王穎 賈瑞 李輝亮 郭冬 朱家紅 陳雄庭 彭世清
摘 要 利用Genome Walker方法從巴西橡膠樹(shù)中克隆了HbSERK1起始密碼子上游1 395 bp的5′調(diào)控序列,序列分析表明,該序列A/T含量高達(dá)66.2%,符合真核生物啟動(dòng)子序列的特征。HbSERK1啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件,如:TATA-box,CAAT-box等,同時(shí)存在其它應(yīng)答元件,如:CAT-box、02-site、ERE、ARE、TCA-element、GCN4-motif、ACA-motif等。將HbSERK1啟動(dòng)子進(jìn)行5′缺失,并構(gòu)建了5個(gè)植物缺失表達(dá)載體。利用真空滲透法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物缺失表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草,對(duì)煙草轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行GUS活性定量分析結(jié)果表明,除了SP5外,其它缺失表達(dá)載體均可以驅(qū)動(dòng)GUS蛋白的表達(dá),說(shuō)明在HbSERK1啟動(dòng)子-1 395~-252 bp區(qū)域可以驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá),表明HbSERK1啟動(dòng)子是具有生物活性的啟動(dòng)子。
關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹(shù);HbSERK1啟動(dòng)子;功能鑒定
中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A
Abstract The 5′ regulatory region of HbSERK1 from Hevea brasiliensis was cloned using GenomeWalker strategy. A/T content in this sequence is up to 66.2%, and meet the characteristic of eukaryotic promoter sequence. TATA box, CAAT box CAT-box, 02-site, ERE, ARE, TCA-element, GCN4-motif, ACA-motif were found in this promoter region. In order to verify HbSERK1 promoter function, Five deletions plant expression vector were constructed and transformed to the tobacco by Agrobacterium-mediated vacuum infiltration method and Agrobacterium-mediated. GUS activity analysis revealed that the region from -1 395~-252 bp nt drived expression of the GUS gene except SP5 deletion(-252 bp). The results of transient expression and stable expression suggest HbSERK1 promoter possess bioactivity.
Key words Hevea brasiliensis; HbSERK1 promoter; functional characterization
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.018
巴西橡膠樹(shù)是天然橡膠商業(yè)生產(chǎn)的唯一來(lái)源,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。從1904年巴西橡膠樹(shù)引入中國(guó)一個(gè)世紀(jì)以來(lái),中國(guó)在橡膠樹(shù)的選育種工作中取得了很大的成績(jī)。中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院的橡膠樹(shù)育種工作者根據(jù)橡膠樹(shù)階段發(fā)育的原理,建立了培育橡膠樹(shù)幼態(tài)無(wú)性系的一系列技術(shù),其中通過(guò)組織培養(yǎng)獲得的花藥體細(xì)胞植株及其芽接樹(shù)(幼態(tài)無(wú)性系)比花藥供體(老態(tài)無(wú)性系)產(chǎn)量提高了10%~42%[1-3],但一些高產(chǎn)橡膠樹(shù)品種在組織培養(yǎng)過(guò)程中很難由愈傷組織產(chǎn)生體細(xì)胞胚而獲得再生植株,從而限制了自根幼態(tài)無(wú)性系在橡膠樹(shù)生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此,通過(guò)研究橡膠樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因的分子機(jī)制,進(jìn)而利用生物技術(shù)改變關(guān)鍵因子的表達(dá)將是獲得橡膠樹(shù)優(yōu)良品種的幼態(tài)無(wú)性系的有效途徑。
植物胚胎發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因(SERK)是一個(gè)能使植物細(xì)胞獲得胚性能力的蛋白質(zhì),屬于LRR-RLK超級(jí)家族。首個(gè)SERK基因DcSERK來(lái)自于胡蘿卜下胚軸的胚性細(xì)胞中,且SERK是在胡蘿卜體細(xì)胞胚中特異表達(dá)的蛋白[4]。擬南芥AtSERK1 是胚胎發(fā)生信號(hào)途徑中的重要因子,在胚珠發(fā)育和胚胎形成初期表達(dá)[5],且過(guò)量表達(dá)后促進(jìn)胚胎發(fā)育[6]。在玉米中發(fā)現(xiàn)SERK可能參與了體細(xì)胞胚胎發(fā)育過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)[7]。LsSERK的缺失降低了萵苣組織培養(yǎng)過(guò)程中形成體細(xì)胞胚的能力[8]。在許多植物中,SERKs都有幾個(gè)家族基因[9-11],且參與胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答或其他生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[12-22]。本研究組研究人員已經(jīng)克隆了橡膠樹(shù)HbSERK1,且證明HbSERK1主要在橡膠樹(shù)體細(xì)胞胚發(fā)生的早期表達(dá),可能參與了體細(xì)胞胚發(fā)生[23]。筆者利用Genome Walker的方法分離得到HbSERK1的啟動(dòng)子,并對(duì)其功能進(jìn)行初步的研究,為HbSERK1在橡膠樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制打下理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
用于總DNA提取的巴西橡膠樹(shù)(無(wú)性系熱研7-33-97)葉片采自熱帶生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)基地;用于轉(zhuǎn)基因的三生煙草為本實(shí)驗(yàn)室保存。
LA PCRTM in vitro Cloning Kit購(gòu)自TaKaRa公司,試劑盒提供正向巢式引物C1和C2;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ,BamHⅠ,HindⅢ等購(gòu)于Formentas公司;根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株、植物表達(dá)載體pCAMBIA1301、植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z由本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 方法
1.2.1 橡膠樹(shù)基因組DNA的提取 參照安澤偉[24]的方法提取橡膠樹(shù)葉片的基因組DNA。
1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)HbSERK1的序列設(shè)計(jì)2條反向巢式PCR特異引物SERKP1和SERKP2,正向巢式引物為Genome Walker試劑盒引物C1和C2。根據(jù)已獲得的HbSERK1啟動(dòng)子序列,設(shè)計(jì)缺失表達(dá)載體引物WSP1,WSP2,WSP3,WSP4,WSP5,WSP6(表1)。
1.2.3 Genome Walker文庫(kù)構(gòu)建及GenomeWalker DNA Walking 參照LA PCRTM in vitro Cloning Kit產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),將提取的橡膠樹(shù)基因組DNA用SpeⅠ、Sau3AⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、Xma J、XbaⅠ、EcoT22Ⅰ、和MflⅠ8種酶進(jìn)行酶切消化,進(jìn)而純化酶切后的DNA。最后將純化的DNA與接頭連接(由LA PCRTM in vitro Cloning Kit提供),構(gòu)建成8種Genome Walker文庫(kù)(SpeⅠ文庫(kù)、Sau3AⅠ文庫(kù)、HindⅢ文庫(kù)、EcoRⅠ文庫(kù)、EcoT22Ⅰ文庫(kù)、MflⅠ文庫(kù)、Xma J文庫(kù)、XbaⅠ文庫(kù))。
PCR-based DNA Walking:(1)第一輪PCR:在8個(gè)0.2 mL PCR管中分別加入8種DNA文庫(kù)1 μL,然后依次加入10×LA PCR BufferⅡ 2 μL、2.5 mmol/L的dNTP 2 μL、 Primer C1 0.4 μL、Primer SERKP1 0.2 μL、 TaKaRa LA Taq 0.2 μL,總反應(yīng)體系為20 μL?;靹蚝筮M(jìn)行第一輪PCR,擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;35×(94 ℃ 30 s,57 ℃ 2 min,72 ℃ 80 s);72 ℃ 5 min。(2)第二輪PCR:將第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋后各取1 μL做模板,然后依次加入10×LA PCR BufferⅡ 2 μL、2.5 mmol/L的dNTP 2 μL、Primer C2 0.4 μL、Primer SERKP2 0.2 μL、TaKaRa LA Taq 0.2 μL,總反應(yīng)體系為20 μL?;靹蚝筮M(jìn)行第二輪PCR,擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;35×(94 ℃ 30 s,62 ℃ 2 min,72 ℃ 80 s);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后克隆到pMD19-T載體上送往中科瑞泰公司進(jìn)行測(cè)序。
1.2.4 HbSERK1啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體的構(gòu)建
(1)用PCR擴(kuò)增不同大小的5′缺失啟動(dòng)子。50 μL反應(yīng)體系如下:10×Taq Buffer(MgCl2-)5 μL,MgCl2 5 μL,10 mmol/L dNTP 5 μL,引物各2.5 μL,Taq 1 μL,Temple,5 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;28×(94 ℃ 30 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 5 min);72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物回收后克隆到pMD19-T載體上送去測(cè)序。
(2)分別對(duì)表達(dá)載體PCAMBIA1381Z和插入了缺失啟動(dòng)子片段的pMD19-T Simple Vector用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切,回收目的片段并連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒DNA送去測(cè)序。
(3)構(gòu)建好的缺失表達(dá)載體示意圖如下(圖1)。
1.2.5 HbSERK1啟動(dòng)子各缺失表達(dá)片段轉(zhuǎn)化煙草及GUS定量分析 (1)將各缺失表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中,菌液二次擴(kuò)大培養(yǎng)后,收集重懸菌體,將大小相同的三生煙草葉片浸泡在重懸菌液中,在0.85 Mp壓力下,真空滲透40 min。取出葉片,將葉片平鋪于MS培養(yǎng)基上,光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d。
(2)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤(pán)法將構(gòu)建好的各缺失表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草,將共培養(yǎng)后的煙草葉片轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基(MS+100 mg/L Timetin+50 mg/L潮霉素B)上。煙草轉(zhuǎn)化植株葉片DNA是參照Plant DNA Isolation Kit(FOREGENE公司)說(shuō)明進(jìn)行提取,對(duì)煙草轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR驗(yàn)證時(shí)使用各缺失片段特異引物,擴(kuò)增程序:94 ℃ 預(yù)變性3 min;28×(94 ℃ 30 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 5 min);72 ℃ 5 min。
(3)植物總蛋白的提?。喝?.3 g三生煙草葉片,加液氮快速研磨,將研磨好的粉末轉(zhuǎn)到預(yù)冷的0.5 mL蛋白提取液的離心管中。渦旋,冰上充分反應(yīng)30 min,4 ℃ 11 000 r/min離心10 min。用移液器輕輕吸取上清至新的離心管中,將其放于冰上待用??偟鞍诐舛鹊臏y(cè)定:采用Bradford法測(cè)定植物總蛋白濃度。
(4)GUS蛋白活性定量測(cè)定(Jeferson法):取20 μL蛋白提取液加入到37 ℃預(yù)熱的180 μL GUS蛋白分析Buffer中,37 ℃反應(yīng);40 min后加入800 μL的0.2 mol/L Na2CO3 Buffer終止反應(yīng)。吸取200 μL樣品轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板上,使用發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(λ365 nm/455 nm)。GUS蛋白活性計(jì)算,結(jié)果以所生成的4-MU的量與總蛋白含量和時(shí)間的比值pmol·min-1·mg-1表示。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
2 結(jié)果與分析
2.1 Genome walker文庫(kù)的構(gòu)建
將提取的橡膠樹(shù)基因組DNA用SpeⅠ、Sau3AⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、EcoT22Ⅰ、MflⅠ、Xma J和XbaⅠ8種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切消化,進(jìn)而純化酶切后的DNA。最后將純化的DNA與接頭連接,構(gòu)建成8種Genome Walker文庫(kù)(SpeⅠ庫(kù)、Sau3AⅠ庫(kù)、HindⅢ庫(kù)、EcoRⅠ庫(kù)、EcoT22Ⅰ庫(kù)、MflⅠ庫(kù)、Xma J庫(kù)、XbaⅠ庫(kù))(圖2)。
2.2 HbSERK1啟動(dòng)子的克隆
根據(jù)HbSERK1的序列設(shè)計(jì)2條反向巢式PCR特異引物SERKP1和SERKP2,正向巢式引物為Genome Walker試劑盒引物C1和C2。經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增后,在Hind III文庫(kù)中擴(kuò)增出一條清晰的條帶。將其克隆后測(cè)序,與已知的HbSERK1序列比對(duì)。結(jié)果表明,分離得到HbSERK1翻譯起始位點(diǎn)上游的1 395 bp序列,且該片段序列A/T含量高達(dá)66.2%,符合真核生物啟動(dòng)子序列的特征(圖3)。
2.3 HbSERK1啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)
用Softberry網(wǎng)站對(duì)HbSERK1的5′調(diào)控序列預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該序列中含有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域,其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)上游466 bp處。用Plant CARE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HbSERK1 5′調(diào)控序列的順式作用元件分析,預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該序列含有啟動(dòng)子核心序列TATA-box,增強(qiáng)子元件CAAT-box等多個(gè)典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件。同時(shí)存在胚乳表達(dá)元件GCN4-motif,分生組織表達(dá)元件CAT-box,玉米蛋白代謝元件02-site,還有厭氧誘導(dǎo)元件ERE,光響應(yīng)元件SP1、ACA-motif,ATCT-motif,水楊酸響應(yīng)元件TCA-element,乙烯利響應(yīng)元件ARE(圖4)。
2.4 HbSERK1啟動(dòng)子的功能分析
為了驗(yàn)證HbSERK1啟動(dòng)子的調(diào)控方式,構(gòu)建了HbSERK1啟動(dòng)子的5種植物缺失表達(dá)載體,PCR擴(kuò)增和酶切鑒定結(jié)果顯示目的片段與預(yù)期片段大小一致(圖5,圖6)。經(jīng)測(cè)序證明HbSERK1啟動(dòng)子已經(jīng)正向插入pCAMBIA1381Z上。將缺失表達(dá)載體分別命名為SP1、SP2、SP3、SP4、SP5。
HbSERK1啟動(dòng)子各缺失片段在煙草中瞬時(shí)表達(dá)后,GUS蛋白活性定量分析結(jié)果表明,與35S驅(qū)動(dòng)的pCAMBIA 1301對(duì)照比較,含有SP1、SP2、SP3、SP4煙草的葉片均具有GUS活性,說(shuō)明HbSERK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)具有一定的專一性。HbSERK1啟動(dòng)子在葉片中的GUS活性隨著啟動(dòng)子5′端的不斷缺失而不斷下降,含有SP5的煙草葉片沒(méi)有檢測(cè)到GUS活性(圖7)。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證HbSERK1啟動(dòng)子上游區(qū)段對(duì)GUS基因的調(diào)控作用,共獲得煙草轉(zhuǎn)化植株約200株。PCR檢測(cè)結(jié)果證明SP1、SP2、SP3、SP4、SP5已整合到煙草基因組中(圖8)。各缺失片段轉(zhuǎn)化煙草葉片的GUS蛋白活性定量分析結(jié)果表明,與35S驅(qū)動(dòng)的pCAMBIA 1301對(duì)照比較,SP1、SP2、SP3、SP4均具有GUS活性,且GUS活性隨著啟動(dòng)子5′端的不斷缺失而不斷下降,而SP5幾乎沒(méi)有GUS活性(圖9)。
3 討論
本研究根據(jù)前期已克隆的HbSERK1基因設(shè)計(jì)引物,用Genome Walker的方法分離得到HbSERK1翻譯起始位點(diǎn)上游的1 395 bp序列,且該片段序列A/T含量高達(dá)66.2%,符合真核生物啟動(dòng)子序列的特征,生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)含有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域和順式作用元件。
本研究為了驗(yàn)證HbSERK1啟動(dòng)子上游區(qū)段對(duì)GUS基因的調(diào)控作用,構(gòu)建了SP1、SP2、SP3、SP4、SP5 5種HbSERK1啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體,缺失片段瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)結(jié)果均顯示SP1、SP2、SP3、SP4具有GUS活性,而SP5幾乎沒(méi)有GUS活性。因此,筆者推測(cè)-661~-252 bp區(qū)段對(duì)HbSERK1啟動(dòng)子的活性至關(guān)重要,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),在-661~-252 bp間存在一個(gè)分生組織元件CAT,是與胚胎發(fā)育相關(guān)的作用元件,由此筆者推測(cè)CAT可能是HbSERK1啟動(dòng)子調(diào)控組件中的關(guān)鍵基序。Hecht等[25]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AtSERK1在胚珠發(fā)育和體細(xì)胞胚形成早期出現(xiàn),是一個(gè)與胚胎形成信號(hào)途徑相關(guān)的基因。Schellenbaum等[6]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),葡萄VvSERK1在體細(xì)胞胚中大量表達(dá)。Ma等[26]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),鳳梨AcSERK1主要參與了體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和發(fā)育過(guò)程。這一推測(cè)也符合本研究組前期發(fā)現(xiàn)的HbSERK1可能參與體細(xì)胞胚發(fā)生的過(guò)程[23]。隨后對(duì)照HbSERK1啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)圖發(fā)現(xiàn),在-1 394~-1 223 bp,-1 223~-952 bp,-661~-252 bp各區(qū)段間均存在增強(qiáng)子元件CAAT-box,這可能是GUS活性隨著啟動(dòng)子缺失片段的減小而不斷降低的原因。
基因的表達(dá)調(diào)控極其復(fù)雜,預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子順式作用元件中還有水楊酸響應(yīng)元件TCA-element,乙烯利響應(yīng)元件ARE,厭氧誘導(dǎo)元件ERE,光響應(yīng)元件SP1、ACA-motif,ATCT-motif,下一步可通過(guò)在橡膠樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中改變上述激素、光照、氧環(huán)境等因素,深入研究HbSERK1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,為利用生物技術(shù)改變HbSERK1基因的表達(dá)獲得橡膠樹(shù)優(yōu)良品種的幼態(tài)無(wú)性系提供理論依據(jù)。
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