時濤 蔡吉苗 李超萍 黃潔 黃貴修

摘 要 細(xì)菌性萎蔫病是世界范圍內(nèi)木薯種植中的重要病害，也是中國木薯種植中為害最嚴(yán)重的病害。前期研究發(fā)現(xiàn)銅基殺菌劑對國內(nèi)木薯細(xì)菌性萎蔫病防效欠佳，隨即開展了病菌抗銅性評價及抗銅相關(guān)基因簇的分子分析工作。評價了42個不同來源病原菌菌株對硫酸銅的抗性，發(fā)現(xiàn)其抑菌最低有效濃度均在1.35～1.75 mmol/L之間。通過和已報道黃單胞菌類抗銅相關(guān)基因的比對分析，發(fā)現(xiàn)來自廣西的菌株GX11攜帶有copTAB和XmeRSA 2個抗銅基因簇。對來自南美州、非洲和亞洲67個菌株的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)菌株均帶有這2個基因簇，聚類分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因在菌株之間具高度的同源性。

關(guān)鍵詞 木薯；細(xì)菌性萎蔫病菌；copTAB基因簇；XmeRSA基因簇

中圖分類號 S435.651 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Cassava bacterial blight caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis is one kind of worldly important diseases， and it is the most serious disease in the cassava plantations of China too. Further research results showed the copper-based fungicides had a little effective on cassava bacterial blight， so the resistance evaluation to copper and molecule analysis about copper resistance related gene clusters for X. axonopodis pv. manihotis was launched in our lab. The evaluation results showed the lowest effective concentration of 42 strains came from different areas were from 1.35 mmol/L to 1.75 mmol/L. Compared with reported copper resistance genes from other Xanthomonas spp strains， the two homologous gene clusters of copTAB and XmeRSA were anchored in the genome of X. axonopodis pv. manihotis strain GX11 from Guangxi province. These two gene clusters were also located in almost all of 67 strains from South America， Africa and Asia， and phylogenetic analysis showed this two gene clusters were highly consistent between strains. The results in this paper would facilitate for further research related with response mechanism of X. axonopodis pv. manihotis strain to copper and formulate the control program for this disease.

Key words cassava； Xanthomonas axonopodis pv. manihotis； copTAB gene clusters； XmeRSA gene clusters

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.023

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科木薯屬灌木狀多年生作物，是世界上六大糧食作物之一。木薯起源于熱帶美洲地區(qū)，栽培史悠久，目前廣泛栽種于熱帶和亞熱帶地區(qū)的100多個國家[1]。1820年前后，木薯首次傳入中國廣東地區(qū)，因其具有耐旱、耐貧瘠、高產(chǎn)高淀粉等特點，目前已遍及華南地區(qū)。木薯在中國主要用作工業(yè)原料，相關(guān)產(chǎn)業(yè)在當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位[2]，但木薯生產(chǎn)尚不能自給，是世界上最大的進(jìn)口國[3]。

由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，簡稱Xam）侵染引起的細(xì)菌性萎蔫病，也稱細(xì)菌性枯萎病，是世界范圍內(nèi)木薯種植中的毀滅性病害，廣泛發(fā)生于亞洲、非洲和拉丁美洲的木薯產(chǎn)區(qū)。病原菌主要為害葉片和莖干，能夠產(chǎn)生葉片角斑、萎蔫、枯萎、提前脫落以及幼苗萎蔫、枝條回枯、莖干潰瘍、維管束壞死等癥狀，削弱長勢并造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失[4]。項目組前期研究發(fā)現(xiàn)該病已在中國木薯主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，是當(dāng)前木薯種植中為害最嚴(yán)重的病害[5]。銅基殺菌劑是作物細(xì)菌性病害防控中的常用藥劑，也是中國木薯細(xì)菌性萎蔫病防控中常見的推薦藥劑[6-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)菌株GX01對氫氧化銅（有效成分為77%氫氧化銅WP）、噻菌銅（有效成分為20%噻菌銅SC）等銅基殺菌劑表現(xiàn)出一定程度的抗性[9]，而氫氧化銅對該病的田間校正防效也僅在30%左右（未發(fā)表資料）。本研究開展了該病病原菌抗銅性評價及已測序Xam病菌抗銅相關(guān)基因的分子分析工作，為進(jìn)一步開展抗銅分子機理研究及該病防控策略的制訂提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Xam菌株的培養(yǎng)采用YGP 培養(yǎng)基（參照《植病研究方法》[10]的配方制備）。42個分別來自中國、柬埔寨、哥倫比亞和烏干達(dá)的供試Xam菌株由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所、哥倫比亞波哥大大學(xué)、烏干達(dá)國家農(nóng)業(yè)研究組織等機構(gòu)提供（表1）。相關(guān)試劑均為國產(chǎn)分析純。菌株XamGX11的全基因組序列由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 不同來源Xam病菌抗銅性評價 參照盧昕等[11]的方法進(jìn)行。

1.2.2 國內(nèi)XamGX11菌株抗銅相關(guān)基因簇分子分析

從網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）基因組數(shù)據(jù)庫中下載代表性黃單胞類病原菌抗銅相關(guān)基因序列，獲得氨基酸序列后，比對各基因之間的同源性，采用tBlastn程序分析XamGX11菌株中的同源基因。獲得包括候選基因在內(nèi)的大片段序列后，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行ORF（Open Reading Frame）預(yù)測，得候選基因氨基酸序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastp對其功能進(jìn)行預(yù)測。

1.2.3 Xam病菌抗銅相關(guān)基因簇分析 從網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）基因組數(shù)據(jù)庫中下載已登錄的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株的基因組序列，分析各菌株中抗銅相關(guān)基因簇的分布情況。應(yīng)用MEGA version 4.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法比較各菌株中的同源基因簇同源性并生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap進(jìn)行檢驗，1 000次重復(fù)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Xam病菌抗銅性評價

供試菌株對硫酸銅的抗性評價結(jié)果見表2，各菌株抑菌最低有效濃度在1.35～1.75 mmol/L之間。國外菌株中，來自柬埔寨的4個菌株及哥倫比亞的5個菌株均在1.35～1.65 mmol/L之間，來自烏干達(dá)的3個菌株為1.35或1.45 mmol/L。國內(nèi)菌株中，來自江西的1個菌株、廣東的3個菌株、廣西的10個菌株均為1.35 mmol/L，而來自海南的1個菌株、廣東的1個菌株和廣西的2個菌株在42個菌株中抗銅能力最強，抑菌最低有效濃度為1.75 mmol/L。

2.2 國內(nèi)XamGX11菌株抗銅相關(guān)基因簇分子分析

2.2.1 已報道黃單胞類病原菌抗銅相關(guān)基因簇分子分析 檢索文獻(xiàn)并下載5株已報道的黃單胞菌株的抗銅基因簇后，發(fā)現(xiàn)黃單胞病菌抗銅基因簇的典型結(jié)構(gòu)為copLAB，也有菌株缺少copL基因，而來自中國河北的1株野油菜黃單胞菌帶有XmeRSA抗銅相關(guān)基因簇。在5個已登錄的抗銅基因簇中，3個位于染色體上，2個由質(zhì)粒攜帶，各基因簇來源菌株、登錄號等見表3。同源性比對結(jié)果表明，多數(shù)抗銅相關(guān)copLAB基因簇的氨基酸序列之間具有較高的同源性（圖1），但XmeRSA基因簇和其它基因之間無同源性，和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrotromonas maltophilia）RND家族多重抗藥性系統(tǒng)smeRSABC有較高的同源性。

2.2.2 XamGX11菌株抗銅相關(guān)基因簇分析 分析發(fā)現(xiàn)國內(nèi)菌株XamGX11基因組上同樣帶有兩個抗銅相關(guān)基因簇，根據(jù)同源性比對結(jié)果，分別命名為copTAB和XmeRSA，其染色體位置、預(yù)測基因大小、預(yù)測功能等見表4。該菌株copA基因上游的1個預(yù)測基因和黃單胞類copL基因之間無同源性，但和已報道Xac菌株306的copAB上游1個預(yù)測蛋白之間同源性為86%，預(yù)測其編碼銅轉(zhuǎn)運蛋白，因此暫命名為copT。copTAB位于Scaffold6，全長3 420 nt，編碼3個讀碼方向一致的預(yù)測基因，其中copT和copA、copA和copB編碼區(qū)之間間隔分別為90 nt和85 nt。XmeRSA位于Scaffold1，全長3 444 nt，編碼3個預(yù)測基因，XmeA和另外2個基因讀碼方向相反，XmeR和XmeS有4 nt的重疊，而XmeS和XmeA編碼區(qū)之間間隔162 nt。除copT的起始密碼子為“GTG”外，其余5個預(yù)測基因均為“ATG”。

比對結(jié)果表明，copA、copB和已報道Xac菌株306的同源基因相似性均為96%，copA和Xcj菌株C5的ORF1同源性僅為63%，而copB和Xav菌株7882的copB基因同源性僅為38%。該菌株copTAB基因簇和已報道代表性抗銅基因的同源性見圖2。XmeRSA和黃單胞菌株IG-8的XmeRSA同源性分別為67%、57%和34%（圖3）。

2.3 已完成基因組序列測定Xam病菌的抗銅相關(guān)基因簇分析

下載已登錄的67個Xam菌株的基因組數(shù)據(jù)，用菌株XamGX11兩個基因簇的序列進(jìn)行比對分析，篩選同源基因簇，各菌株編號、來源、分離時間、登錄號等見表5。來自馬拉維的菌株CFBP4642沒有找到XmeRSA基因簇，copTAB序列和XamGX11序列同源性為83.7%，3個預(yù)測基因氨基酸序列同源性分別為59%、88%和64%。其余菌株中，來自烏干達(dá)的10個（UG21，UG23，UG24，UG27，UG28，UG39，UG43，UG44，UG45和UG51）、巴西的5個（IBSBF278，IBSBF2538，IBSBF2539，IBSBF2818和LMG784）、哥倫比亞的7個（UA303，UA306，UA323，UA536，UA556，UA560和UA686）以及其它地區(qū)的9個（AT6B，ORST17，ORSTX27，Xam672，Xam678，AFNC1360，ThaiXam，Xam668和Xam1134），共31個菌株的copTAB、XmeRSA的序列和XamGX11一致，另外UA324的copTAB、NG1的XmeRSA的序列也和XamGX11一致。來自尼日利亞的IBSBF285的XmeRSA基因簇僅在非編碼區(qū)存在1 nt的差異，而編碼區(qū)和XamGX11序列完全一致。另外7個菌株的copTAB和2個菌株的XmeRSA不完整，分析可能是測序時遇到gap區(qū)。各菌株和XamGX11相比，兩個基因簇僅存在少于4 nt和4 aa的差異。

68個菌株的copTAB基因簇中，除32個菌株和XamGX11完全一致外，IBSBF289、IBSBF356、IBSBF2345、IBSBF2346、IBSBF2665和IBSBF2667等6個來自巴西的菌株，CFBP1851、CI01、CIO151、IBSBF320、IBSBF725、IBSBF726、NCPPB1159、UA226和Xam669等9個菌株，以及IBSBF436、IBSBF1411、IBSBF2666、IBSBF2670、IBSBF2672、IBSBF2816、IBSBF2819、IBSBF2820、IBSBF2821、IBSBF2822等10個菌株之間的copTAB基因簇序列同樣完全一致。各菌株的XmeRSA基因簇中，除32個菌株和XamGX11完全一致外，CFBP1851、IBSBF289、IBSBF320、IBSBF356、IBSBF436、IBSBF614、IBSBF725、IBSBF1182、IBSBF1411、IBSBF1994、IBSBF2345、IBSBF2346、IBSBF2665、IBSBF2666、IBSBF2667、IBSBF2670、IBSBF2672、IBSBF2673、IBSBF2816、IBSBF2819、IBSBF2820、IBSBF2821、IBSBF2822、NCPPB1159和xam669等25個菌株之間完全一致。構(gòu)建了61個Xam菌株和兩個代表性菌株copLAB基因簇的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明60個菌株聚類成一個分枝，自展率為100%，和菌株CFBP4642聚成一大分支，自展率為83.7%，而Xav菌株7882和Xcc菌株A44組成另一個大分枝（圖4）。65個Xam菌株和Xc菌株IG-8的XmeRSA的系統(tǒng)發(fā)育分析表明各菌株聚類為一個分枝，自展率為100%（圖5）。

copTAB基因簇中，在不考慮預(yù)測基因不完整及菌株CFBP4642的情況下，6個菌株的copT基因和菌株XamGX11相比存在1 nt/1 aa的差異，1個菌株（IBSBF285）copB基因存在1 nt/1 aa的差異，24個菌株的copA基因存在1 nt/1 aa或2 nt/2 aa的差異。XmeRSA 2個基因簇中，僅有1個菌株（ORST4）XmeS存在3 nt/2 aa的差異，30個菌株的XmeR和XmeA存在差異，其中XmeR為2 nt、1 nt或2 nt/1 aa，而XmeA為1 nt 、1 nt/1 aa或2 nt/2 aa，另外菌株UA324的XmeA存在1 nt/1 aa的差異。

3 討論

國內(nèi)外研究表明，黃單胞等病原細(xì)菌中廣泛存在著抗銅性菌株，分析銅基殺菌劑的選擇壓是抗銅菌株增多及抗銅能力提高的重要原因。Bouzar等[21]評價了從4個加勒比海和中美洲國家的32個種植園中獲得的95個黃單胞病菌的抗銅性，發(fā)現(xiàn)90%以上菌株對硫酸銅的抗銅性高于0.8 mmol/L。Guiping等[22]收集了8個種的41個黃單胞菌株，發(fā)現(xiàn)33個菌株對1.2 mmol/L的硫酸銅具有抗性。來自加拿大安大略湖地區(qū)的98個致病力不同的黃單胞菌株中，87個對1.0 mmol/L的硫酸銅具有抗性[23]。來自非洲坦桑尼亞的30個野油菜黃單胞葉斑變種（X. campestris pv. vesicatoria）菌株中，有28個對0.8 mmol/L硫酸銅具有抗性[24]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，美國弗洛里達(dá)、墨西哥、俄克拉荷馬等地區(qū)，野油菜黃單胞葉斑變種（X. campestris pv. vesicatoria）抗銅菌株的數(shù)量隨著銅基殺菌劑的大量使用而不斷增加[25]。王君[26]用4株硫酸銅半致死濃度為100 μg/mL的地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種（X. axonopodis pv. citri）為初始菌株，用硫酸銅將其半致死濃度誘導(dǎo)提高到270 μg/mL以上。本研究發(fā)現(xiàn)來自哥倫比亞、柬埔寨、烏干達(dá)和國內(nèi)木薯主栽區(qū)的42個Xam菌株均表現(xiàn)出不同程度的抗銅性，其中4個菌株的抗銅能力高于其它菌株，這一點是否和銅基殺菌劑的施用有關(guān)，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究分析。

銅是各類生物不可獲缺的微量元素，但高濃度的銅離子對細(xì)胞具有毒性[27-28]。細(xì)菌的抗銅作用包括耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化（Resistance-nodulation-cell-division，簡稱RND）等基因家族的外排作用，陽離子擴散（CDF）基因家族的過濾作用，P型ATP酶的調(diào)控作用等不同層次的機制，包括銅離子的吸附沉積、隔離、修飾及向外轉(zhuǎn)運等[29-30]。在病原細(xì)菌中，部分抗銅相關(guān)基因還具有其它功能。西瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovorax. citrulli）的RND家族外排轉(zhuǎn)運體膜融合蛋白亞基cusB和抗銅性、胞外多糖分泌和生物膜形成等相關(guān)[31]，而多銅氧化酶（CueO）和抗銅性、胞外多糖形成以及對苦瓜的致病力相關(guān)[32]。野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（X. campestris pv. campestris）菌株Xc17的copA基因缺失后不但降低了抗銅能力，同時也降低了對卷心菜的毒力[33]。瘡痂病菌（X. gardneri）菌株Xv10的copB基因不但和抗銅性相關(guān)，而且影響著侵染番茄的能力[34]。本文研究結(jié)果表明，在完成基因組序列測定的68個Xam菌株中，除CFBP4642外，其余菌株均帶有高度同源的CopTAB和XmeRSA預(yù)測基因簇，分析其可能為內(nèi)源性。6個預(yù)測基因中，有哪些和抗銅性相關(guān)，是否還參與包括致病性在內(nèi)的其它代謝作用，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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