劉玲 陳仁芳 陳祥平 范小敏 柯皓天 呂銀 杜國(guó)良

摘要[目的]基于ITS序列初步探討我國(guó)?？浦参锏姆肿酉到y(tǒng)學(xué)。[方法]測(cè)定33份?？撇牧系腎TS序列，通過(guò)最大簡(jiǎn)約法分析它們的分子系統(tǒng)學(xué)，并將分析結(jié)果與經(jīng)典分類做比較。[結(jié)果]在原始類群和單系類群的確定上與經(jīng)典分類基本一致；“刺桑、葉被木、圓葉刺桑與桑屬的親緣關(guān)系近”這一結(jié)果與經(jīng)典分類不一致。[結(jié)論]該研究為我國(guó)?？浦参锏南到y(tǒng)學(xué)分析積累了分子生物學(xué)資料。

關(guān)鍵詞?？浦参?；ITS序列；分子系統(tǒng)學(xué)

中圖分類號(hào)S888文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）12-0126-04

Abstract[Objective] To analyze molecular phylogeny of Moraceae in China based on ITS. [Method] The ITS sequences of 33 individuals were determined， and the molecular phylogeny was alalyzed by maximum parsimonious.Then we compared the results of the analysis with the classical classification. [Result] The determination of primitive and monophyletic groups is basically consistent with the classical classification. The result showed that Taxotrophis ilicifolius， Streblus taxoides， Taxotrophis aquifolioides were close to Morus Linn. is not consistent with the classical classification. [Conclusion] This research had accumulated molecular biology data for the classification of Moraceae in China.

Key wordsMoraceae；ITS sequence；Molecular phylogeny

?？浦参锏姆诸愖钤缈勺匪莸?753年林奈的《植物種志》[1]，隨后Moretti等[2]、Seringe等[3]、Bureau等[4]、Koidzumi等[5]都對(duì)?？浦参锏姆诸愡M(jìn)行了研究。我國(guó)植物分類學(xué)家陳嶸在《中國(guó)樹木分類學(xué)》中將我國(guó)?？浦参锓譃?屬[6]。胡先骕[7]在《植物分類學(xué)簡(jiǎn)編》中將?？浦参锓譃?亞科?！吨袊?guó)植物志》采用Engler（1936年）系統(tǒng)將桑科植物分為3亞科12屬[8]。 2002年吳征鎰等[9]提出被子植物的一個(gè)“多系-多期-多域”新分類系統(tǒng)，以此為依據(jù)在《中國(guó)被子植物科屬綜論》中將?？浦参锓譃?族12屬，并將大麻亞科提升為大麻科。張宏達(dá)[10]在《種子植物系統(tǒng)學(xué)》中將桑科植物分為2亞科8屬，同樣將大麻亞科提升為大麻科。

目前，關(guān)于桑科的分子系統(tǒng)學(xué)研究?jī)H見(jiàn)Zerega等[11]利用26S rDNA和葉綠體ndhF基因序列研究了美洲?？浦参锏姆肿酉到y(tǒng)發(fā)育。而我國(guó)?？浦参锏姆肿酉到y(tǒng)學(xué)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

高等植物核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）位于18S、5.8S和26S基因之間，由于不加入成熟的核糖體，受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度較快，在被子植物中相對(duì)長(zhǎng)度具有保守性，適用于屬間、種間的系統(tǒng)發(fā)育分析[12-14]。該研究收集我國(guó)33份?？撇牧?，以北美蟻棲樹屬蟻棲樹（Cecropia peltala Linn.）為外類群，測(cè)定它們的ITS序列，用最大簡(jiǎn)約法分析我國(guó)?？浦参锏南到y(tǒng)發(fā)育關(guān)系，初步分析我國(guó)?？浦参锏姆肿酉到y(tǒng)學(xué)，為我國(guó)?？浦参锓诸惙e累分子生物學(xué)資料。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料取自海南、廣西、云南、貴州、重慶、四川、新疆等地（表1），采集各樣品葉片，材料經(jīng)鑒定核實(shí)無(wú)誤后采回。

1.2方法

1.2.1DNA提取與質(zhì)量測(cè)定。

DNA提取采用稍加改進(jìn)的CTAB法[15]，從約0.15 g硅膠干燥的嫩葉中提取，DNA的質(zhì)量和濃度用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，電泳時(shí)用λDNA作Marker；電泳完成后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.2PCR擴(kuò)增與測(cè)序。

PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括DNA模板（10 ng/μL）1 μL，10×PCR Buffer 2 μL，Mg2+（2.5 mmol/L）1.6 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6 μL，正反向引物（50 ng/μL）各1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.15 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后10 ℃保存。擴(kuò)增引物ITS5：5′—GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG—3′，ITS4：5′—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3′[16]，測(cè)序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果用Sequencher4.1.4軟件拼接，對(duì)少數(shù)誤判堿基根據(jù)堿基峰形進(jìn)行更正。利用ClustalX 1.83c軟件[17]進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)GenBank公布的菩提樹（Ficus religiosa，AY063582）18S rRNA基因3′端堿基序列attgtcga，5.8S基因的5′端堿基序列aagaacg，3′端堿基序列acacgcc，26S rRNA基因5′端堿基序列aacgcgaac，確定34份材料的ITS及ITS1、5.8S、ITS2的序列范圍。用Bioedit軟件除去非ITS序列。用DNAstar軟件分析ITS序列長(zhǎng)度、GC含量。用PAUP Ver.4.0b10軟件[18]基于最大簡(jiǎn)約法分析進(jìn)化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1ITS序列長(zhǎng)度、GC含量由表2可知，34份材料的ITS長(zhǎng)度在574～651 bp，GC含量在54.22%～66.03%；ITS1長(zhǎng)度在223～283 bp，GC含量在52.73%～69.75%；5.8S長(zhǎng)度在124～169 bp，GC含量在52.23%～58.06%；ITS2長(zhǎng)度在204～236 bp，GC含量在53.71%～70.51%。

2.2基于ITS的進(jìn)化關(guān)系

用PAUP Ver.4.0b10軟件最大簡(jiǎn)約法分析供試材料間的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹參數(shù)如下：樹長(zhǎng)（Tree length）為2 060，一致性指數(shù)（Consistency index，CI）為0.552 4，保持性指數(shù)（Retention index，RI）為0.656 9，調(diào)整后的一致性指數(shù)（Rescaled consistency index，RC）為0.362 9。序列比對(duì)共693個(gè)位點(diǎn)，其中74個(gè)不變位點(diǎn)，189個(gè)變異非信息位點(diǎn)，430個(gè)信息位點(diǎn)。

分支圖首先將外類群蟻棲樹分出，接著分出的是葎草，自檢支持率Bootstrap為100%，后面依次是藤構(gòu)、楮、構(gòu)樹、牛筋藤。剩余材料分為兩大支，Branch 1和Branch 2。Branch 1包括榕屬，見(jiàn)血封喉，鵲腎樹，自檢支持率Bootstrap為54%。Branch 2首先將假鵲腎樹分出，接著分出的是細(xì)齒水蛇麻、葨芝、柘樹，自檢支持率Bootstrap為73%。波羅蜜屬和桑屬分別聚為1支，支持率為100%。圓葉刺桑、刺桑、葉被木聚為1支，自檢支持率Bootstrap為97%，并且它們與桑屬聚在一大支，支持率為100%。

3結(jié)論與討論

（1）構(gòu)屬和牛筋藤屬是原始類群。

分支圖緊接外類群分出的是構(gòu)屬的藤構(gòu)、楮、構(gòu)樹和牛筋藤屬的牛筋藤。根據(jù)外類群確定法，認(rèn)為構(gòu)屬和牛筋藤屬為原始類群。

《中國(guó)植物志》將?？品譃?亞科、7族、12屬，桑亞科是第1亞科，認(rèn)為該亞科是原始類群。構(gòu)屬和牛筋藤屬分別是桑亞科的族3構(gòu)樹族的第3、4屬，族1、族2分別是水蛇麻族和桑族，它們比族3更原始；《中國(guó)被子植物科屬綜論》中，桑族是?？频牡?族，屬于原始類群，桑屬、構(gòu)屬、牛筋藤屬是其前3屬。因此，在原始類群的確定上該研究與經(jīng)典分類基本一致。

（2）榕屬、波羅蜜屬、桑屬為單系類群，鵲腎樹屬為非單系類群。

分支圖將榕屬、波羅蜜屬、桑屬分在一個(gè)分支，認(rèn)為這3個(gè)屬是單系類群；與2種經(jīng)典分類一致。

鵲腎樹屬的鵲腎樹、假鵲腎樹、葉被木、刺桑、圓葉刺桑分在不同分支，認(rèn)為鵲腎樹屬為非單系類群。2種經(jīng)典分類都將鵲腎樹屬分為5組。組1.鵲腎樹組（Sect.Streblus），2種：鵲腎樹、米揚(yáng)噎（Streblus tonkinensis）；組2.葉被木組（Sect.Phyllochlamys），1種：葉被木；組3.假鵲腎樹組（Sect.Pseudostreblus），1種：假鵲腎樹；組4.尾葉刺桑組（Sect.Taxotrophis），我國(guó)1種，尾葉刺桑（Streblus zeylanicus）；組5.刺桑組（Sect.Pseudotrophis），我國(guó)2種，雙果桑（Streblusmacrophyllus）、刺桑?！逗Ｄ现参镏尽穼⒓蠃o腎樹命名為Pseudostreblus indicus，將葉被木命名為Phyllochlamys taxoides，將刺桑命名為Taxotrophis ilicifolius[17]，從這些同種異名也可以看出鵲腎樹屬為非單系類群。

因此，基于ITS的研究結(jié)果對(duì)單系類群的確定與經(jīng)典分類一致。

（3）見(jiàn)血封喉與榕屬的親緣關(guān)系近，細(xì)齒水蛇麻與柘屬的親緣關(guān)系近，刺桑、葉被木、圓葉刺桑與桑屬的親緣關(guān)系近。

分支圖中，見(jiàn)血封喉與榕屬聚在一支，說(shuō)明它們的親緣關(guān)系近。在《中國(guó)植物志》中，見(jiàn)血封喉族和榕族分別是族6和族7。在《中國(guó)被子植物科屬綜論》中，見(jiàn)血封喉族和榕族分別位于族3和族4。因此，2種經(jīng)典分類都支持這一結(jié)果。

分支圖將細(xì)齒水蛇麻與柘屬分在一個(gè)分支上，表示它們的親緣關(guān)系近。在《中國(guó)植物志》中，細(xì)齒水蛇麻屬于族1水蛇麻族，柘屬處在族5波羅蜜族，認(rèn)為它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；而在《中國(guó)被子植物科屬綜論》中，柘屬和細(xì)齒水蛇麻分別屬于桑族的第5、7屬，系統(tǒng)位置較近。因此，該結(jié)果支持吳征鎰等的觀點(diǎn)。

2種經(jīng)典分類都認(rèn)為桑屬是原始類群，刺桑、圓葉刺桑和葉被木都屬于族4.鵲腎樹族鵲腎樹屬。桑屬和鵲腎樹屬雖然都在桑亞科或者桑族，但它們的系統(tǒng)位置有一定距離。因此，2種經(jīng)典分類都不支持刺桑、葉被木、圓葉刺桑與桑屬的親緣關(guān)系近。

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