張竹君 劉權(quán)

摘要[目的]篩選馬鈴薯瘡痂病的生防菌。[方法]從馬鈴薯瘡痂病發(fā)病土壤中取樣，經(jīng)過稀釋培養(yǎng)和二次劃線純化獲得單克隆菌株，通過抑菌試驗最終得到1株對馬鈴薯瘡痂病具有較好抑制效果的細(xì)菌BU09，通過16S rDNA測序和系統(tǒng)進(jìn)化分析對該菌株進(jìn)行分子鑒定。[結(jié)果]細(xì)菌BU09屬于普城沙雷氏菌，對馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治效果。[結(jié)論]試驗結(jié)果為馬鈴薯瘡痂病的田間防治提供了參考。

關(guān)鍵詞馬鈴薯瘡痂??；瘡痂鏈霉菌；普城沙雷氏菌；生物防治

中圖分類號S435.32文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）11-0123-02

Abstract[Objective] To screen out biocontrol bacteria for potato scab.[Method] We sampled from the potato scab diseased soil， and screened single clone strains by dilution and streak culture. A strain named BU09 which had obvious effect against S. scabies was gained by inhibition zone test. The molecular identification was executed through 16S rDNA sequencing and phylogenetic analysis.[Result] The BU09 strain was classified as Serratia plymuthica. The following pot trail revealed that BU09 had a good inhibition effect against S. scabies.[Conclusion] This result can supply reference for the filed control against potato scab.

Key wordsPotato scab；Scab streptomyces；Serratia plymuthica；Biocontrol

馬鈴薯瘡痂病是由植物病原菌鏈霉菌（Steptomyces spp.）引起的，只侵害馬鈴薯的地下塊莖部。最初在塊莖上出現(xiàn)褐色斑點，后逐漸擴(kuò)大形成圓形病斑，病斑周緣突起，周圍有一圈皺縮木栓層，最后形成瘡痂狀硬斑。該病害不僅會造成馬鈴薯產(chǎn)量降低，更會嚴(yán)重影響馬鈴薯的外觀品質(zhì)，極大地降低馬鈴薯的商業(yè)價值[1-2]。瘡痂病原菌鏈霉菌屬放線菌，可在土壤中存活多年，營腐生生活，有好氣性，最適生長與發(fā)病溫度為25 ℃[3-5]。黑龍江省地處北溫帶與寒帶交叉帶，土壤溫度在馬鈴薯生長期長時間維持在25 ℃左右，為馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生和流行提供了機(jī)會。目前，在黑龍江省各馬鈴薯種植區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多處瘡痂病發(fā)生的種植區(qū)，呈現(xiàn)出了大規(guī)模暴發(fā)的態(tài)勢，值得引起足夠的重視，需及早進(jìn)行防控，避免造成更大規(guī)模的損失。

馬鈴薯瘡痂病是一種難防的世界性土傳病害，目前對該病害還缺乏特別有效的防治方法，生產(chǎn)中針對該病害的主要防治方法有選用抗病品種、化學(xué)藥劑防治和生物制劑防治等[6-8]。其中，抗病品種具有篩選難度大、適用地區(qū)受限的缺點；而化學(xué)藥劑不僅污染環(huán)境，還會使土壤的微生物生態(tài)系統(tǒng)失衡，不利于可持續(xù)發(fā)展。研究表明，采用生物防治手段抑制馬鈴薯瘡痂病是較有效的方法[9-12]。馬鈴薯瘡痂病在自然條件下發(fā)病的嚴(yán)重程度主要取決于土壤中病原菌的數(shù)量和種類，同時土壤中還會相應(yīng)存在對其具有拮抗性的微生物。這些拮抗菌株可產(chǎn)生抑制病原菌生長的物質(zhì)，且可自然分解、無有害物質(zhì)殘留，因此被廣泛關(guān)注。在黑龍江省馬鈴薯種植面積快速增加的背景下，馬鈴薯瘡痂病暴發(fā)的潛在危險值得引起重視，針對馬鈴薯瘡痂病害的生物防治研究應(yīng)盡快開展。筆者針對以上情況，從馬鈴薯瘡痂病害發(fā)生地區(qū)采集發(fā)病土壤和塊莖組織，進(jìn)行了拮抗菌的篩選和鑒定，獲得具有突出抑制效果的生防菌，隨后進(jìn)行盆栽試驗，測定了生防菌對瘡痂鏈霉菌的防治效果，以期為瘡痂鏈霉菌的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基。YME固體平板：酵母粉 4 g，麥芽糖提取物 10 g，葡萄糖右旋糖 4 g，瓊脂粉 15 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2，121 ℃下濕熱滅菌30 min，冷卻后倒入培養(yǎng)皿。LB固體平板：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 15 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃下濕熱滅菌30 min，冷卻后倒入培養(yǎng)皿。

1.1.2供試菌種。馬鈴薯瘡痂鏈霉菌（S.scabies）為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院保存，測試馬鈴薯品種為大西洋。

1.1.3試劑。Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer購自MBI；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T載體試劑盒購自天根生化公司。引物合成、測序由生工生物公司完成。

1.2方法

1.2.1目的菌株的篩選。從黑龍江省克山縣馬鈴薯種植區(qū)瘡痂病發(fā)病地塊中取土樣，稱取1 g，加入含有玻璃珠的200 mL三角瓶中，加蒸餾水50 mL，150 r/min振蕩1 h。取懸浮培養(yǎng)液稀釋10-2后，取100 μL涂布到LB固體平板上，37 ℃倒置靜止培養(yǎng)24 h，得到布滿單克隆的平板。選取不同外觀的克隆分別進(jìn)行劃線培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)菌株，編號并溶解到20%甘油的溶液中，于-80 ℃保存。目的菌株的抑菌效果測試采用抑菌圈法。將瘡痂鏈霉菌制作成菌懸液，取100 μL涂布到Y(jié)ME固體平板上，取5 μL上述待測試菌株凍存液接種到涂有瘡痂鏈霉菌的YME平板上，28 ℃倒置靜止培養(yǎng)5 d，根據(jù)所產(chǎn)生的抑菌圈大小來判斷抑菌效果。

1.2.2目的菌株的鑒定。為了所獲得的生防菌株進(jìn)行分子鑒定，使用細(xì)菌16S rDNA 通用引物對該菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 6 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳測定濃度后，使用T載體試劑盒將PCR產(chǎn)物連接至T載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性克隆后送交生工生物測序。將該菌株的16S rDNA基因序列利用NCBI Blast數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3盆栽試驗法測定生防菌的防治效果。選取健康的馬鈴薯塊莖，表面用70%乙醇消毒，然后用清水沖洗干凈，放置在 28 ℃光照培養(yǎng)箱中催芽。待出芽后將馬鈴薯塊莖切成留有1個芽眼的三角塊，選取芽長相近的薯塊播至花盆（直徑25 cm）中，在溫室中培養(yǎng)，待薯苗長出后，選取長勢一致的植株進(jìn)行試驗。將瘡痂鏈霉菌制成 1×107 CFU/mL的菌懸液，采用灌根法接種，每盆加入10 mL，7 d后接入生防菌菌懸液（1×107 CFU/mL），CK為對照，不加生防菌；處理1為每盆10 mL生防菌，處理2為每盆20 mL生防菌。每個處理重復(fù)5次。待馬鈴薯收獲后進(jìn)行病害分級鑒定，并計算病情指數(shù)和防治效果。

2結(jié)果與分析

2.1目的菌株的獲得從馬鈴薯瘡痂病發(fā)病土壤中取樣，經(jīng)過稀釋涂板和二次劃線分離后，得到500余株單克隆菌株。進(jìn)而通過抑菌圈法檢測菌株對鏈霉菌的抑制效果，得到多株對鏈霉菌具有抑制效果的菌株。其中，編號為BU09號的菌株效果較好（圖1）。

2.2目的菌株的鑒定通過對該菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接至T載體，送交測序后，得到該菌株的16S rDNA序列，經(jīng)NCBI Blast比對，選取相似序列菌株通過Mega5軟件系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖2），發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與普城沙雷氏菌具有99%的同源性，因此確定該菌株為普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）。

2.3BU09菌株對瘡痂鏈霉菌的防治效果BU09菌株對瘡痂鏈霉菌的盆栽試驗結(jié)果顯示，對照處理中馬鈴薯瘡痂病發(fā)病較嚴(yán)重，每個塊莖表面均有多個病斑；處理1中馬鈴薯瘡痂病發(fā)病較輕，每個塊莖表面有1～2個病斑；處理2中馬鈴薯瘡痂病發(fā)病不明顯，塊莖表面未發(fā)現(xiàn)明顯病斑（圖3）。

3結(jié)論與討論

普城沙雷氏菌是革蘭氏陰性菌，1987年首次在植物病害的生物防治上得到應(yīng)用。近些年，在防治Verticllium dahliae、Sclerotinia sclerotiorum、Rhizoctonia solani、Botrytis cinerea、Phythium spp.等方面研究報道很多[13]。如Serratia plymuthica A21-4[14]是從洋蔥根際土壤中篩選出的1株對辣椒疫霉有強(qiáng)烈拮抗能力的菌，對辣椒疫霉菌的菌絲生長、游動孢子囊和游動孢子的形成、萌發(fā)有著強(qiáng)烈的抑制作用；Serratia plymuthica HRO-C48[15]是從油菜根際分離出的1株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和IAA的植物根際促生細(xì)菌，可抑制真菌生長，對黃瓜

猝倒病、番茄灰霉病具有防治效果。

普城沙雷氏菌BU09對馬鈴薯瘡痂病具有較明顯的防治效果，是首次關(guān)于普城沙雷氏菌對鏈霉菌具有防治效果的研究報道。此外，經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)BU09的主要抑菌成分存在于培養(yǎng)液上清中，且為脂溶性化合物。因此，該菌抑菌成分的鑒定需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。該研究分離得到的BU09不僅在培養(yǎng)基上對瘡痂鏈霉菌具有抑制效果，還可以在土壤種植試驗中起到明顯的抑菌效果，可以進(jìn)一步開發(fā)為生防菌制劑，為馬鈴薯瘡痂病的防治提供參考。

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