楊琴，張桂香，楊建杰，王英利

摘要：為優(yōu)化大肥蘑菇液體培養(yǎng)基，通過單因子試驗確定大肥蘑菇最佳碳源（葡萄糖）、最佳氮源（蛋白胨）及礦物質的適宜濃度（用量）范圍，采用二次回歸旋轉組合設計研究3個參數(shù)對大肥蘑菇菌絲生物量的影響，建立數(shù)學模型，以獲得適宜的配方組合。結果表明，葡萄糖濃度、蛋白胨濃度對大肥蘑菇菌絲體生物量的影響達極顯著水平，礦物質添加劑用量達顯著水平。最優(yōu)培養(yǎng)基參數(shù)為葡萄糖濃度33.26 g/L、蛋白胨濃度4.24 g/L、礦物質添加劑1.82 mL/L，在該參數(shù)組合下，28 ℃振蕩培養(yǎng)8 d，菌絲干重可達16.44 g/L，且經反復試驗驗證可行。

關鍵詞：大肥蘑菇；培養(yǎng)基；二次回歸旋轉組合；優(yōu)化

中圖分類號：S646.9 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2017）11-0012-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.11.005

Optimization of Agaricus bitorquis Liquid Culture Medium by Quadratic Regression Orthogonal Rotary

YANG Qin， ZHANG Guixiang， YANG Jianjie， WANG Yingli

（Institute of Vegetable， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to optimize the liquid medium of Agaricus bitorquis， the best density（dosage） and appropriate concentration（dosage） range of main factors is determined by the single factor experiment and main factors including glucose， peptone and mineral additive. Further， the influence of three parameters on mycelia biomass is carried out using quadratic orthogonal rotation combination design， established the mathematical model， obtained the appropriate combination formula. The experimental result shows that the effects of glucose concentration， peptone concentration on mycelium biomass reached extremely significant level， and mineral additives to significant level. The optimal medium parameters which glucose is 33.26 g/L， peptone is 4.24 g/L， mineral additives is 1.82 mL/L. Experiment is performed with the optimal parameters which 28 ℃ shaking culture 8 d， mycelial dry weight reach to 16.44 g/L. Prediction result is reliable and the model is validated.

Key words：Agaricus bitorquis；Culture medium；Quadratic regression rotation combination；Optimization

博斯騰湖位于巴音郭楞蒙古自治州焉耆盆地的博湖縣境內，總面積 1 228 km2，蓄水量 8.0×109 m3，是開都河的歸宿，孔雀河的源頭，更是一座天然的大型調節(jié)水庫，也是新疆最大的內陸淡水湖。大肥蘑菇（經ITS 序列分析確定[1 ]）是在新疆博斯騰湖特殊環(huán)境條件下形成的極為珍貴的野生食用菌，在分類上隸屬于擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）蘑菇屬（Agaricua），其子實體碩大、菌肉肥厚細嫩，通過營養(yǎng)成分、氨基酸組成、礦物質、脂肪酸營養(yǎng)成分的測定[2 - 3 ]，發(fā)現(xiàn)大肥蘑菇具有極高的風味物質、營養(yǎng)價值和保健作用。在自然發(fā)生條件下，大肥蘑菇的菌絲體和子實體發(fā)生部位一般都在40～60 cm深的土層之下，極少露出地面，采菇者往往通過雨后地表局部隆起、裂縫情況或腳踩時的松軟感覺尋找菇區(qū)，且子實體一般成片分布，只要發(fā)現(xiàn)一個、挖下去就是一大片[4 ]。近年來，由于生態(tài)環(huán)境的變化，大肥蘑菇自然發(fā)生量明顯減少。為了保護這種珍惜食用菌，我們對其菌種保藏、人工撫育、馴化栽培進行了較為系統(tǒng)的研究。有關大肥蘑菇的人工馴化及高產栽培技術研究已有一些報道，包括培養(yǎng)基的篩選[5 ]、栽培方式的比較[6 ]、覆土材料的篩選[7 ]等。但依賴天然雜交具四孢特性的大肥蘑菇種內相似程度較低[8 ]，不同菌株間差異很大。博斯騰湖大肥蘑菇作為大肥蘑菇野生種之一，對其營養(yǎng)生理已進行過詳細研究，適宜的碳源（葡萄糖）、氮源（蛋白胨）及礦物質元素均已明確[9 ]，不過這些研究僅從單因素出發(fā)，還存在一定的局限性，因素間的交互作用需要綜合考慮。二次正交旋轉組合設計通過統(tǒng)計軟件對試驗結果進行非線性數(shù)學模型擬合，是一種將正交、回歸、均勻和較高飽和程度融為一體的試驗設計方法[10 ]，建立模型之后，能多角度對模型進行模擬分析，可充分發(fā)掘模型所提供的信息[11 ]。我們在大肥蘑菇營養(yǎng)生理研究的基礎上，采用單因素試驗獲得主要因素的適宜范圍，然后采用二次回歸旋轉組合設計對培養(yǎng)基參數(shù)及其交互作用進行研究，以期獲得大肥蘑菇菌絲體最佳培養(yǎng)基組成，為液體培養(yǎng)基的制備提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 供試菌株于2009年7月采集野生子實體經組織分離獲得[1 ]，經多年馴化選育，編號為200961-1。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體菌種培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g，無離子水1 000 mL；培養(yǎng)基Ⅰ配方為蛋白胨2 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.5 g、無離子水1 000 mL；培養(yǎng)基Ⅱ配方為葡萄糖10 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.5 g、無離子水1 000 mL；培養(yǎng)基Ⅲ配方為葡萄糖10 g、蛋白胨2 g、無離子水1 000 mL。

1.2 試驗設計

1.2.1 單因子試驗設計 采用培養(yǎng)基Ⅰ配制葡萄糖濃度分別為10、20、30、40、50 g/L的液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基Ⅰ為對照，研究葡萄糖濃度對大肥蘑菇菌絲體生長的影響。采用培養(yǎng)基Ⅱ配制蛋白胨濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9 g/L的液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基Ⅱ為對照，研究蛋白胨濃度對大肥蘑菇菌絲體生長的影響。采用培養(yǎng)基Ⅲ配制礦物質添加劑（5 g/L CuSO4+5 g/L ZnSO4溶液）用量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/L的平板培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基Ⅲ為對照，研究礦物質添加劑用量對大肥蘑菇菌絲體生長的影響。

1.2.2 多因子試驗設計 在單因素試驗結果的基礎上，取葡萄糖、蛋白胨、礦物質添加劑適宜的濃度及用量范圍，對3因素進行二次回歸正交旋轉組合試驗設計，試驗因素水平及編碼見表1。中心化處理公式Xi j′=Xi j2-0.593 8=0.406 2 （i=1， 2， 3 ……30；j=1，2，3）。

1.3 試驗方法

1.3.1 液體菌種的制備 按液體菌種配方制備培養(yǎng)基后，分裝于100/250 mL三角瓶內，高壓滅菌、冷卻后接入活化斜面菌種，于振蕩培養(yǎng)器上培養(yǎng)（轉速150 r/min，溫度25 ℃±1 ℃）8 d可得液體菌種。

1.3.2 試驗操作 按試驗設計制備培養(yǎng)基，然后分裝在100 mL三角瓶中，每瓶24 mL，3次重復。滅菌、冷卻后每瓶接入1 mL液體菌種，于28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)8 d，濾出菌絲體，80 ℃下烘干24 h，稱量菌絲體重量，換算成1 000 mL培養(yǎng)液中菌絲體干重，即為試驗結果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS（Data Processing System）軟件和 Microsoft Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行處理和方差分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 葡萄糖濃度對大肥蘑菇菌絲生長的影響 通過表2數(shù)據(jù)得到葡萄糖濃度（Z1）與大肥蘑菇菌絲生長量（Y1）的數(shù)學模型：

■1=1.9837+0.193 8Z1-0.002 7Z12 （P=0.004 6）（1）

對方程（1）求導可得：Z1max=36.61

由方程1可得圖1及Y1的預測值■1（表2）。由圖1可以得出，菌絲生長量隨著葡萄糖濃度的增加而升高，當葡萄糖用量大于36.61 g/L時，菌絲生長量又隨著葡萄糖用量的升高而下降，因此葡萄糖的最佳用量為36.61 g/L；當葡萄糖用量為0時，菌絲干重為2.19 g/L，表明菌絲利用了蛋白胨中的一些碳素物質。

2.1.2 蛋白胨濃度對大肥蘑菇菌絲生長的影響 通過表3中數(shù)據(jù)可得蛋白胨濃度與大肥蘑菇菌絲生長量的數(shù)學模型：

■2=10.3317/[1 + exp（2.061 6 - 0.989 6 Z2）] （P = 0.000 1）（2）

對方程（2）求導可得：Z2max=1.87

由方程2可得圖2及Y2的預測值■2（表3）。由圖2可知，當?shù)鞍纂藵舛葹?～4 g/L時，菌絲生長量增加很快，表現(xiàn)為近直線增長；當濃度大于4 g/L時，隨著蛋白胨濃度的增加，菌絲生長量增加幅度很小并逐漸趨于平緩，因此蛋白胨的最佳濃度為4 g/L。當?shù)鞍纂藵舛葹?時，菌絲干重為2.98 g/L，表明菌絲在不提供氮源的情況下仍能夠生長。

2.1.3 礦物質添加劑用量對大肥蘑菇菌絲生長的影響 根據(jù)表4數(shù)據(jù)可得礦物質添加劑用量（Z3）與大肥蘑菇菌絲生長量（Y3）的數(shù)學模型：

■3=0.281 7+0.064 4 Z3-0.017 2 Z32 （P=0.001 5）（3）

對方程（3）求導可得：Z3max=1.87

由方程（3）可得圖3及Y3的預測值■3（表4）。由圖3可知，當?shù)V物質添加劑用量較低時，菌絲日生長量隨著礦物質添加劑用量的增加而增加；當?shù)V物質添加劑用量達到1.87 mL/L時，菌絲日生長量最大；之后隨著礦物質添加劑用量的增加，菌絲日生長量呈現(xiàn)出下降的趨勢?？梢姷陀昧康牡V物質添加劑可以提高菌絲的生長速率，高用量的礦物質添加劑反而會抑制菌絲生長，因此礦物質添加劑的最適用量為1.87 mL/L。

2.2 二次回歸正交旋轉組合試驗

2.2.1 數(shù)學模型的建立及方差分析 對獲得的菌絲干重求其平均值（y）即為試驗結果（表5）。對該結果進行回歸分析計算（表6），由表6得菌絲干重yj與xij的回歸方程：

y=16.144 + 0.346 x1 + 0.621 x2 + 0.184 x3 + 0.345 x1x2 + 0.288 x1 x3 - 0.299 x2 x3 - 1.043 x12 - 0.327 x22 - 0.459 x32

（4）

由方差分析可知，F(xiàn)1=0.318 < F0.05 （5， 8）=3.69，表明方程不失擬，與實際情況符合；F2=59.347> F0.01（9， 13）=4.19，回歸方程的檢驗達到了極顯著，說明模型的預測值與實際值非常吻合，模型成立。

2.2.2 單一因素對大肥蘑菇菌絲量的效應分析 由表6可以看出，葡萄糖濃度（x1）、蛋白胨濃度 （x2）對菌絲生物量的影響達到極顯著水平，礦物質添加劑用量（x3）對菌絲生物量的影響達到顯著水平。三者對菌絲生物量的影響作用表現(xiàn)為一次項x2 > x1> x3；二次項x12 > x22 > x32。從圖4可以看出，各個曲線的變化趨勢與葡萄糖濃度、蛋白胨濃度及礦物質添加劑用量對大肥蘑菇菌絲生長量的影響吻合。

2.2.3 兩因素對大肥蘑菇菌絲生長量的耦合效應

由表6可知，葡萄糖濃度與蛋白胨濃度的交互作用、蛋白胨濃度與礦物質添加劑用量的交互作用對大肥蘑菇菌絲生長量的影響達極顯著水平，葡萄糖濃度與礦物質添加劑用量的交互作用對菌絲生長量的影響達顯著水平。固定其他1個因子為0水平，可從模型（4）中導出另外2個因子的解析模型。其中葡萄糖濃度、蛋白胨濃度與菌絲生長量的交互作用關系式為：

yx1 x2=16.144+0.346x1+0.621x2-0.345x1x2-1.043x12-

0.327x22 （5）

由方程（5）可得圖5。由圖5可知，無論x2取何值，菌絲干重與x1之間均呈二次函數(shù)關系，即在同一蛋白胨濃度下，隨著葡萄糖濃度的提高，菌絲干重逐漸增大，達到一定值后，隨著濃度的增加菌絲干重反而減?。粡那€的位置來看，蛋白胨濃度較低時，隨著濃度的提高，菌絲干重逐漸增大，當x2=1，x2=1.681 8時，兩條曲線的位置較接近，說明蛋白胨達到適宜濃度后，菌絲干重不會隨著濃度的提高而增大；在x1∈[0，1]，x2∈[1，1.681 8]時，x1x2的交互作用較強，經計算：x1= 0.422 0，x2=1時，菌絲干重最大。

葡萄糖濃度x1、礦物質添加劑用量x3與菌絲生長量的交互作用關系式為：

yx1 x3=16.144+0.346x1+0.184x3+0.288x1x3-1.043x12- 0.459x32 （6）

由方程（6）可得圖6。由圖6可知，無論x1取何值，菌絲干重與x3之間均呈二次函數(shù)關系；葡萄糖濃度較低或較高時，不論礦物質添加劑用量（x3）取何值，均得不到理想的菌絲干重；而當葡萄糖濃度適中，即x1=0時，菌絲干重較高。x1、x3的適宜取值范圍為x1∈[0，1]，x3∈[-1，1]，經計算：x1=0，x3= 0.200 4時，菌絲干重最高。

蛋白胨濃度x2、礦物質添加劑用量x3與菌絲生長量的交互作用關系式為：

yx2 x3=16.144+0.621x2+0.184x3-0.299x2x3-0.327x22-

0.459x32 （7）

由方程（7）可得圖7，由圖7可知，當x2= -1.681 8及x2=-1時，隨礦物質添加劑用量的增大，菌絲干重逐漸增大；當x2= 0、x2= 1、x2=1.681 8時，菌絲干重呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，表明在蛋白胨濃度較高的情況下，礦物質添加劑用量應相應減??；在x2∈[0，1]，x3∈[0，1]時，的交互作用較強，經計算：當x2=0，x3=0.200 4時，二者的交互作用最強，即菌絲干重最大。

2.2.4 大肥蘑菇母種培養(yǎng)基模型的優(yōu)化 根據(jù)以上結果對模型進行優(yōu)化，對方程（4）進行極值分析，采用薛爾維斯德（J.J.SyLvester）不等式判別方程（4）的極值。設方程（4）在穩(wěn)定點x0=（x01，x02，x03）處，計算y對xj （j=1，2，3）的各階偏導數(shù)，并定義行列式Dj為：

經計算： D1=-2.086<0， D2=1.245>0， D3=-1.716<0。

由以上計算可知，方程（4）具有極小值，采用求駐點的方法計算極小值。對方程（4）中各變量求一階偏導數(shù)并令其為0，則有：

0.346+0.345x2+0.288x3-1.043x1=00.621+0.345x1-0.299x3-0.327x2=00.184+0.288x1-0.2991x2-0.459x3=0

解此方程組得：

x1max= 0.19，x2max=1.40，x3max= 0.02

將編碼公式代入上式得：

Z1max=33.26，Z2max=4.24，Z3max=1.82

即葡萄糖33.26 g/L，蛋白胨4.24 g/L，礦物質添加劑用量1.82 mL/L為最佳值。

3 結論

單因子研究結果表明，大肥蘑菇菌絲生長的最佳葡萄糖濃度為35.89 g/L、蛋白胨濃度為4.00 g/L、礦物質添加劑用量為1.87 mL/L。通過二次回歸正交旋轉組合試驗建立了大肥蘑菇菌絲培養(yǎng)基質的優(yōu)化數(shù)學回歸模型：y=16.144+0.346x1+0.621x2+0.184x3+0.345x1x2+0.288x1x3-0.299x2x3-1.043x12- 0.327x22-0.459x32。通過模型的優(yōu)化得出，大肥蘑菇菌絲培養(yǎng)基質的最佳配方為葡萄糖33.26 g/L、蛋白胨4.24 g/L、礦物質添加劑用量1.82 mL/L。采用此培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)8 d，菌絲干重可達16.44 g/L。經過反復試驗驗證，該配方正確可行。

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（本文責編：陳 偉）