb.org/）中獲取miRNA成熟體序列，篩選所得miRNA序列為：phe-miR156k：5'- UUGACAGAAGAGAGUGAGCAC-3'；phe-miR159b：5'-UUGGAUUGAAGGGAGCUCUC-3'；phe-miR160a：5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA-3'；phe-miR396e：5'-UCCACAGGCUUUCUUGAACUG-3'。

1.2.2 miRNA前體及啟動子序列的預(yù)測分析 用miRNA成熟序列比對毛竹的基因組序列，利用在線預(yù)測軟件RNAfold（http：//www.tbi.univie.ac.at/RNA/）預(yù)測分析其二級結(jié)構(gòu)，得出毛竹4個miRNA成熟體的前體序列。從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫上下載前體序列的上游1 500 bp序列，利用在線平臺Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行前體上游啟動子區(qū)的作用元件及其功能預(yù)測分析。

1.2.3 miRNA 靶基因預(yù)測 利用植物小RNA靶基因分析服務(wù)器psRNATarget將4個毛竹miRNA 成熟體序列（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/），與毛竹CDS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。運算中的最大期望值（Maximum expectation）設(shè)置為3，其他值設(shè)為默認(rèn)值進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測。從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫下載潛在靶基因序列，分析miRNA對潛在靶基因的靶標(biāo)作用位點及靶基因主要結(jié)構(gòu)和功能。

1.2.4 miRNA成熟體和靶基因的qRT-PCR定量分析 用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根）提取毛竹種子萌發(fā)過程3個時期的胚芽樣品總RNA，操作步驟參照說明書。用超微分光光度計（Nanodrop 2000）檢測RNA的濃度和質(zhì)量。將總RNA用Mir-X miRNA First-strand synthesis Kit試劑盒加PolyA尾并反轉(zhuǎn)錄（Clontech）獲取cDNA，將cDNA稀釋10倍后用于miRNA定量分析。反向引物用試劑盒中提供的通用引物，正向引物分別為：phe-miR156k： 5'-TTGACAGAAGAGAGTGAGCAC-3'；phe-miR159b：5'-TTGGATTGAAGGGAGCTCTC-3'；phe-miR160a：5'-TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA-3'；phe-miR396e：5'-TCCACAGGCTTTCTTGAACTG-3'，選擇U6作為內(nèi)參基因。

對于miRNA靶基因的反轉(zhuǎn)錄，通過總RNA用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作方法參考說明書。選擇TIP41為內(nèi)參基因[20]。應(yīng)用定量引物設(shè)計網(wǎng)站Primer3web： （http：//bioinfo. ut.ee/primer3/）設(shè)計檢測miRNA靶基因表達(dá)量的引物（表1）。實時熒光定量用的GoTaqR qPCR Master Mix（美國Promega）試劑盒在ABI-Q6儀器上進(jìn)行定量分析。參照說明書進(jìn)行反應(yīng)體系配制，每個基因表達(dá)實驗設(shè)計3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用Excel 2010和Spss 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，包括采用公式RQ=2-ΔΔCT進(jìn)行miRNA及其可能靶基因相對表達(dá)水平的計算分析，采用雙變量相關(guān)模式分析，選擇Pearson相關(guān)指數(shù)和Spearman 相關(guān)系數(shù)同時進(jìn)行4個miRNA及其對應(yīng)靶基因的表達(dá)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹種子胚芽萌發(fā)過程中miRNA的表達(dá)分析

通過對毛竹種子胚芽萌發(fā)3個不同階段（7、15和21 d）的4個miRNA表達(dá)水平的監(jiān)測，結(jié)果顯示它們表達(dá)水平總體都呈現(xiàn)上升的趨勢（圖1）。其中，胚芽中的phe-miR156k和phe-miR160a的表達(dá)量在15 d時達(dá)到最高值，種子萌發(fā)的15 d到21 d期則略微有所下降。而胚芽中的phe-miR159b和在種子萌發(fā)15 d期，相較于萌發(fā)初期（7 d期），表達(dá)水平有明顯的升高。它們在達(dá)到15 d期后總的表達(dá)量變化就呈現(xiàn)相對穩(wěn)定。而phe-miR396e在毛竹種子胚芽萌發(fā)期間，表達(dá)水平一直呈穩(wěn)步上升趨勢，且直到21 d時才達(dá)到表達(dá)峰值。結(jié)果顯示，在毛竹萌發(fā)時，這4個miRNA的表達(dá)量隨著種子的萌發(fā)上調(diào)，該結(jié)果顯示它們可能參與毛竹萌發(fā)過程基因的調(diào)控。

2.2 miRNA 啟動子序列分析

過啟動子分析軟件，對4個miRNA的34個不同前體的上游啟動子區(qū)域相關(guān)順式調(diào)控元件進(jìn)行分析（表2）。4個miRNA的潛在前體上游調(diào)控區(qū)均含有啟動子基本作用元件，如TATA-box，CAAT-box。同時預(yù)測到的前體上游調(diào)控區(qū)存在調(diào)控分生組織發(fā)育、胚乳表達(dá)等相關(guān)的作用元件，以及光、激素響應(yīng)相關(guān)的作用元件。其中，phe-miR159b的前體序列上游存在細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的作用元件，phe-miR160a中則存在種子特異性相關(guān)的作用元件。

2.3 miRNA靶基因的預(yù)測

4個miRNA預(yù)測并根據(jù)錯配值大小等條件優(yōu)先篩選到8個靶基因（表3）。其中，phe-miR156k的靶基因是2個SBP家族的基因，功能預(yù)測顯示其主要參與植物花的形成和后期發(fā)育[21]。Phe-miR159b 的1個潛在靶基因是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的基因，還預(yù)測到1個與種子萌發(fā)代謝相關(guān)的磷脂酶C相關(guān)的基因；phe-miR396e的2個靶基因具有生長調(diào)控因子的功能，預(yù)測顯示主要參與葉片和根系的發(fā)育形成。phe-miR160a的2個靶基因具有響應(yīng)生長素的功能。

2.4 毛竹種子胚芽萌發(fā)過程中miRNA靶基因的表達(dá)

通過qRT-PCR技術(shù)檢測了所預(yù)測到的8個靶基因在毛竹胚芽萌發(fā)過程中的3個不同時期的表達(dá)分析。在這8個靶基因中，只有2個基因（phe-miR159-T2和phe-miR160-T2）在萌發(fā)過程中上調(diào)表達(dá)，而其他6個miRNA的相應(yīng)靶基因則是下調(diào)表達(dá)。靶基因phe-miR159b-T2在15 d時開始響應(yīng)萌發(fā)過程，而phe-miR160-T2在7 d時已經(jīng)開始上調(diào)表達(dá)。在6個下調(diào)表達(dá)的靶基因中，有2個靶基因（phe-miR156-T2和phe-miR160-T1）是隨著萌發(fā)的整個過程下調(diào)表達(dá)。而其他4個下調(diào)的靶基因則是在7 d期開始下調(diào)表達(dá)，而到15 d期表達(dá)則趨于平穩(wěn)直至21 d期（圖2）。

胚芽萌發(fā)的3個時期miRNA的表達(dá)分析可發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量的變化總體呈一定的趨勢，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在毛竹種子萌發(fā)過程中，4個miRNA在胚芽的表達(dá)水平和它們的潛在靶基因的表達(dá)水平總體上（5/8）是呈顯著負(fù)相關(guān)（表4），而其中的phe-miR159-T2和phe-miR160-T2兩個miRNA和靶基因?qū)Σ环县?fù)相關(guān)特征。結(jié)合Pearson相關(guān)性指數(shù)和spearman相關(guān)性指數(shù)分析，phe-miR159與其潛在靶基因phe-miR159-T1的表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)。同時，phe-miR156與其2個潛在靶基因以及phe-miR396與潛在靶基因phe-miR396-T1、phe-miR396-T2的表達(dá)水平之間的相關(guān)性也較為顯著。

毛竹生長過程中，種子萌發(fā)，發(fā)育，生長、各細(xì)胞分化形成不同組織器官，長成毛竹實生苗。其中，具有豐富居間分生組織的毛竹莖和主要進(jìn)行光合作用的毛竹葉子，以及不斷向地下延生快速生長的毛竹根系是毛竹實生苗的三大重要部位。

2.5 毛竹實生苗不同部位miRNA的表達(dá)

4個miRNA在毛竹的根、莖、葉3個不同部位的表達(dá)水平都呈現(xiàn)差異，其中葉片中4個miRNA的表達(dá)水平差異最為顯著（圖3）。phe-miR396e在3個部位中都具有最高的表達(dá)水平。同時，同一個miRNA在毛竹實生苗的不同組織中的表達(dá)水平也呈現(xiàn)差異。phe-miR156k和phe-miR159b的表達(dá)水平在莖中表達(dá)量最低，而phe-miR160a和phe-miR396e的表達(dá)水平于葉中最低，4個miRNA的表達(dá)量在毛竹實生苗的根中呈最高值。

3 討論

毛竹產(chǎn)量的需求日益增大使得人們對毛竹發(fā)育生長的調(diào)控機制越來越重視，這是培育高產(chǎn)、速生毛竹品種的前提條件之一。本研究對毛竹4個miRNA的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)它們在萌發(fā)過程中，根中的表達(dá)量均高于在莖和葉中的表達(dá)量。這可能與生長初期毛竹需要集中大量能量來生根有一定的關(guān)系，深入土壤的扎根有利于葉片及植株整體對于土壤無機營養(yǎng)的獲取。而經(jīng)預(yù)測這4個miRNA與根生長具有一定的關(guān)系。例如在根中高表達(dá)量的miR396的擬南芥同源基因參與根中干細(xì)胞和增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)換過程，在根中具有重要的調(diào)控功能[22]。

對于4個miRNA啟動子分析中發(fā)現(xiàn)含有大量與GA3、ABA、生長素等激素及植物分生、分化相關(guān)的作用元件。這表明它們在毛竹生長發(fā)育過程中可能參與到激素的調(diào)控過程。在擬南芥中，miR159被證實受到ABA的誘導(dǎo)而表達(dá)，并在種子萌發(fā)過程中調(diào)控下游靶基因MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[11]。本研究中毛竹phe-miR159b啟動子中發(fā)現(xiàn)可能的ABA響應(yīng)元件且在種子萌發(fā)中表達(dá)上調(diào)，說明毛竹phe-miR159b可能也在毛竹種子受ABA調(diào)控的過程中起一定的調(diào)控作用。

植物miRNA的表達(dá)具有一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通常是抑制其靶基因的表達(dá)得以實現(xiàn)。miR156表達(dá)水平在胚芽發(fā)育中后期顯著上升，其靶基因phe-miR156-T1和phe-miR-156-T2都呈表達(dá)水平下降趨勢，miRNA和靶基因的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。擬南芥miR156通過調(diào)控SPL3的表達(dá)來實現(xiàn)幼體到成體的轉(zhuǎn)變[23]，而本研究中miR156也與毛竹SPL家族的2個靶基因在表達(dá)趨勢上具有一定的相關(guān)性。通過功能預(yù)測分析顯示，phe-miRNA159b 的潛在靶基因phe-miR159-T2是磷酸酯酶C相關(guān)的基因，其表達(dá)水平在胚芽生長第3階段明顯上升，phe-miRNA159b可能通過正向調(diào)控作為漿胞膜上的關(guān)鍵酶的基因，從而對細(xì)胞的分裂和細(xì)胞的代謝活動進(jìn)行產(chǎn)生重要意義。毛竹胚芽發(fā)育過程中，phe-miRNA396e基因的表達(dá)水平不斷增加，其兩個靶基因的表達(dá)水平都呈現(xiàn)與miRNA成熟體表達(dá)水平的顯著負(fù)相關(guān)。這種表達(dá)模式與目前大部分基于miR396的研究結(jié)果相似。在葉子發(fā)育中miR396的表達(dá)量隨葉齡的增長而增加[22]。且有研究表明miR396通過負(fù)調(diào)控GRF，抑制細(xì)胞分裂由此調(diào)控植物的生長發(fā)育[24-26]。

在本研究中有兩個靶基因與其上游miRNA的表達(dá)模式一致，同時在毛竹萌發(fā)過程中表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果并未符合傳統(tǒng)的miRNA表達(dá)上調(diào)后會使其靶基因相應(yīng)的表達(dá)下調(diào)，這可能是由于miRNA在對部分靶基因調(diào)控是只是起微調(diào)的作用或者是由于其對靶基因調(diào)控上起到增強子調(diào)節(jié)器的作用[27]。

綜上，通過初步對4個毛竹miRNA表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們可能參與到毛竹種子萌發(fā)過程，但仍需要對它們靶基因的功能驗證進(jìn)行深入分析。本研究中發(fā)現(xiàn)phe-miR396e在根中高表達(dá)且隨著毛竹萌發(fā)而上調(diào)表達(dá)，它可能通過抑制其兩個生長因子相關(guān)蛋白的靶基因來實現(xiàn)對毛竹萌發(fā)過程的調(diào)控。越來越多的miRNA在毛竹種子萌發(fā)過程的深入研究，將有可能揭示其內(nèi)在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將使得毛竹的分子育種成為可能。

參考文獻(xiàn)

[1] 唐曉鹿. 鄂南幕阜山區(qū)不同經(jīng)營措施毛竹林土壤呼吸特征研究[D]. 北京： 中國林業(yè)科學(xué)研究院， 2012： 106.

[2] 劉 芳， 袁宗勝， 張國防， 等， 毛竹內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2014， 29（12）： 1 236-1 239.

[3] Liu H， Wu M， Zhu D， et al. Genome-wide analysis of the AAAP gene family in moso bamboo（Phyllostachys edulis）[J]. BMC Plant Biol， 2017， 17（1）： 29.

[4] 柴振林， 秦玉川， 華錫奇， 等. 竹子開花原因研究進(jìn)展[J]. 浙江林業(yè)科技， 2006（2）： 53-57.

[5] 周建梅. 開花毛竹的基因流及F1代的種質(zhì)發(fā)掘[D]. 北京： 中國林業(yè)科學(xué)研究院， 2014： 100.

[6] 劉 鳳， 曹幫華， 蔡春菊， 等. 毛竹種子萌發(fā)過程中生理生化特性變化的研究[J]. 種子， 2009（2）： 12-14.

[7] Axtell M J. Classification and comparison of small RNAs from plants[J]. Annu Rev Plant Biol， 2013， 64： 137-159.

[8] Shuai P， Liang D， Zhang Z， et al. Identification of drought-responsive and novel Populus trichocarpa microRNAs by high-throughput sequencing and their targets using degradome analysis[J]. BMC Genomics， 2013， 14： 233.

[9] 張俊紅， 張守攻， 吳 濤， 等， 落葉松體胚發(fā)育中5個miRNA前體與成熟體的表達(dá)[J]. 植物學(xué)報， 2012（5）： 462-473.

[10] Wang L， Liu H， Li D， et al. Identification and characterization of maize microRNAs involved in the very early stage of seed germination[J]. BMC Genomics， 2011， 12： 154.

[11] Reyes J L， Chua N H. ABA induction of miR159 controls transcript levels of two MYB factors during Arabidopsis seed germination[J]. Plant J， 2007， 49（4）： 592-606.

[12] Wang L， Gu X， Xu D， et al. miR396-targeted AtGRF transcription factors are required for coordination of cell division and differentiation during leaf development in Arabidopsis[J]. J Exp Bot， 2011， 62（2）： 761-773.

[13] Hu J， Zhang H， Ding Y. Identification of conserved microRNAs and their targets in the model legume Lotus japonicus[J]. J Biotechnol， 2013， 164（4）： 520-524.

[14] Xu P， Morhorianul， Yang L， et al. Small RNA profile in moso bamboo root and leaf obtained by high definition adapters[J]. PLoS One， 2014， 9（7）： e103590.

[15] He C Y， Cui K， Zhang J G， et al. Next-generation sequencing-based mRNA and microRNA expression profiling analysis revealed pathways involved in the rapid growth of developing culms in Moso bamboo[J]. BMC Plant Biol， 2013， 13： 119.

[16] Gao J， Ge W， Zhang Y， et al. Identification and characterization of microRNAs at different flowering developmental stages in moso bamboo（Phyllostachys edulis） by high-throughput sequencing[J]. Mol Genet Genomics， 2015， 290（6）： 2 335-2 353.

[17] 王麗麗， 趙韓生， 孫化雨， 等. 脅迫條件下毛竹miR164b及其靶基因PeNAC1表達(dá)研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究， 2015（5）： 605-611.

[18] 王麗麗， 趙韓生， 孫化雨，等. 毛竹miR397和miR1432的克隆及其逆境脅迫響應(yīng)表達(dá)分析[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2015（6）： 63-70.

[19] Zhao H， Wang L， Dong L， et al. Discovery and comparative profiling of microRNAs in representative monopodial bamboo （Phyllostachys edulis） and sympodial bamboo （Dendrocalamus latiflorus）[J]. PLoS One， 2014， 9（7）： e102375.

[20] Fan C， Ma J， Guo Q， et al. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR in bamboo （Phyllostachys edulis）[J]. PLoS One， 2013， 8（2）： e56573.

[21] Schwab R， Dalatnik J F， Riester M， et al. Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J]. Dev Cell， 2005， 8（4）： 517-527.

[22] Rodriguez R E， Ercoli M F， Debernardi J M， et al. MicroRNA miR396 regulates the switch between stem cells and transit-amplifying cells in Arabidopsis roots[J]. Plant Cell， 2015， 27（12）： 3 354-3 366.

[23] Xu M， Hu T， Zhao J， et al. Developmental functions of miR156-Regulated Squamosa Promoter Binding Protein-like （SPL） genes in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS Genet， 2016， 12（8）： e1006263.

[24] Liu D， Song Y， Chen Z， et al. Ectopic expression of miR396 suppresses GRF target gene expression and alters leaf growth in Arabidopsis[J]. Physiol Plant， 2009， 136（2）： 223-236.

[25] Li S， Qao F， Xie K， et al. The OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1 regulatory module determines grain size and yield in rice[J]. Plant Biotechnol J， 2016， 14（11）： 2 134-2 146.

[26] Wang L， Gu X， Xu D， et al. miR396-targeted AtGRF transcription factors are required for coordination of cell division and differentiation during leaf development in Arabidopsis[J]. J Exp Bot， 2011， 62（2）： 761-773.

[27] Xiao M， Li J， Li W， et al. MicroRNAs activate gene transcription epigenetically as an enhancer trigger[J]. RNA Biol， 2016， 6： 1-9.