林茂 李進華 唐慶 王華新 廖美蘭 龍定建

摘 要 以大根唇柱苣苔葉片為外植體，以 MS為基本培養(yǎng)基，附加不同種類和濃度的激素進行組培快繁技術(shù)研究。結(jié)果表明：適宜葉片不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L，繼代增殖培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.50～3.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.20～0.30 mg/L，適宜的基質(zhì)是泥炭 ∶ 珍珠巖=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 細河沙=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 園土=2 ∶ 1。

關(guān)鍵詞 大根唇柱苣苔；組培；快繁；不定芽

中圖分類號 Q949.778 文獻標識碼 A

Abstract The leaf of Chirita macrorhiza was used as the explants and cultured on MS medium supplemented with different concentrations of plant hormones. The results showed that： the adventitious bud induction culture medium was MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L. The shoots proliferation medium was MS+6-BA 1.50-3.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L. The root induction medium was 1/2MS+IBA 0.20-0.30 mg/L. The suitable ratio of transplanting medium for peat ∶ perlite was 2 ∶ 1，peat ∶ fine sand is 2 ∶ 1，and peat ∶ soil was 2 ∶ 1.

Key words Chirita macrorhiza； tissue culture； rapid regeneration； adventitious bud

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.020

大根唇柱苣苔（Chirita macrorhiza D. Fang & D. H. Qin）為苦苣苔科唇柱苣苔屬的多年生草本植物。唇柱苣苔屬植物是苦苣苔科的一個比較突出的種群，全世界約140種或更多，中國已知的約99種，是唇柱苣苔屬植物的分布中心，集中在華南和西南巖溶山地丘陵地帶，種類分布區(qū)域十分狹窄[1]。中國擁有豐富的苦苣苔科植物資源，但被利用的種類很少。大根唇柱苣苔葉片形態(tài)多樣、花色豐富艷麗、株型緊湊美觀，符合人們對花卉追求的“新”、“奇”、“珍”、“稀”等的審美需求，具有極大的市場前景。大根唇柱苣苔長期處理野生狀態(tài)，雖然近年受到苦苣苔科植物愛好者的廣泛關(guān)注，但多數(shù)民眾對其缺乏認識，致使一直未能得到商品開發(fā)，觀賞價值也未得到充分利用。至今，有關(guān)大根唇柱苣苔的研究極少，僅在引種[2]及生理指標測定[3]上有少量涉及。為更好地推廣利用大根唇柱苣苔，充分發(fā)揮其觀賞特性，增加花卉市場的品種種類，加大其相關(guān)繁育技術(shù)研究是當前亟待解決的問題。而組培快繁技術(shù)是推進商品化進程的有效途徑之一。本試驗以大根唇柱苣苔的葉片為外植體，通過不定芽誘導(dǎo)途徑建立組培快繁技術(shù)體系，為大根唇柱苣苔商品化、規(guī)?；姆N苗繁育提供技術(shù)指導(dǎo)，也為今后的品種選育、遺傳轉(zhuǎn)化研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用植株是由廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院提供的野生大根唇柱苣苔。

1.2 方法

1.2.1 不定芽誘導(dǎo) 春季（3～5月份）取大根唇柱苣苔的幼嫩葉片，用洗衣粉浸泡5 min后，在流水下沖洗干凈。隨后在超凈工作臺上操作。先將葉片用75%酒精浸泡20 s后，用無菌水沖洗3遍，再用0.1%升汞浸泡葉片12 min，用無菌水沖洗3遍。最后將葉片切成1 mm×1 mm的大小，接種到添加了不同激素種類和濃度的MS培養(yǎng)基上進行不定芽誘導(dǎo)。每種培養(yǎng)基接種100片，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計葉片的誘導(dǎo)情況，并篩選出不定芽的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基是MS、1/2MS，均加4 g/L的瓊脂固化，pH5.8～6.0。其中1/2MS培養(yǎng)基中的大量元素以及白砂糖含量均為MS培養(yǎng)基的一半，其余成分及含量相同。下同。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照時間12～14 h/d，光照強度為1 500～2 000 lx。下同。

1.2.2 不定芽增殖 選取長勢、高度相對一致的不定芽，接種在添加了不同激素種類和濃度的MS培養(yǎng)基上進行不定芽的繼代增殖培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基的接種量為100株，重復(fù)3次。觀察不定芽的繼代增殖和生長情況，30 d后，統(tǒng)計新芽數(shù)，計算增殖系數(shù)，并篩選出最適宜的繼代增殖培養(yǎng)基。

1.2.3 不定根誘導(dǎo) 當組培芽高約2～3 cm時，將其接種在添加了不同激素種類和濃度的MS、1/2MS培養(yǎng)基上進行不定根的誘導(dǎo)，每種培養(yǎng)基的接種量為100株，重復(fù)3次。觀察小苗的生根及生長情況，20 d后，統(tǒng)計生根數(shù)并計算生根率，篩選出最適宜的生根培養(yǎng)基。

1.2.4 煉苗移栽 將已生根的組培苗放在自然條件下煉苗3 d，揭蓋后用少量水軟化培養(yǎng)基，再煉苗2 d。將小苗根部培養(yǎng)基冼凈后用0.5% KMnO4溶液消毒10～15 min，再移栽在不同的基質(zhì)上，澆透定根水，每種基質(zhì)移栽100株，重復(fù)3次。20 d后統(tǒng)計成活率。篩選出最適宜的移栽基質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢驗、方差分析、多重比較和統(tǒng)計計算工作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對不定芽誘導(dǎo)的影響

不同激素組合對大根唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的影響見表1。從表1可看出，A7處理的誘導(dǎo)率、不定芽數(shù)顯著高于其他處理，分別為87.33%、334.00個。A1、A2、A3處理的誘導(dǎo)率無顯著差異，并顯著低于其余處理的誘導(dǎo)率，均為0，無愈傷和不定芽組織的產(chǎn)生。A4、A5、A8、A9處理的誘導(dǎo)率無顯著差異，A6、A10、A11處理的誘導(dǎo)率無顯著差異，但這些處理在切口處有新芽產(chǎn)生，數(shù)量及大小各不相同，其中A6、A10、A11這3種處理的不定芽數(shù)顯著高于A4、A5、A8、A9的不定芽數(shù)，后4種處理的不定芽數(shù)顯著高于A1、A2、A3處理的不定芽數(shù)。由此表明，僅添加細胞分裂素的培養(yǎng)基對不定芽的誘導(dǎo)無顯著影響，將細胞分裂素與生長素配合使用，才能誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生。隨著6-BA和NAA濃度的增加，誘導(dǎo)率呈上升趨勢，當6-BA為1.00 mg/L、NAA為0.05 mg/L，誘導(dǎo)率達最大，為87.33%，且產(chǎn)生的不定芽數(shù)量很多。IAA的變化趨勢和NAA相同，但其誘導(dǎo)率均較低。說明，培養(yǎng)基上添加不同種類和濃度的激素，對大根唇柱苣苔的不定芽誘導(dǎo)的影響不同，當6-BA為1.00 mg/L、NAA為0.05 mg/L，誘導(dǎo)率達最大，即培養(yǎng)基MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L是最適宜的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（圖1）。

2.2 激素組合對繼代增殖培養(yǎng)的影響

不同激素組合對大根唇柱苣苔不定芽繼代增殖的影響見表2。從表2可看出，S5、S6、S7、S8處理的增殖系數(shù)無顯著差異，但顯著高于其余處理的增殖系數(shù)；在NAA濃度相同的條件下，隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)先增加后降低，但差異不顯著，這表明6-BA對繼代增殖的影響不顯著。在6-BA濃度相同的條件下，隨著NAA濃度的增加，植株的生長情況差異較大，低濃度的NAA植株長勢差，不定芽細弱，且伴隨玻璃化現(xiàn)象，隨著濃度的增加，長勢好轉(zhuǎn)，并且玻璃化減少，但是濃度過大長勢仍會變差。說明，適宜大根唇柱苣苔繼代增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.50～3.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L，增殖系數(shù)較高，植株長勢好，芽健壯，玻璃化極少（圖2）。

2.3 不同培養(yǎng)基及激素配比對不定根誘導(dǎo)的影響

不同IBA濃度對大根唇柱苣苔的生根影響見表3。由表3可看出，G1和G7處理的生根率無顯著差異，且顯著低于除G2以外的其他處理的生根率；G8、G9、G10、G11、G12處理的生根率無顯著差異，其中G9、G10的生根率較高，分別為90.67%、90.33%；G3、G4、G5處理的生根率無顯著差異。由此可知，在相同的基本培養(yǎng)基上，不同IBA濃度對大根唇柱苣苔的生根影響不同。在不添加IBA的培養(yǎng)基上，生根率顯著偏低；在添加了IBA的培養(yǎng)基上，生根率顯著偏高，隨著濃度的增加，生根率的增加并不顯著，但植株的生長情況有所好轉(zhuǎn)，其中，當IBA濃度為0.2 mg/L或者0.3 mg/L時，生根率較高，植株健壯，根系較多，有利于后期的移栽。說明，大根唇柱苣苔的適宜生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.20～0.30 mg/L，植株健壯，根系多（圖3、4）。

2.4 煉苗與移栽

不同移栽基質(zhì)對大根唇柱苣苔移栽的影響見表4。由表4可看出，M1、M2、M3、M4處理的成活率相互之間存在顯著差異；M5、M6、M7處理的成活率無顯著差異，成活率分別為99.00%、97.67%和95.33%，顯著高于M1、M2、M3、M4處理的成活率。由此可知，不同移栽基質(zhì)對移栽成活率的影響不同。在以單一成分的介質(zhì)為移栽基質(zhì)時，成活率較低，植株恢復(fù)慢，長勢差；當以泥炭和其他介質(zhì)混合為基質(zhì)時，成活率顯著增加，但相互之間的成活率差異不大，在這些基質(zhì)上的植株恢復(fù)快，長勢好。說明，適宜大根唇柱苣苔移栽的基質(zhì)是泥炭 ∶ 珍珠巖=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 細河沙=2 ∶ 1或者泥炭 ∶ 園土=2 ∶ 1，植株恢復(fù)快，長勢好。

3 討論

植物通過外植體誘導(dǎo)并獲得完整組培苗植株的發(fā)生途徑有不定芽、愈傷組織、器官發(fā)生、原球莖等。外植體先脫分化為愈傷組織，再由愈傷組織分化形成叢生芽，然后生根形成完整植株，這種途徑稱為愈傷組織途徑。外植體不經(jīng)過愈傷組織階段而直接脫分化產(chǎn)生器官的途徑為不定芽途徑。在現(xiàn)有的唇柱苣苔植物的組織培養(yǎng)研究中，多數(shù)都是通過不定芽途徑來獲得完整植株的[4-6]，其中有以葉片[7-10]為外植體，有以花梗、花蕾[11]為外植體，而通過種子、莖段為外植體的未獲得其完整植株[12]。以愈傷組織途徑進行相關(guān)研究不多，余海霞等[13]是以葉片通過愈傷組織途徑建立三苞唇柱苣苔的組培快繁技術(shù)，冼康華等[14]以肉質(zhì)葉為外植體建立了文采唇柱苣苔的組織培養(yǎng)和快速繁殖。本試驗以大根唇柱苣苔幼嫩葉片為外植體，通過直接誘導(dǎo)不定芽，建立了組培快繁體系，這種通過不定芽途徑獲得的植株發(fā)生變異少，能夠保持母本的優(yōu)良特性，同時還可縮短繁育進程，是優(yōu)良種苗商品化繁育的極佳途徑。

組培苗的移栽成活以及移栽后的生長狀況受基質(zhì)影響?；|(zhì)物理性質(zhì)及化學(xué)成分不同，成活率有所差異，主要原因在于這些基質(zhì)的保水性、保肥能力以及透氣性不同。本試驗發(fā)現(xiàn)，在大根唇柱苣苔的移栽過程中，基質(zhì)對移栽成活率的影響極大。單一使用某種成分的介質(zhì)作為栽培基質(zhì)時，移栽成活率顯著低于兩種成分的介質(zhì)混合成的基質(zhì)。單獨使用泥炭、珍珠巖、細河沙或者園土時的移栽成活率低，原因可能是：珍珠巖和細河沙的保水能力都較差，園土的透氣性差，而泥炭的保水性和透氣性都很好。泥炭是目前國內(nèi)外種苗生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的栽培基質(zhì)之一，疏松且富含腐殖質(zhì)。將泥炭混合其他介質(zhì)，使移栽基質(zhì)同時具有良好透氣性、保水性和一定肥力，一方面有利于通氣條件的改善，促進根系的生長，另一方面可降低生產(chǎn)成本，是大根唇柱苣苔的極佳種植基質(zhì)。

4 結(jié)論

本試驗以大根唇柱苣苔葉片為外植體，通過不定芽途徑成功建立了其組培快繁技術(shù)，其中，適宜葉片不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L，繼代增殖培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.50～3.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.20～0.30 mg/L，移栽基質(zhì)是泥炭 ∶ 珍珠巖=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 細河沙=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 園土=2 ∶ 1。

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