周靜煌　嚴準　高春生　余永廷　李智敏　曾糧斌　陳佳　郭利桃　嚴理　程毅

摘要：許多植物病原菌致病機制依賴于病原微生物群體感應系統(tǒng)的調(diào)控，基于群體感應抑制的原理篩選高效的群體感應抑制劑有望成為解決植物病害防治問題的有效途徑。文章介紹了群體感應抑制的研究策略，主要包括阻斷群體感應信號分子的產(chǎn)生、促進信號分子降解及抑制信號分子與受體結(jié)合；綜述了近年來主要的群體抑制劑種類及其在植物病害防治上的應用情況，指出群體感應抑制劑并不妨礙病原菌的正常生長代謝，而是抑制群體感應系統(tǒng)，減弱病原菌的毒力，降低其致病性。提出今后應加強群體感應抑制劑篩選和基于群體感應系統(tǒng)淬滅機制的植物病害防治研究，為植物病害防治提供綠色安全的防控措施。

關(guān)鍵詞：植物病害防治；群體感應；信號分子；群體感應抑制劑

中圖分類號：S432 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2197-07

0引言

植物病害防治一直備受關(guān)注，一些新的防治方法也不斷出現(xiàn)，目前最主要的防治方法包括植物進出口檢疫、抗病品種培育、農(nóng)業(yè)栽培控制、化學藥劑防治、生物防治和生防機理治療等。生產(chǎn)上最常用的方法是化學防治，該法強調(diào)徹底滅殺病原物，然而，由于化學藥劑的長期大量使用，導致很多病原菌產(chǎn)生了耐藥性（Roy et al.，2011），對今后的植物病害防治是巨大挑戰(zhàn)，因此，研究更安全的病害防治策略尤為必要。許多植物病原菌致病性的形成受到群體感應（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)的影響，致病菌定殖到宿主體內(nèi)后，在Qs機制調(diào)控下激活與致病相關(guān)基因的表達而產(chǎn)生各種毒力因子，導致宿主發(fā)?。ǔ坦旁碌龋?012）。此外，由于QS調(diào)節(jié)，病原菌侵染宿主后能形成生物被膜抵抗宿主的免疫，并產(chǎn)生對藥劑的抗性。因此，微生物QS系統(tǒng)的調(diào)控通路有望成為病害防治的新靶點（韋柯，2007）。

Fuqua等（1994）發(fā)現(xiàn)許多微生物的生理生化特征會隨著群體密度增加而發(fā)生改變，能夠分泌毒素、形成生物膜、產(chǎn)生抗生素、生成孢子、發(fā)射熒光等，以適應環(huán)境的變化，是微生物QS系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)（程古月等，2012）。在特定環(huán)境下，微生物產(chǎn)生并向環(huán)境中釋放一種被稱為自體誘導物（Auto-inducer，AI）的細胞外信號分子，隨著個體密度的增大，信號分子也會成比例增加，當信號分子積累到一定濃度時，會誘導微生物產(chǎn)生獨特的、多樣的群體行為，這一現(xiàn)象稱為QS（韋柯，2007）。微生物Qs所分泌的信號分子有3種，故將OS系統(tǒng)分為3類（圖1）：（a）革蘭氏陰性菌的酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-acvl-homoserine lac-tones，AHLs）型系統(tǒng)。LuxI是可催化合成AI的胞內(nèi)蛋白酶，其催化帶有?；d體蛋白的酰基側(cè)鏈與S-腺苷蛋氨酸上的高絲氨酸結(jié)合成?；呓z氨酸內(nèi)酯化合物（Acyl-homoserine lactone，AHL）。（b）自體誘導肽（Auto-inducter peptide，AIPs）系統(tǒng)，存在于革蘭氏陽性菌中。AIP是一種寡肽，雖是小分子多肽，但需經(jīng)過ABC運轉(zhuǎn)系統(tǒng)（ATP-binding-cassette）或其他膜蛋白通道作用才能穿過細胞壁并行使功能（韋柯，2007）。（c）自誘導物Ⅱ類分子（AI-2s）系統(tǒng)。AI-2是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌共有的信號分子，是調(diào)節(jié)細菌行為通用語言。AI-2的產(chǎn)生依賴于LuxS蛋白（Bassler et al.，1993），如失活LuxS基因則不產(chǎn)生AI-2（XavierK and Bassler，2003）。因此，可從植物病原微生物Qs的信號分子著手，減少由QS機制調(diào)節(jié)的致病性的產(chǎn)生，達到防治植物病害的效果。篩選高效的群體感應抑制劑（Quorum sensing inhibi-tors，QSIs）有望成為防治植物病害的一條有效途徑。

正是由于病原菌QS能調(diào)節(jié)其致病性的產(chǎn)生，作為一種新型的病害防治策略，QS調(diào)控系統(tǒng)越來越受到國內(nèi)外學者重視。近年來，國內(nèi)外對QSIs的研究發(fā)展迅速，并取得了一些進展。了解并有效地利用QS機制來控制病原菌生物膜的形成、毒力因子的產(chǎn)生、致病基因的表達、病原菌問相互抑制或競爭（梁新焱和阮海華，2015）等無疑為抵御病菌感染、植物病害和細菌耐藥性研究提供了一條新途徑。目前，AHLs降解酶已開始廣泛應用于植物病害防治上；同時，已有研究表明抗生素的使用可有效鈍化抑制QS系統(tǒng)，從而達到緩解軟腐病發(fā)生的作用（葛瑋珍，2013）。隨著上述研究的深入，傳統(tǒng)化學藥劑防治植物病害的瓶頸將有望被打破。

1 QS抑制的主要策略

基于上述QS調(diào)控原理，干擾病原微生物的QS系統(tǒng)的途徑有3種。WAHL系統(tǒng)為例，包括：（1）合成信號分子AHL底物的類似物來阻斷信號分子的形成；（2）促進AHL的降解；（3）抑制AHL與受體結(jié)合。

1.1阻斷信號分子產(chǎn)生

AHL的生物合成通常涉及一系列使用S-腺苷蛋氨酸（S-Adenosyl methionine，SAM）作為氨基供體生成高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)的一部分反應（Miller and Bassler，2001），?；d體蛋白（Acyl cartier protein，ACP）作為前體n-AHL的側(cè)鏈分子。基于以上知識，合成了SAM類似物如丁酰-S腺苷甲硫氨酸、全?；d體蛋白、西尼毒素和L/D-S-腺苷高半胱氨酸等，研究顯示這些物質(zhì)具有抗Os的活性（Scutera et al.，2014）。但目前僅在人體醫(yī)學上有應用，極少有進行植物病害防治的報道。

1.2阻止信號分子與受體蛋白結(jié)合

通過拮抗劑分子抑制信號分子的接收是另一個防控QS介導的植物病害機制，這些拮抗劑分子與信號分子競爭，干擾信號分子與受體結(jié)合。二酮哌嗪（Diketopiperazine，DKP）作為AHL類似物可與受體蛋白結(jié)合，從而阻止信號分子與受體蛋白結(jié)合，抑制QS系統(tǒng)所調(diào)節(jié)的基因的表達，使病原菌的致病性降低（Kalia and Purohit，2011）。由海洋紅藻分泌的鹵化呋喃也是與信號分子競爭并降解受體蛋白的AHL信號分子類似物，鹵化呋喃能有效抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）致病因子的表達，降低其對寄主的侵染能力（Hentzer et al.，2003）。

1.3信號分子的降解

在QS機制中AHL分子達到特定濃度是引發(fā)病原菌表達致病因子的關(guān)鍵。因此，如果能降解AHLs，使其無法達到濃度閾值，將很大程度削弱植物病原菌的致病性。雖然不同AHLs具有不同碳鏈長度和不同的酰基側(cè)鏈，但均以高絲氨酸為主體（韋柯，2007），具有相似的調(diào)控基因表達的機制。根據(jù)AHLs的結(jié)構(gòu)特點，理論上有4個作用位點可分解AHLs，分別是內(nèi)酯酶（AHL-lactonase）位點、脫氫酶（AHL-decarboxvlase）位點、酰基轉(zhuǎn)移酶（AHL-acyl-ase）位點和脫氨酶（AHL-deaminase）位點（張麗群等，2010）。目前已在大量原核生物和少數(shù)真核生物中發(fā)現(xiàn)QS信號分子的降解酶。研究表明，群體猝滅（Quorum quenching，QQ）酶水解AHL中酰胺鍵或內(nèi)酯環(huán)中的任何一個。降解AHLs很大程度上受AHL?；D(zhuǎn)移酶和AHL內(nèi)酯酶等的調(diào)節(jié)（Lin et al.，2003）。在病原菌或寄主植物中表達AHL降解酶可破壞病原菌的QS系統(tǒng)，從而達到防治植物病害的效果。

1.4基于QS的植物病害防治策略

根據(jù)植物對病原菌QS系統(tǒng)的反應，可采用以下幾種策略防治由病原菌QS造成的植物病害。（1）植物本身能夠合成QSIs從而降低病原菌的侵染力。如從弗吉尼亞櫟的葉子和假紫斑大戟氣生部分提取出能有效抑制根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefa-ciens）QS的活性物質(zhì)（Adonizio et al.，2006）。雖然已從許多植物中提取出QSIs活性物質(zhì)，卻很少應用于植物病害防治，但隨著研究的深入，一旦從植物中提取出具有信號分子抑制活性的物質(zhì)，即可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)達到防治植物病害的目的。（2）合成QS信號分子降解酶，使由QS調(diào)控的致病基因無法正常表達。植物自身很少產(chǎn)生信號分子降解酶，但目前已從一些微生物中發(fā)現(xiàn)AHLs降解酶，其中，芽胞桿菌產(chǎn)生的內(nèi)酯酶aiiA應用最廣，將aiiA蛋白轉(zhuǎn)入植物中，發(fā)現(xiàn)植物對歐文氏菌具有較好的抗性（Dong et al.，2001；Reimmann et al.，2002）。（3）根據(jù)天然QSis的結(jié)構(gòu)人工合成QSIs，并使其在植物體內(nèi)大量表達，抑制侵染植物的病原菌的致病力。（4）利用信號分子在植物體內(nèi)的微量表達刺激植物免疫系統(tǒng)發(fā)生反應。宋水山（2010）用幾種細菌信號分子AHL處理幾種歐文氏菌常見寄主，發(fā)現(xiàn)處理后植物體內(nèi)與自身防御反應相關(guān)的酶的活性提高；擬南芥能較好地防御由軟腐歐文氏菌引起的軟腐病。若將細菌AHL合成酶基因轉(zhuǎn)入植物，植物可合成QS信號分子，在病原菌尚未產(chǎn)生QS前就能控制信號分子AHL的作用，提高了植物的抗性。如表達胡蘿卜軟腐歐文氏菌的N-3-氧代己?；呓z氨酸內(nèi)酯合成酶基因expI的轉(zhuǎn)基因煙草對歐文氏菌的抗病性提高（宋水山等，2005）。

2 QSIs種類及應用

QSIs以QS分泌的信號分子為靶標，不會影響病原菌的正常活動，極大地減少了病原菌耐藥性的產(chǎn)生。根據(jù)QSis分子的性質(zhì)，可將其分為非肽類小分子化合物、肽類化合物（主要是AIPs同系物）和蛋白質(zhì)（主要為QS猝滅酶）（程古月等，2012）。

2.1非肽類小分子化合物

2.1.1天然來源OSis 植物可產(chǎn)生QSI活性以降低侵染菌的致病能力（圖2），病原菌釋放AHL分子導致生物被膜及冠癭形成。另一方面，這些植物會對細菌產(chǎn)生的信號分子作出反應，通過釋放AHL模擬化合物用于防御，進而影響細菌的QS系統(tǒng)（Kalia and Purohit，2011）。目前已有許多文獻報道了從自然植物資源中可分離獲得QSIs，由于這些植物可被人類消耗，因此具有QS抑制活性的化合物被認為具有安全，不會對人類細胞造成毒害作用。最先發(fā)現(xiàn)具有抑制QS活性的天然產(chǎn)物是由海洋紅藻（Delisea pulchra）產(chǎn)生的鹵代呋喃酮，研究發(fā)現(xiàn)鹵代呋喃酮在幾個革蘭氏陰性菌中通過干擾信號分子AHL與受體蛋白LuxR的結(jié)合來干涉AHL調(diào)控QS（Chong-Lek et al.，2013）。

除海洋紅藻外，從一些高等植物中也分離獲得QSI活性物質(zhì)，但目前從植物中提取出的QSls大多用于醫(yī)學上，很少用來防治植物病害。因此，了解植物產(chǎn)生的QSIs活性物質(zhì)及其作用機理，將植物本身產(chǎn)生的QSIs應用于植物病害防治將是一個重要的研究方向。

自然界中一些拮抗菌能通過營養(yǎng)競爭作用、產(chǎn)生抗生素、誘導植物本身的防御系統(tǒng)及重寄生作用來干擾病原菌QS，因此，拮抗菌分泌的抗生素和次級代謝產(chǎn)物可成為一種重要的天然QSIs。研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌分泌的抗生素及其次級代謝產(chǎn)物吩嗪類化合物能有效防治小麥全蝕病，對水稻枯萎病病原菌、辣椒疫菌和黃瓜炭疽病菌也具有抑制效果（孔麗萍，2008）。

2.1.2人工合成QSIs 雖然許多天然化合物具有QSIs活性，但其產(chǎn)量并不足以滿足大范圍的植物病害防治，因此人們根據(jù)天然溴化呋喃酮的結(jié)構(gòu)對取代基和側(cè)鏈長度稍加改動，設計了具有QSIs活性的化學分子庫（程古月等，2012）。如Manny等（1997）合成的如呋喃酮56可阻斷AHL分子與受體蛋白結(jié)合，并已取得明顯的結(jié)果。另外，C₅O₂Br₂和CsHOzl3r能通過加速LuxR的周轉(zhuǎn)代謝來抑制QS；C₉H₁₀O₂Br₂能抑制基于AHLs和AI-2s的OS系統(tǒng)。目前，大部分人工合成的抑制劑主要對哺乳動物致病菌的QS有效，對植物病原菌的QS抑制研究甚少，因此有待進一步探究，以確認人工合成QSIs對植物病害的防治效果。

除上述信號分子結(jié)構(gòu)類似物外，人們根據(jù)天然的抑制劑分子結(jié)構(gòu)從一些小分子化合物中篩選出一系列能有效抑制病原菌QS的單體化合物，如吡咯酮類化合物。Kaufxnann等（2005）發(fā)現(xiàn)吡咯二酮化合物能抑制生物被膜的形成，干擾假單胞菌進行群體交流。陳衛(wèi)民等（2009）的研究結(jié)果顯示，吡咯酮化合物是比呋喃酮更有潛力的QSIs的先導化合物。

2.2肽類化合物

在QSIs中，最常見的肽類化合物是AIPs同系物。AIP是一種小分子多肽，是革蘭氏陽性菌的自誘導分子。Mayville等（1999）發(fā)現(xiàn)AIP分子的尾部發(fā)生改變只能影響細菌本身二元信號轉(zhuǎn)導（agr）系統(tǒng)的活化，但依然能抑制跨細菌種屬的QS?；谶@一原理，人們設計了一些尾部結(jié)構(gòu)不同的AIPs同系物作為QSIs。如尾部丙氨酸被修飾的幾種AIPs類似物可有效抑制跨細菌種屬的QS系統(tǒng)（Mayville et al.，1999）。一個只含有硫內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的All肽既能感染病原菌群體內(nèi)的QS，也能抑制群體問的QS（Lyon et al.，2000）。通過對AIP分子三維構(gòu)效關(guān)系的研究，Lyon等（2000）發(fā)現(xiàn)TrAIP-Ⅱ可破壞信號傳導，抑制細菌QS，從而降低細菌的毒力。除了環(huán)狀的AIP肽外，一種線狀的RNAⅢ抑制肽（RIP）能減弱病原菌的毒力（Balaban et al.，2005）。

2.3 QQ酶

一些細菌能產(chǎn)生一種降解AHLs的酶——AHL內(nèi)酯酶，其能水解酰基高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)（Scutera et al.，2014）。Dong等（2001）研究表明，一種芽孢桿菌能產(chǎn)生酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因aiiA基因，其編碼的蛋白質(zhì)酶能降解胡籮卜歐文氏菌產(chǎn)生的AHL，極大程度上減弱了該病菌的致病性。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1中 B.cereus菌株A24 aiiA的表達會弱化一些QS控制的功能，如AHL積累和毒力因子的表達及分泌（Reimmann et al.，2002）。Mei等（2010）也研究發(fā)現(xiàn)，表達AHL內(nèi)酯酶基因aidH的Pectobacterium carotovorum內(nèi)AHL信號分子產(chǎn)量極大減少，其在一些主要寄主上的致病力也顯著下降。近年來，我國也開展了AHL信號降解酶的研究，發(fā)現(xiàn)植物青枯菌（Ralstonia solanacearum）菌株中的aac基因編碼的蛋白能有效降解細菌QS信號分子（張爭等，2008）。轉(zhuǎn)入aiiA基因的西甜瓜細菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）菌株信號分子的產(chǎn)生顯著降低，果斑病癥狀明顯減輕（陳濤等，2008）；該基因的轉(zhuǎn)化植株也能防御P.carotovorum引起的軟腐病（柴鑫莉等，2007；馬宏等，2009）。

在發(fā)現(xiàn)QQ內(nèi)酯酶aiiA后不久，Leadbetter和Greenberg（2000）分離出一種能利用AHL作為能量和氮源的Vanovorax paradoxus菌株，降解該AHL需要AHL?；D(zhuǎn)移酶。AHL?；D(zhuǎn)移酶隨后也在P.aeruginosa、Ralstonia strains、Comamonas sp.、She-wanella sp.和Ochrobactrum sp.等中被鑒定出來（Su-sanne，2015）。因為AHLs有不同的?；滈L度，其為AHL?；柑峁┮鬃冃裕↙in et al.，2003）。不同?；笇Σ煌L度AHL的作用效果也不同。真氧產(chǎn)堿桿菌中的AHL?；窤iiD對超過8個碳的長鏈AHLs更有效（Ren et al.，2002）。相反，鏈霉菌M664中的AHL?；冈阪滈L度少于8個碳時具有高效性（Park et al，2005）。許多AHL酰化酶等位基因有降解長鏈AHLs的偏好。然而，Uroz等（2007）從毛單胞菌中發(fā)現(xiàn)有不同活性的?；?，能降解?；滈L度4～16碳的AHLs。

一系列的研究已顯示紅球菌（Rhodococcus）有QQ能力。紅平紅球菌（R.erythropolis）W2擁有AHL內(nèi)酯酶和AHL?；富钚?。在植物內(nèi)，紅平紅球菌能明顯減少馬鈴薯塊莖中果膠桿菌屬Carotovorumsp.的致病性（Kiran et al.，2008）。近年來發(fā)現(xiàn)有的真菌也能降解AHLs酶，如Phialocephala、Ascomyce-tes和Melinimyces已被證實擁有作用于C6HSL和30C6HSL內(nèi)酯環(huán)的內(nèi)酯酶活性（Kalia and Purohit，2011）。

3展望

作為一種新型的植物病害防治策略，基于QS系統(tǒng)調(diào)控的植物病害防治途徑不影響病原物的正常生長，只是調(diào)控病原菌致病因子的正常表達，使病原菌不能侵染寄主或降低致病力，從而有效控制植物病害，且不易使病原菌產(chǎn)生抗性（Scutera et al.，2014）。理論上，QSis與傳統(tǒng)的化學防治試劑相比具有以下優(yōu)點：（1）QSIs并不妨礙病原菌的正常生長代謝，而是抑制QS系統(tǒng)，減弱病原菌的毒力，降低其致病性。這樣既可有效抑制植物病害，又能緩解病原菌產(chǎn)生耐藥性，而且能減少對有益菌的殺傷。（2）由于作用機制不同，QSis可與其他農(nóng)用抗生素聯(lián)用，以增強抗菌療效，減少化學試劑的用量，在有效治療相關(guān)病害的同時，減少環(huán)境污染及防治費用（孫琦，2014）。

自發(fā)現(xiàn)可利用病原微生物QS以防治植物微生物病害以來，科學家們對OS抑制的研究從未停歇。大量研究表明，向植物中轉(zhuǎn)AQS信號降解酶基因培育出的轉(zhuǎn)基因植物能較好地防治植物病害，具有很好的應用前景。如轉(zhuǎn)基因植物對果膠桿菌引起的軟腐病已表現(xiàn)出明顯的抗性。除了研究轉(zhuǎn)基因植物，向植物體內(nèi)注入QSIs，在病原菌侵染宿主前即抑制信號分子的作用，也能有效防治植物病害。植物本身就能產(chǎn)生QSis，但合成量較少。越來越多人工合成的QSis應用于實際生產(chǎn)，初步解決了自然資源中QSis合成量很少的不足。

在今后的研究中，利用現(xiàn)有的理論基礎開展QSis篩選和基于QS系統(tǒng)淬滅機制的植物病害防治有望成為植物病害防治工作的重要方向之一，為此應加強以下方面的工作：（1）拓寬QSIs研究范圍，使其在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中均能廣泛應用。目前的QSis主要針對革蘭氏陰性菌的AHLs，而針對AT-1、AI-2及最新發(fā)現(xiàn)的信號分子AI-3（陳偉，2011）的抑制劑很少被報道。（2）加大QQ酶的研究力度。在多種QSIs中，QQ酶的毒性最小，被認為是最安全有效的酶類（范興輝等，2017）。（3）AHLs的QQ酶在植物病害防治中存在一些需要解決的問題，如淬滅酶在植物體內(nèi)的穩(wěn)定性、催化效率、底物特異性、在應用過程中是否存在副作用及預防措施等。（4）植物能監(jiān)測到QS信號分子的存在，并作出相應的應激反應（Kalia and Purohit，2011），但目前對有關(guān)植物產(chǎn)生的各種QS信號分子類似物的化學結(jié)構(gòu)和性質(zhì)了解較少，關(guān)于AHL信號在植物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導途徑及信號分子受體及其與受體的特異性結(jié)合的研究也不常見。為全面了解植物體內(nèi)受AHL影響而發(fā)生變化的生理生化特性及相關(guān)基因的表達，還需開展更深入的研究。（5）QS現(xiàn)象廣泛存在于各種微生物中，但目前只了解部分模式細菌群體的QS及其抑制方法，對于一些重要致病細菌及真菌QS系統(tǒng)的研究并不深人，因此應加強這方面的研究，如真菌致病性與QS的聯(lián)系、QS信號的區(qū)分、QSis的篩選等，為大量植物細菌或真菌病害提供新型綠色安全的防控措施。