王穎 賈瑞 李輝亮 郭冬 朱家紅 陳雄庭 彭世清

摘 要 利用Genome Walker方法從巴西橡膠樹中克隆了HbSERK1起始密碼子上游1 395 bp的5′調(diào)控序列，序列分析表明，該序列A/T含量高達(dá)66.2%，符合真核生物啟動(dòng)子序列的特征。HbSERK1啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件，如：TATA-box，CAAT-box等，同時(shí)存在其它應(yīng)答元件，如：CAT-box、02-site、ERE、ARE、TCA-element、GCN4-motif、ACA-motif等。將HbSERK1啟動(dòng)子進(jìn)行5′缺失，并構(gòu)建了5個(gè)植物缺失表達(dá)載體。利用真空滲透法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物缺失表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)煙草轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行GUS活性定量分析結(jié)果表明，除了SP5外，其它缺失表達(dá)載體均可以驅(qū)動(dòng)GUS蛋白的表達(dá)，說明在HbSERK1啟動(dòng)子-1 395～-252 bp區(qū)域可以驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)，表明HbSERK1啟動(dòng)子是具有生物活性的啟動(dòng)子。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；HbSERK1啟動(dòng)子；功能鑒定

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The 5′ regulatory region of HbSERK1 from Hevea brasiliensis was cloned using GenomeWalker strategy. A/T content in this sequence is up to 66.2%， and meet the characteristic of eukaryotic promoter sequence. TATA box， CAAT box CAT-box， 02-site， ERE， ARE， TCA-element， GCN4-motif， ACA-motif were found in this promoter region. In order to verify HbSERK1 promoter function， Five deletions plant expression vector were constructed and transformed to the tobacco by Agrobacterium-mediated vacuum infiltration method and Agrobacterium-mediated. GUS activity analysis revealed that the region from -1 395～-252 bp nt drived expression of the GUS gene except SP5 deletion（-252 bp）. The results of transient expression and stable expression suggest HbSERK1 promoter possess bioactivity.

Key words Hevea brasiliensis； HbSERK1 promoter； functional characterization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.018

巴西橡膠樹是天然橡膠商業(yè)生產(chǎn)的唯一來源，在國民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。從1904年巴西橡膠樹引入中國一個(gè)世紀(jì)以來，中國在橡膠樹的選育種工作中取得了很大的成績。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院的橡膠樹育種工作者根據(jù)橡膠樹階段發(fā)育的原理，建立了培育橡膠樹幼態(tài)無性系的一系列技術(shù)，其中通過組織培養(yǎng)獲得的花藥體細(xì)胞植株及其芽接樹（幼態(tài)無性系）比花藥供體（老態(tài)無性系）產(chǎn)量提高了10%～42%[1-3]，但一些高產(chǎn)橡膠樹品種在組織培養(yǎng)過程中很難由愈傷組織產(chǎn)生體細(xì)胞胚而獲得再生植株，從而限制了自根幼態(tài)無性系在橡膠樹生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，通過研究橡膠樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因的分子機(jī)制，進(jìn)而利用生物技術(shù)改變關(guān)鍵因子的表達(dá)將是獲得橡膠樹優(yōu)良品種的幼態(tài)無性系的有效途徑。

植物胚胎發(fā)生相關(guān)類受體蛋白激酶基因（SERK）是一個(gè)能使植物細(xì)胞獲得胚性能力的蛋白質(zhì)，屬于LRR-RLK超級(jí)家族。首個(gè)SERK基因DcSERK來自于胡蘿卜下胚軸的胚性細(xì)胞中，且SERK是在胡蘿卜體細(xì)胞胚中特異表達(dá)的蛋白[4]。擬南芥AtSERK1 是胚胎發(fā)生信號(hào)途徑中的重要因子，在胚珠發(fā)育和胚胎形成初期表達(dá)[5]，且過量表達(dá)后促進(jìn)胚胎發(fā)育[6]。在玉米中發(fā)現(xiàn)SERK可能參與了體細(xì)胞胚胎發(fā)育過程和信號(hào)傳導(dǎo)[7]。LsSERK的缺失降低了萵苣組織培養(yǎng)過程中形成體細(xì)胞胚的能力[8]。在許多植物中，SERKs都有幾個(gè)家族基因[9-11]，且參與胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答或其他生長發(fā)育過程[12-22]。本研究組研究人員已經(jīng)克隆了橡膠樹HbSERK1，且證明HbSERK1主要在橡膠樹體細(xì)胞胚發(fā)生的早期表達(dá)，可能參與了體細(xì)胞胚發(fā)生[23]。筆者利用Genome Walker的方法分離得到HbSERK1的啟動(dòng)子，并對(duì)其功能進(jìn)行初步的研究，為HbSERK1在橡膠樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于總DNA提取的巴西橡膠樹（無性系熱研7-33-97）葉片采自熱帶生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)基地；用于轉(zhuǎn)基因的三生煙草為本實(shí)驗(yàn)室保存。

LA PCRTM in vitro Cloning Kit購自TaKaRa公司，試劑盒提供正向巢式引物C1和C2；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等購于Formentas公司；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株、植物表達(dá)載體pCAMBIA1301、植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 橡膠樹基因組DNA的提取 參照安澤偉[24]的方法提取橡膠樹葉片的基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)HbSERK1的序列設(shè)計(jì)2條反向巢式PCR特異引物SERKP1和SERKP2，正向巢式引物為Genome Walker試劑盒引物C1和C2。根據(jù)已獲得的HbSERK1啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)缺失表達(dá)載體引物WSP1，WSP2，WSP3，WSP4，WSP5，WSP6（表1）。

1.2.3 Genome Walker文庫構(gòu)建及GenomeWalker DNA Walking 參照LA PCRTM in vitro Cloning Kit產(chǎn)品說明書，將提取的橡膠樹基因組DNA用SpeⅠ、Sau3AⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、Xma J、XbaⅠ、EcoT22Ⅰ、和MflⅠ8種酶進(jìn)行酶切消化，進(jìn)而純化酶切后的DNA。最后將純化的DNA與接頭連接（由LA PCRTM in vitro Cloning Kit提供），構(gòu)建成8種Genome Walker文庫（SpeⅠ文庫、Sau3AⅠ文庫、HindⅢ文庫、EcoRⅠ文庫、EcoT22Ⅰ文庫、MflⅠ文庫、Xma J文庫、XbaⅠ文庫）。

PCR-based DNA Walking：（1）第一輪PCR：在8個(gè)0.2 mL PCR管中分別加入8種DNA文庫1 μL，然后依次加入10×LA PCR BufferⅡ 2 μL、2.5 mmol/L的dNTP 2 μL、 Primer C1 0.4 μL、Primer SERKP1 0.2 μL、 TaKaRa LA Taq 0.2 μL，總反應(yīng)體系為20 μL?；靹蚝筮M(jìn)行第一輪PCR，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；35×（94 ℃ 30 s，57 ℃ 2 min，72 ℃ 80 s）；72 ℃ 5 min。（2）第二輪PCR：將第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋后各取1 μL做模板，然后依次加入10×LA PCR BufferⅡ 2 μL、2.5 mmol/L的dNTP 2 μL、Primer C2 0.4 μL、Primer SERKP2 0.2 μL、TaKaRa LA Taq 0.2 μL，總反應(yīng)體系為20 μL?；靹蚝筮M(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；35×（94 ℃ 30 s，62 ℃ 2 min，72 ℃ 80 s）；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后克隆到pMD19-T載體上送往中科瑞泰公司進(jìn)行測序。

1.2.4 HbSERK1啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體的構(gòu)建

（1）用PCR擴(kuò)增不同大小的5′缺失啟動(dòng)子。50 μL反應(yīng)體系如下：10×Taq Buffer（MgCl2-）5 μL，MgCl2 5 μL，10 mmol/L dNTP 5 μL，引物各2.5 μL，Taq 1 μL，Temple，5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；28×（94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min）；72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物回收后克隆到pMD19-T載體上送去測序。

（2）分別對(duì)表達(dá)載體PCAMBIA1381Z和插入了缺失啟動(dòng)子片段的pMD19-T Simple Vector用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段并連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，PCR檢測為陽性的菌液提取質(zhì)粒DNA送去測序。

（3）構(gòu)建好的缺失表達(dá)載體示意圖如下（圖1）。

1.2.5 HbSERK1啟動(dòng)子各缺失表達(dá)片段轉(zhuǎn)化煙草及GUS定量分析 （1）將各缺失表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，菌液二次擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集重懸菌體，將大小相同的三生煙草葉片浸泡在重懸菌液中，在0.85 Mp壓力下，真空滲透40 min。取出葉片，將葉片平鋪于MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d。

（2）用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法將構(gòu)建好的各缺失表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，將共培養(yǎng)后的煙草葉片轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基（MS+100 mg/L Timetin+50 mg/L潮霉素B）上。煙草轉(zhuǎn)化植株葉片DNA是參照Plant DNA Isolation Kit（FOREGENE公司）說明進(jìn)行提取，對(duì)煙草轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR驗(yàn)證時(shí)使用各缺失片段特異引物，擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；28×（94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min）；72 ℃ 5 min。

（3）植物總蛋白的提?。喝?.3 g三生煙草葉片，加液氮快速研磨，將研磨好的粉末轉(zhuǎn)到預(yù)冷的0.5 mL蛋白提取液的離心管中。渦旋，冰上充分反應(yīng)30 min，4 ℃ 11 000 r/min離心10 min。用移液器輕輕吸取上清至新的離心管中，將其放于冰上待用?？偟鞍诐舛鹊臏y定：采用Bradford法測定植物總蛋白濃度。

（4）GUS蛋白活性定量測定（Jeferson法）：取20 μL蛋白提取液加入到37 ℃預(yù)熱的180 μL GUS蛋白分析Buffer中，37 ℃反應(yīng)；40 min后加入800 μL的0.2 mol/L Na2CO3 Buffer終止反應(yīng)。吸取200 μL樣品轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板上，使用發(fā)光檢測儀檢測熒光強(qiáng)度（λ365 nm/455 nm）。GUS蛋白活性計(jì)算，結(jié)果以所生成的4-MU的量與總蛋白含量和時(shí)間的比值pmol·min-1·mg-1表示。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Genome walker文庫的構(gòu)建

將提取的橡膠樹基因組DNA用SpeⅠ、Sau3AⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、EcoT22Ⅰ、MflⅠ、Xma J和XbaⅠ8種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切消化，進(jìn)而純化酶切后的DNA。最后將純化的DNA與接頭連接，構(gòu)建成8種Genome Walker文庫（SpeⅠ庫、Sau3AⅠ庫、HindⅢ庫、EcoRⅠ庫、EcoT22Ⅰ庫、MflⅠ庫、Xma J庫、XbaⅠ庫）（圖2）。

2.2 HbSERK1啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)HbSERK1的序列設(shè)計(jì)2條反向巢式PCR特異引物SERKP1和SERKP2，正向巢式引物為Genome Walker試劑盒引物C1和C2。經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增后，在Hind III文庫中擴(kuò)增出一條清晰的條帶。將其克隆后測序，與已知的HbSERK1序列比對(duì)。結(jié)果表明，分離得到HbSERK1翻譯起始位點(diǎn)上游的1 395 bp序列，且該片段序列A/T含量高達(dá)66.2%，符合真核生物啟動(dòng)子序列的特征（圖3）。

2.3 HbSERK1啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測

用Softberry網(wǎng)站對(duì)HbSERK1的5′調(diào)控序列預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該序列中含有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域，其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)上游466 bp處。用Plant CARE數(shù)據(jù)庫對(duì)HbSERK1 5′調(diào)控序列的順式作用元件分析，預(yù)測結(jié)果顯示該序列含有啟動(dòng)子核心序列TATA-box，增強(qiáng)子元件CAAT-box等多個(gè)典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件。同時(shí)存在胚乳表達(dá)元件GCN4-motif，分生組織表達(dá)元件CAT-box，玉米蛋白代謝元件02-site，還有厭氧誘導(dǎo)元件ERE，光響應(yīng)元件SP1、ACA-motif，ATCT-motif，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，乙烯利響應(yīng)元件ARE（圖4）。

2.4 HbSERK1啟動(dòng)子的功能分析

為了驗(yàn)證HbSERK1啟動(dòng)子的調(diào)控方式，構(gòu)建了HbSERK1啟動(dòng)子的5種植物缺失表達(dá)載體，PCR擴(kuò)增和酶切鑒定結(jié)果顯示目的片段與預(yù)期片段大小一致（圖5，圖6）。經(jīng)測序證明HbSERK1啟動(dòng)子已經(jīng)正向插入pCAMBIA1381Z上。將缺失表達(dá)載體分別命名為SP1、SP2、SP3、SP4、SP5。

HbSERK1啟動(dòng)子各缺失片段在煙草中瞬時(shí)表達(dá)后，GUS蛋白活性定量分析結(jié)果表明，與35S驅(qū)動(dòng)的pCAMBIA 1301對(duì)照比較，含有SP1、SP2、SP3、SP4煙草的葉片均具有GUS活性，說明HbSERK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)具有一定的專一性。HbSERK1啟動(dòng)子在葉片中的GUS活性隨著啟動(dòng)子5′端的不斷缺失而不斷下降，含有SP5的煙草葉片沒有檢測到GUS活性（圖7）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證HbSERK1啟動(dòng)子上游區(qū)段對(duì)GUS基因的調(diào)控作用，共獲得煙草轉(zhuǎn)化植株約200株。PCR檢測結(jié)果證明SP1、SP2、SP3、SP4、SP5已整合到煙草基因組中（圖8）。各缺失片段轉(zhuǎn)化煙草葉片的GUS蛋白活性定量分析結(jié)果表明，與35S驅(qū)動(dòng)的pCAMBIA 1301對(duì)照比較，SP1、SP2、SP3、SP4均具有GUS活性，且GUS活性隨著啟動(dòng)子5′端的不斷缺失而不斷下降，而SP5幾乎沒有GUS活性（圖9）。

3 討論

本研究根據(jù)前期已克隆的HbSERK1基因設(shè)計(jì)引物，用Genome Walker的方法分離得到HbSERK1翻譯起始位點(diǎn)上游的1 395 bp序列，且該片段序列A/T含量高達(dá)66.2%，符合真核生物啟動(dòng)子序列的特征，生物信息學(xué)分析預(yù)測含有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域和順式作用元件。

本研究為了驗(yàn)證HbSERK1啟動(dòng)子上游區(qū)段對(duì)GUS基因的調(diào)控作用，構(gòu)建了SP1、SP2、SP3、SP4、SP5 5種HbSERK1啟動(dòng)子缺失表達(dá)載體，缺失片段瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)結(jié)果均顯示SP1、SP2、SP3、SP4具有GUS活性，而SP5幾乎沒有GUS活性。因此，筆者推測-661～-252 bp區(qū)段對(duì)HbSERK1啟動(dòng)子的活性至關(guān)重要，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在-661～-252 bp間存在一個(gè)分生組織元件CAT，是與胚胎發(fā)育相關(guān)的作用元件，由此筆者推測CAT可能是HbSERK1啟動(dòng)子調(diào)控組件中的關(guān)鍵基序。Hecht等[25]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AtSERK1在胚珠發(fā)育和體細(xì)胞胚形成早期出現(xiàn)，是一個(gè)與胚胎形成信號(hào)途徑相關(guān)的基因。Schellenbaum等[6]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄VvSERK1在體細(xì)胞胚中大量表達(dá)。Ma等[26]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鳳梨AcSERK1主要參與了體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和發(fā)育過程。這一推測也符合本研究組前期發(fā)現(xiàn)的HbSERK1可能參與體細(xì)胞胚發(fā)生的過程[23]。隨后對(duì)照HbSERK1啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測圖發(fā)現(xiàn)，在-1 394～-1 223 bp，-1 223～-952 bp，-661～-252 bp各區(qū)段間均存在增強(qiáng)子元件CAAT-box，這可能是GUS活性隨著啟動(dòng)子缺失片段的減小而不斷降低的原因。

基因的表達(dá)調(diào)控極其復(fù)雜，預(yù)測的啟動(dòng)子順式作用元件中還有水楊酸響應(yīng)元件TCA-element，乙烯利響應(yīng)元件ARE，厭氧誘導(dǎo)元件ERE，光響應(yīng)元件SP1、ACA-motif，ATCT-motif，下一步可通過在橡膠樹組織培養(yǎng)過程中改變上述激素、光照、氧環(huán)境等因素，深入研究HbSERK1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為利用生物技術(shù)改變HbSERK1基因的表達(dá)獲得橡膠樹優(yōu)良品種的幼態(tài)無性系提供理論依據(jù)。

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