王金鵬 楊曉瑩 于立強 靖美東

摘要[目的]研究小家鼠3個群體間Sry基因序列。[方法]對來自臨沂、漠河、云夢的33只雄性小家鼠個體進行基因組DNA提取，設計引物，對其Sry基因進行擴增和序列測定，并使用分子處理軟件定義單倍型，分析堿基組成，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。[結果]33個樣品全部測序成功，經過數據分析后得到以下結果：33個樣品的Sry基因片段大小均在856 bp左右。對33個序列對比分析，共定義了7個單倍型，Sry基因堿基的平均含量分別為A 27.5%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，不同個體之間堿基無明顯差異，遺傳距離小。以大家鼠（KC215142）為外群，小家鼠（AF068054）為參照序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，7個單倍型與小家鼠共處同一分支。[結論]南北群體的小家鼠Sry基因無明顯差異，基因突變率極低，具有極強的保守性。

關鍵詞小家鼠；Sry基因；序列分析

中圖分類號Q953文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）11-0114-03

Abstract[Objective]To study the sequence of Sry gene of Mus musculus from three groups. [Method]We extracted the whole DNA genome of 33 mice came from Linyi， Mohe， Yunmeng Region，then used the primer to amplify the Sry genes and determined DNA sequence of the 33 mice individually. To define haplotype， analyze base composition， construct phylogenetic tree by using a series of molecular processing software. [Result]The sequence of the 33 mices DNA genome was conducted successfully， the lengths of DNA genome of 33 mice were all about 856 bp. 7 haplotypes were defined by the comparative analysis of 33 sequences. The average content of the four bases（ATGC） was measured respectively： A 27.5%，T 30.7%， G 22.5%， C 19.3%. There was no significant difference between the individual mouse， and the genetic distance was small. Using Rattus norvegicus（KC215142） as outgroup and M.m. musculus （AF068054） as reference sequence to construct phylogenetic tree，7 haplotypes and Mus musculus were in the same branch.[Conclusion] There is no significant difference between the north and south of the Mus musculus Sry gene， Sry gene mutation rate is very low， with a strong conservation.

Key wordsMus musculus；Sry gene；Sequence analysis

小家鼠（Mus musculus）屬嚙齒目（Rodentia）鼠科（Muridae）小家鼠屬（Mus）[1]，是一類體型較小、夜出活動、世界性分布的家棲哺乳鼠類。小家鼠為鼠科中的小型鼠，一般體長為60～90 cm，身體較輕，尾與身體長度相當或略短于體長，頭較小且吻短，耳圓形，毛色因季節(jié)和所處環(huán)境不同而有所差異，體被呈棕灰色或暗黑色或黑褐色[2-3]。隨著分子生物學、遺傳學等學科和技術的發(fā)展，通過線粒體DNA研究表明，小家鼠包括3個亞種，它們分別是：M.m.domesticus，分布在西歐、中東和北非地區(qū)；M.m.musculus，分布在東歐和東北亞地區(qū)；M.m.castaneus，分布在東南亞和印度次大陸[4]。小家鼠為現實驗室品系小鼠的祖先，作為重要的模式物種[3]，被廣泛利用在遺傳、醫(yī)學、分子研究等方面，其主要有以下優(yōu)勢：①它是當前重要的模式物種，現在實驗用小鼠的全基因組序列已經完成，可以被廣泛應用于生物學、醫(yī)學等多個領域的研究；②其與人類密切的聯系，使其廣泛存在于各大洲，具有世界性、伴生性等特點，人類疾病往往可在它身上發(fā)現，同時它的遺傳分化模式能夠反映人類活動對其擴散的影響，因此能夠通過小家鼠的起源與擴散去探討人類的起源與擴散；③小家鼠遍布于世界各地，可以利用分子系統(tǒng)地理學的理論與方法研究其起源與擴散，從而重現歷史上發(fā)生過的地理事件和氣候的變遷[5-7]。

Y染色體（Y chromosome）是決定生物個體性別的一種性染色體。在雄性是異質型的性決定生物中，雄性所具有的而雌性所沒有的那條性染色體叫Y染色體[8]。Y染色體多態(tài)性作為雄性小鼠的特有遺傳標記，在探討人類的遷徙方面具有重要價值。目前利用Y染色體研究我國人群的遷徙已經取得了許多重要的成果，并且已有研究證明Y染色體是研究小家鼠種群遺傳學的有效分子標記[9-10]。

Y染色體上Sry基因（Sexdetermining region of the Y chromosome）對哺乳動物性別的決定起關鍵作用。眾多研究表明，Sry基因突變引起人或其他哺乳動物性腺發(fā)育受阻。將小鼠Sry基因導入XX 雌性小鼠受精卵，可使其向雄性化轉變，包括支持細胞的分化、遷移，并發(fā)育形成睪丸，這說明Sry基因是性別決定的核心基因，直接誘導精巢發(fā)育，對睪丸發(fā)育起著關鍵性的作用，Sry能夠觸發(fā)睪丸的發(fā)生，決定雄性性狀[11-12]。筆者采集了臨沂、漠河、云夢的33只雄性小家鼠個體進行試驗，測得33個樣品的Sry基因，并對樣品個體定義單倍型，將其與GenBank中下載的褐家鼠（Rattus norvegicus，KC215142），M.m.musculus（AF068054）的片段進行對比分析，通過單倍型構建系統(tǒng)發(fā)育樹來探究Sry基因的遺傳意義，從而進一步探究我國小家鼠亞種的分類情況，為相關研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料33個小家鼠個體來自臨沂（LY3、LY6、LY7、LY8、LY9、LY10、LY11、LY12、LY23、LY33、LY41、LY43、LY45、LY48），漠河（MH37、MH43、MH44、MH46、MH47、MH48、MH49、MH50、MH51、MH56、MH62），云夢（YM6、YM39、YM53、YM56、YM59、YM69、YM72、YM78）3個群體，取其尾巴肌肉組織，用100%乙醇浸泡，保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法用Promega試劑盒方法提取低溫保存的小鼠尾部肌肉組織的基因組DNA，并進行電泳測純。設計引物，對樣品Sry基因進行擴增，擴增長度約為1 kb，使用擴增酶（Premix酶）進行PCR擴增，擴增結束后用凝膠電泳進行檢測，檢測是否擴增出基因序列，并送至上海生工生物工程服務有限公司進行基因測序。

將生工測序的DNA序列使用DNAstar軟件中的Editseq和Seqman軟件進行剪切處理，使用DAMBE軟件定義了7個單倍型，與從GenBank中下載的M.m.musculus（AF068054）、Rattus norvegicus（KC215142）的片段進行對比分析，使用軟件Mega 6.0進行比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結果與分析

2.1小家鼠基因組DNA提取結果提取33個樣品基因組DNA，各取1 μL，進行電泳和凝膠成像系統(tǒng)觀察可知，33個樣品基因組大小在20 000 bp以上，凝膠電泳結果顯示，條帶整齊明亮，樣品有少許降解，在試驗允許范圍之內。

2.2小家鼠基因組DNA擴增 將樣品基因組DNA進行PCR擴增后，取5 μL的擴增產物，進行瓊脂糖凝膠電泳，圖1為部分電泳結果圖。從圖1可以看出，9個樣品電泳結果較好，條帶明亮且清晰，提純結果較好，擴增比較成功。

2.3單倍型組成使用軟件DAMBE定義3個群體33個樣品的單倍型，共定義了7個單倍型，Y1：LY7；Y2：LY10、MH37、MH43、MH44、MH46、MH47、MH48、MH49、MH50、MH51、MH56；Y3：MH62；Y4：YM53；Y5：LY11、LY12、LY23、LY3、LY33、LY41、LY43、LY45、LY48、LY6、LY8、LY9、YM39、YM56、YM59、YM6、YM69；Y6：YM72；Y7：YM78。

2.4單倍型的堿基含量組成使用Mega 6.0對單倍型中的序列進行堿基含量分析，結果表明Sry基因中A、T、G、C的平均含量分別為A 27.5%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，樣品間堿基組成幾乎無差別（表1）。

2.5遺傳距離將7個單倍型Sry基因序列與小家鼠和大家鼠的Sry序列進行比較，用Mega 6.0制作7個單倍型的遺傳距離（表2）。由表2可知，7個單倍型的遺傳距離十分小，

說明7個樣本的序列非常近，該基因突變幾率很低。根據以往研究可知，小家鼠的線粒體基因遺傳分為南北兩大分支，此次試驗中所用到的樣品為漠河、臨沂、云夢3個群體，在遺傳距離上未體現出南北差異，說明南北群體小家鼠的Sry基因無明顯差異，小家鼠與大家鼠之間存在較小的遺傳距離。

2.6系統(tǒng)發(fā)育樹由圖2可知，以大家鼠（KC215142）為外群，小家鼠（AF068054）為參照序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，7個單倍型樣本構建的系統(tǒng)進化樹分為2個大的分支，其中7個單倍型與M.m.musculus（AF068054）共處同一分支，與Rattus norvegicus（KC215142）不在同一分支上，存在較小差異，這也與遺傳距離所得信息一致。

3結論與討論

小家鼠是一種與人類伴生的共棲物種，作為模式物種，被廣泛利用于醫(yī)學和生物學等領域。該試驗采用新鮮冷凍肌肉組織為材料提取DNA，用特異性引物對Sry基因進行擴增，擴增結果經過電泳、測序等操作后，得到33個樣品小家鼠Sry基因序列信息。經過數據分析后得到以下結果：樣本Sry序列大小均在856 bp左右。對33個序列對比分析，共定義了7個單倍型，Sry基因堿基的平均含量分別為A 275%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，這些樣品之間的堿基差別極小，序列無明顯差異。以大家鼠（KC215142）為外群，以小家鼠（AF068054）為參照序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，7個單倍型與小家鼠共處同一分支，說明南北群體的小家鼠Sry基因無明顯差異，基因突變率極低，具有極強的保守性。以上結果顯示，Sry基因遺傳較為保守，但由于所用樣品數量有限，為獲得更詳盡的試驗結果和數據，應進一步擴大采樣的數量和范圍，以更深入地研究其遺傳特點。

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