濮黎萍　候振　徐壯壯　陳富美　王煥景　黃鳳玲　張明

摘要：【目的】克隆水牛波形蛋白（VIM）基因，并明確VIM因在水牛成熟卵母細胞（MII期）和早期胚胎（2-細胞階段）中的表達情況，為研究VIM在卵母細胞成熟及附植前胚胎發(fā)育中的作用機理打下基礎。【方法】根據(jù)GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列設計引物，采用RT-PCR克隆水牛VIM因，利用在線軟件程序對克隆獲得的水牛VIM基因進行生物信息學分析，同時以細胞免疫熒光試驗檢測VIM在水牛成熟卵母細胞（MII期）及早期胚胎（2-細胞階段）中的表達情況?！窘Y果】水牛VIM基因長度為1469 bp，其編碼區(qū)長度1401 bp，編碼466個氨基酸。水牛VIM基因序列與人類、黑猩猩、食蟹猴、家犬、馬和牛的VIM基因序列具有高度的同源性，分別為93%、93%、93%、94%、94%和99%；基于VIM基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也顯示水牛與牛的親緣關系最近。水牛VIM的分子量為53.73 kD，理論等電點（pI）5.05，主要在線粒體中表達，穩(wěn)定性差（不穩(wěn)定系數(shù)53.65），具有較強的親水性，無跨膜結構，不屬于分泌型蛋白，其蛋白結構以α-螺旋為主。VIM在水牛成熟卵母細胞（MII期）及早期胚胎（2-細胞階段）中均有表達，且在成熟卵母細胞中的表達量明顯高于早期胚胎?！窘Y論】水牛VIM基因編碼序列具有較高的保守性，且在水牛成熟卵母細胞（MII期）中的表達量明顯高于早期胚胎（2-細胞階段）。

關鍵詞：水牛；波形蛋白（VIM）；基因克?。簧镄畔W分析；表達分析

中圖分類號：S823.83 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2266-07

0引言

【研究意義】波形蛋白（Vimentin，VIM）與結蛋白、角蛋白組成中間纖維，而中間纖維又與微管、微絲共同構成細胞骨架。VIM主要存在于中胚層來源的細胞中（Coulombe and Wong，2004），由非螺旋的氨基端頭部、螺旋桿狀區(qū)及非螺旋的羧基端尾部組成（Fuchs and Weber，1994），其主要功能包括維持細胞完整性、參與調節(jié)基因組DNA表達（Tolstonog et al.，2001；Corbi et al.，2010）、參與細胞信號轉導（Perlson et a1.，2005；Li et al.，2006）、影響細胞遷移和黏附（Singh et al.，2003；Zhao et al.，2010）及參與調控細胞凋亡（Byun et al.，2001；Yang et al.，2005；Ise et al.，2012）等。因此，深入研究水牛VIM基因對揭示其在水牛卵母細胞成熟及附植前胚胎發(fā)育中的作用機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，針對人類VIM基因的研究較多，編碼人類VIM的基因位于染色體10p13上，編碼區(qū)全長1848 bp，編碼464個氨基酸，所翻譯蛋白質的相對分子量約57.00 kD，其在進化過程中高度保守（Ivaska et al.，2007）。Tol-stonog等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，VIM可與衛(wèi)星DNA、線粒體DNANt端粒DNA等DNA結構相互作用；Moisan和Girard（2006）研究表明，VIM基因在人類自發(fā)凋亡的中性粒細胞表面表達，進一步佐證VIM與細胞凋亡相關；BhaRacharya等（2009）研究證實，在內皮細胞中VIM與黏附斑的形成有關；Kim等（2010）發(fā)現(xiàn)VIM對HEK-293和3T3細胞在膠原中的延伸及遷移起重要作用；Liu等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧情況下VIM可通過激活PAKl信號通路促使自身磷酸化并發(fā)生重排，從而增加細胞的穩(wěn)定性；Ise等（2012）研究表明，VIM以受體形式與凋亡細胞中的配體結合，從而致使凋亡細胞被包裹及清除；奈日樂（2015）研究發(fā)現(xiàn)，VIM通過影響內蒙古絨山羊毛囊外根鞘而參與皮膚毛囊周期性生長的調節(jié)；邵曉婷等（2017）研究證實，VIM可促進PCI2細胞的神經分化?！颈狙芯壳腥朦c】水牛具有耐粗飼、易飼養(yǎng)等優(yōu)點，但其繁殖性能較差。VIM在組織細胞中不僅作為重要的骨架蛋白，還能通過不同方式調控多項細胞功能，但至今未見有關水牛VIM的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】克隆水牛VIM基因并對其基因序列進行生物信息學分析，同時檢測VIM在水牛成熟卵母細胞（MII期）及早期胚胎（2-細胞階段）中的表達情況，旨在為研究VIM在卵母細胞成熟及附植前胚胎發(fā)育中的作用機理打下基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

水牛卵巢采自廣西南寧市肉聯(lián)食品加工廠。TRIzol購自Invitrogen公司，PrimeScript^TMRT reagentKit with gDNA Eraser、pMDl8-T載體、Cloning Kit、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞、膠回收試劑盒等購自TaKaRa公司，其他生化試劑均為進口分析純。

1.2引物設計與合成

根據(jù)GenBank）2已公布的水牛VIM基因mRNA序列（XM 006052364.1），通過Primer 5.0設計一對引物（5-CAGTCCACCGCCACCCTCTGCAG-3′和5′-CTTCTTGCTGGTAGTATTTTGCTG-3′），引物由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3總RNA提取

采用TRizol法提取水牛卵巢組織總RNA，利用紫外分光光度計檢測總RNA含量及其完整性。同時去除基因組DNA，反應體系10.0μL，即2.0μL5×gDNA Eraser Buffer，1.0μLgDNA Eraser，1.0μg總RNA，6.0μLRNase Free dH20。反應條件為42℃2 min。

1.4反轉錄合成cDNA

反應體系20.0μL：10.0μL去除基因組DNA的RNA模板，1.0μL PrimeScript^RTEnzyme Mix I，4.0μL RT Primer Mix，4.0μL 5×PrimeScript Buffer 2，1.0μL RNase Free dH₂O。反轉錄程序：37℃15 min，85℃5 s。

1.5 PCR擴增

反應體系20.0μL：2×Taq PCR Master Mix 10.0μL，上、下游引物各0.5μL，eDNA 2.0μL，ddH₂O 7.0μL。擴增程序：98℃預變性3 min；98℃5 s，58℃15 s，72℃20 s，進行34個循環(huán)；最后72℃延伸20～30 min。

1.6 PCR產物連接及測序

采用膠回收試劑盒對瓊脂糖凝膠電泳分離獲得的目的片段進行回收和純化，然后將目的片段克隆至pMD18-T載體，并轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，將菌液涂布于含Amp+的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h后挑取單克隆菌落，并接種至含Amp+的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經PCR檢測，陽性菌液送至深圳華大基因科技有限公司進行測序。

1.7生物信息學分析

使用在線軟件程序對克隆獲得的水牛VIM基因序列進行同源性比對及構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并預測其編碼蛋白的結構、信號肽、蛋白定位、親/疏水性及其功能結構域。

1.8表達分析

水牛成熟卵母細胞（MII期）及早期胚胎（2-細胞階段）的獲得分別參照王彩玲等（2015）、李敏玲等（2016）的方法。采用細胞免疫熒光試驗檢測VIM在水牛成熟卵母細胞（MII期）及早期胚胎（2-細胞階段）中的表達情況，將MII期的卵母細胞及2-細胞期的早期胚胎在PBS中清洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，以含1%Triton X-100的PBS透膜20 min，PBS清洗3遍后用含1%BSA的PBS封閉1 h；加入一抗（含1%BSA的PBS，1：200）后4℃下孵育過夜，PBS清洗3遍，每次2 min；加入二抗（含1%BSA的PBS，1：500）并室溫孵育1 h，PBS清洗3遍，每次2 min；使用抗熒光淬滅劑（含DAPI）封片，熒光顯微鏡下檢測拍照。

2結果與分析

2.1水牛VIM基因的克隆、鑒定及測序結果

將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發(fā)現(xiàn)在1500 bp附近處出現(xiàn)清晰的目的條帶（圖1），與預期結果相符。菌液PCR鑒定也得到相應的目的條帶，可初步判定為陽性克隆菌液。測序結果表明，克隆獲得的目的片段（水牛VIM基因）長度為1469 bp，其中編碼區(qū)長1401 bp，將其提交Gen-Bank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MF459044。

2.2同源性比對分析結果

將克隆獲得的水牛VIM基因序列與其他物種的VIM基因序列進行BLAST比對分析，結果發(fā)現(xiàn)該基因序列與人類（NM 003380.3）、黑猩猩（NM001009148.2）、食蟹猴（NM 001284705.1）、家犬（NM001287023.1）、馬（NM 001243145.1）和牛（NM 173969.3）的VIM基因序列具有很高的同源性，分別為93%、93%、93%、94%、94%和99%。對VIM基因的推導氨基酸序列進行對比分析，結果發(fā)現(xiàn)其同源性更高，與牛的同源性100%，人類的98%、家犬的98%、黑猩猩的97%、食蟹猴的97%、馬的97%，說明VIM在物種進化過程中具有高度的保守性。

2.3系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果

利用MEGA 7.0構建水牛VIM基因序列與NCBI已公布的牛、野雞（NM 001048076.2）、家犬、大鼠（NM 031140.1）、人類、小鼠（NM 011701.4）、安大略鮭（NM 001124729.1）、馬及虹鱒魚（NM 001124729.1）等物種VIM基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2），結果發(fā)現(xiàn)水牛與牛的親緣關系最近，其次是馬和家犬，而與安大略鮭和虹鱒魚的親緣關系較遠。

2.4生物信息學分析結果

2.4.1基本理化性質利用NCBI的ORF finder將克隆得到的水牛VIM基因序列翻譯成相應的氨基酸序列，結果發(fā)現(xiàn)其編碼466個氨基酸（圖3）。利用Ex-PASy ProtParam程序預測得到水牛VIM的分子量為53.73 kD，分子式為C₂₂₉₈H₃₇₃₆N₆₈₆O₇₇₃S₁₂，理論等電點（pI）5.05，負電荷[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]氨基酸84個，正電荷[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]氨基酸65個，其中以高氨酸（Leu）、Glu和絲氨酸（ser）含量較高，分別為11.8%、11.6%和8.6%。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)53.65，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.4.2亞細胞定位、跨膜性、信號肽和親/疏水性以PSORTⅡ程序預測水牛VIM的亞細胞定位情況，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位于線粒體（82.6%）、細胞核（8.7%）和細胞質（8.7%）；利用TMHMM 2.0預測分析蛋白跨膜結構，發(fā)現(xiàn)水牛VIM無跨膜結構，不屬于跨膜蛋白（圖4）；采用Signal P4.1 Server預測水牛VIM信號肽，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在信號肽，不屬于分泌型蛋白（圖5）；利用ExPASy ProtScale預測其親/疏水性，結果發(fā)現(xiàn)該蛋白具有較強的親水性，圖6中紅色框內為親水區(qū)域。

2.4.3蛋白結構 采用DNAStar Protean對水牛VIM二級結構進行預測，結果發(fā)現(xiàn)該蛋白的二級結構含有16個α-螺旋、8個β-折疊、21個T-轉角和23個無規(guī)卷曲，以α-螺旋為主（圖7）。同時利用SWISS-MODEL進行同源建模預測水牛VIM三級結構，發(fā)現(xiàn)也是以α-螺旋為主（圖8），與其二級結構預測結果一致。

2.4.4 VIM在水牛成熟卵母細胞及早期胚胎中的表達情況采用細胞免疫熒光試驗檢測VIM在水牛成熟卵母細胞（MII期）及早期胚胎（2-細胞階段）中的表達情況，結果表明，水牛VIM在成熟卵母細胞及早期胚胎中均有表達（圖9），且在成熟卵母細胞中的表達量明顯高于早期胚胎。

3討論

目前，有關VIM與疾病相關性的研究較多，并已證實VIM甲基化水平可作為結腸癌（Shirahata et al.，2009）、膀胱癌及腺癌（Costa et al.，2010）、食管及胃癌（Moinova et al.，2012）、宮頸癌（Jung et al.，2011）等癌癥的早期診斷指標。Zhao等（2010）還研究發(fā)現(xiàn)，VIM與癌細胞的侵襲及轉移能力有關，且其表達在分化程度低的癌細胞中明顯增加。本研究克隆獲得水牛VIM基因，其編碼區(qū)長1401 bp，編碼466個氨基酸，同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果均表明，水牛刪基因與牛VIM基因的同源性最高，其次是馬和家犬，說明VIM在物種進化過程中具有高度的保守性。在線生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子量為53.73 kD，理論等電點（pI）5.05，主要在線粒體中表達，穩(wěn)定性差（不穩(wěn)定系數(shù)53.65），具有較強的親水性，無跨膜結構，不屬于分泌型蛋白，其蛋白結構以α-螺旋為主。

此外，也有關于VIM在細胞其他功能方面的研究報道。Byun等（2001）研究發(fā)現(xiàn)VIM的裂解產物可使細胞凋亡加速；Perlson等（2006）研究表明，VIM作為分子伴侶去保護pErk不會被降解，而有利于pErk在細胞中進行信息傳遞；Kueper等（2007）研究發(fā)現(xiàn)抑制VIM的修飾與改變可使組織內源性老化推遲；Corbi等（2010）研究證實，VIM可通過與eEFlγ結合再與RNA polⅡ形成復合體以調控VIM基因的表達。本研究首次研究VIM在水牛卵母細胞附植前胚胎中的表達情況，結果表明，VIM在水牛成熟卵母細胞（MII期）及早期胚胎（2-細胞階段）中均有表達，且在成熟卵母細胞中的表達量明顯高于早期胚胎，但具體原因有待進一步探究。

4結論

水牛VIM基因編碼序列具有較高的保守性，且在水牛成熟卵母細胞（MII期）中的表達量明顯高于早期胚胎（2-細胞階段）。