周巧玲　陳夢(mèng)麗

摘要主要闡述了鈉離子通道的結(jié)構(gòu)和功能、擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的作用機(jī)理，總結(jié)了中華按蚊鈉離子通道中與擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑抗性相關(guān)的kdr突變及其抗性機(jī)理，為后續(xù)中華按蚊抗性機(jī)制的深入研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞鈉離子通道；擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑；擊倒抗性；kdr突變；中華按蚊

中圖分類號(hào)S482.3+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）30-0143-03

Abstract

We introduced the structure and function of sodium channel，the mode of action of pyrethroids，identification and functional characterization of pyrethroid resistanceassociated sodium channel mutations from Anopheles sinensis，which would provide the molecular basis for further study of resistance mechanism of Anopheles sinensis to pyrethroid insecticides.

Key wordsSodium channel；Pyrethroid insecticides；Knowdown resistance；kdr mutations；Anopheles sinensis

擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑（Pyrethroid insecticides）是從天然除蟲(chóng)菊素衍生而來(lái)的一類人工合成的化學(xué)農(nóng)藥，主要以神經(jīng)鈉離子通道為作用靶標(biāo)，其因殺蟲(chóng)活性高、擊倒速度快、殺蟲(chóng)譜廣、對(duì)哺乳動(dòng)物低毒、 環(huán)境中易降解等特性而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和家庭衛(wèi)生害蟲(chóng)的防治。擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑可以作為蚊子的毒殺劑和驅(qū)避劑，能有效防治傳染病媒介——蚊子，所以世界衛(wèi)生組織推薦使用該類殺蟲(chóng)劑防治蚊子[1]。但是隨著擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥的大量使用，抗藥性問(wèn)題日益突出。蚊子作為瘧疾、登革熱等疾病的主要傳播媒介，如果其群體數(shù)量得不到有效的控制，將會(huì)給人類帶來(lái)極大的威脅，利用生物化學(xué)防治手段以切斷傳播途徑是防治疾病的重要措施。

蚊子對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的抗性主要分為代謝抗性和靶標(biāo)抗性。代謝抗性是由于蚊子代謝解毒酶活性增強(qiáng)引起的。主要由于代謝解毒酶如P450酶的代謝變強(qiáng)，P450酶具有解毒作用，通常可將脂溶性有毒物質(zhì)代謝為水溶性物質(zhì)，使有毒物質(zhì)排出體外。而靶標(biāo)抗性則是由于殺蟲(chóng)劑作用靶標(biāo)敏感性降低造成的。主要是由于電壓門控鈉離子通道氨基酸位點(diǎn)發(fā)生非同義突變，導(dǎo)致擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑和靶標(biāo)鈉通道的親和力下降[2-3]。

中華按蚊普遍分布于中國(guó)和東南亞，是中國(guó)常見(jiàn)的蚊子之一，是瘧疾的主要傳染媒介。筆者主要介紹了鈉離子通道的結(jié)構(gòu)和功能、擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的作用機(jī)理、擊倒抗性、中華按蚊中與擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑抗性相關(guān)的kdr突變及其作用機(jī)制，旨在為進(jìn)一步研究中華按蚊對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的抗性機(jī)理提供參考。

1鈉離子通道

1.1離子通道

離子通道是指由貫穿質(zhì)膜的由多亞基組成的蛋白質(zhì)，通過(guò)構(gòu)象變化而形成的調(diào)控離子跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)的門系統(tǒng)，通過(guò)門的開(kāi)閉控制離子運(yùn)轉(zhuǎn)的種類和速度。依據(jù)其活化的方式不同，離子通道可分2類：一類是電壓活化的通道，稱做電壓門控離子通道，即通道的開(kāi)放受膜電位的控制，如鈉離子通道、鈣離子通道、氯離子通道；另一類是配體活化的通道，稱做配體門控離子通道，即靠配體與膜上受體相互作用而活化的通道，如乙酰膽堿受體通道、氨基酸受體通道。鈉離子通道是所有動(dòng)物中電信號(hào)的主要啟動(dòng)鍵，而電信號(hào)則是神經(jīng)活動(dòng)和肌肉收縮等一系列生理過(guò)程的控制基礎(chǔ)，是有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑以及擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑等重要化學(xué)農(nóng)藥的作用靶標(biāo)[4]。

1.2昆蟲(chóng)鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能

昆蟲(chóng)鈉離子通道和哺乳動(dòng)物鈉離子通道類似，由1個(gè)α亞基和幾起輔助作用的亞基（TipE、TEH1-4）組成，較大的α亞基形成離子滲透孔洞，而較小的輔助亞基則起到調(diào)節(jié)通道功能和增加表達(dá)量的作用[5]。α亞基蛋白由1 800～2 500個(gè)氨基酸殘基組成，包含4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（Ⅰ～Ⅳ），每個(gè)結(jié)構(gòu)域又由6個(gè)疏水性跨膜螺旋體（S1～S6）組成，其中S1～S4組成電壓感受模塊，S5、S6以及連接于S5和S6之間的保守序列元件（P-LOOP）構(gòu)成了供鈉離子通過(guò)的孔道模塊，電壓感受模塊與孔道模塊之間通過(guò)短肽（L45）連接。S5、S6跨膜片段參與Na+親水孔道的形成，4個(gè)結(jié)構(gòu)域共8個(gè)跨膜片段形成細(xì)胞親水孔道結(jié)構(gòu)。4個(gè)P-LOOP上分別有D、E、K、A 4個(gè)氨基酸殘基，決定通道的選擇性[6]。每1個(gè)同源結(jié)構(gòu)的S4區(qū)域還包含了1個(gè)保守元件，其特征是帶正電荷的精氨酸或賴氨酸的重復(fù)序列，這些氨基酸之間分別由2個(gè)中性氨基酸隔開(kāi)，形成電壓傳感器。結(jié)構(gòu)域 Ⅲ 和 Ⅳ 之間有1個(gè)較短的保守序列片段，構(gòu)成通道的失活門，哺乳動(dòng)物中為IFM（異亮氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸），昆蟲(chóng)中為MFM（甲硫氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸）[7]。每一個(gè)結(jié)構(gòu)域都可以因?yàn)殡娮右苿?dòng)從而產(chǎn)生電流電壓，細(xì)胞去極化時(shí)，S4上的正電荷能檢測(cè)膜電場(chǎng)，使得電壓傳感器S4向膜外移動(dòng)，隨之S1、S2、S3移動(dòng)，通道的構(gòu)象發(fā)生改變，只有當(dāng)4個(gè)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)相都發(fā)生改變后，Na+跨膜通道才打開(kāi)。通道開(kāi)啟數(shù)毫秒后，S4向后移動(dòng)，隨之S1、S2、S3向后移動(dòng)，則通道關(guān)閉。鈉離子通道的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

2擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑作用機(jī)理

鈉離子通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳遞過(guò)程中起非常重要的作用，是動(dòng)作電位上升相的主要組成部分，主要通過(guò)鈉離子通道的激活和失活實(shí)現(xiàn)。正常情況下，鈉離子通道開(kāi)放數(shù)毫秒后，通道失活并關(guān)閉；但是DDT和擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑能夠抑制通道失活，延長(zhǎng)通道開(kāi)放時(shí)間，干擾鈉離子通道正常功能，造成神經(jīng)傳導(dǎo)障礙[8]。目前已知擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥在昆蟲(chóng)鈉離子通道上有2個(gè)對(duì)稱的結(jié)合位點(diǎn)，分別是結(jié)合位點(diǎn) Ⅰ （Pyrethroid binding site 1，PyR1）和結(jié)合位點(diǎn) Ⅱ （Pyrethroid binding site 1，PyR2）。以鉀離子通道為模型進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬，OReilly等[9]提出擬除蟲(chóng)菊酯結(jié)合位點(diǎn)由結(jié)構(gòu)域 Ⅱ 的S4-S5連接肽、結(jié)構(gòu)域 Ⅱ 的跨膜螺旋S5和結(jié)構(gòu)域 Ⅲ 的跨膜螺旋S6組成，即 Ⅱ L45-Ⅱ S5-Ⅲ S6組成。之后Dong實(shí)驗(yàn)室提出除了上述結(jié)合位點(diǎn)外，還存在與之對(duì)稱，但并不完全一致的結(jié)合位點(diǎn)存在，該位點(diǎn)由結(jié)構(gòu)域 Ⅰ 的S4-S5連接肽、結(jié)構(gòu)域 Ⅰ 的跨膜螺旋S5、S6和結(jié)構(gòu)域 Ⅱ 的跨膜螺旋S6組成，即Ⅰ L45-Ⅰ S5-Ⅰ S6-Ⅱ S6組成[10-11]，并且將前者稱為結(jié)合位點(diǎn) Ⅰ，后者稱為結(jié)合位點(diǎn) Ⅱ。因此，目前認(rèn)為擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑在昆蟲(chóng)鈉離子通道上的結(jié)合位點(diǎn)有2個(gè)，且2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)起作用。

3擊倒抗性

擊倒抗性（Knock down resistance，kdr）是擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑抗性的重要機(jī)制，是指鈉離子通道靶標(biāo)部位敏感度降低而對(duì)DDT和擬除蟲(chóng)菊酯產(chǎn)生的抗性。擊倒抗性的產(chǎn)生與鈉離子通道氨基酸序列發(fā)生非同義突變有關(guān)，這些氨基酸突變很可能導(dǎo)致物種對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性，因此又稱做kdr突變位點(diǎn)[12]。目前，已經(jīng)在節(jié)肢動(dòng)物害蟲(chóng)和傳染病媒介的抗性品系中發(fā)現(xiàn)50多個(gè)和擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑抗性相關(guān)的kdr突變[6]。其中一部分kdr突變已在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系中進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果表明kdr突變主要通過(guò)改變鈉離子通道門控或者減少擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑在鈉離子通道上的結(jié)合而使鈉離子通道對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的敏感性降低，從而導(dǎo)致物種對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥產(chǎn)生抗性。

4中華按蚊鈉離子通道的kdr突變

最早發(fā)現(xiàn)的kdr突變是位于結(jié)構(gòu)域 Ⅱ S6的突變位點(diǎn)L1014F（以家蠅鈉離子通道的氨基酸序列命名），該位點(diǎn)在家蠅和德國(guó)小蠊鈉離子通道中都存在[13]。隨后在岡比亞按蚊[14]、淡色庫(kù)蚊[15]、麥長(zhǎng)管蚜[16]、棉鈴蟲(chóng)[17]、小菜蛾[18]、馬鈴薯甲蟲(chóng)[19]、桃蚜[20]等物種中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)其他氨基酸突變： C、S、W、H，其中L1014F是最常見(jiàn)的，而其余4種發(fā)生的頻率不高[8]。在我國(guó)進(jìn)行中華按蚊的抗性位點(diǎn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鈉離子通道 Ⅱ S6的L1014位點(diǎn)上存在3種突變，分別是TTG（L）被TTT（F）替換、TTG（L）被TTG（F）替換、TTG（L）被TGT（C）替換。并且還發(fā)現(xiàn)早在1997年，江蘇和山東就已存在TTT（F）和TGT（C）的kdr突變，其中TTT（F）是頻率最高的突變，在中部地區(qū)河南、山東、江蘇、安徽、江西、湖北等地都發(fā)現(xiàn)了該kdr突變[21]。Yang等[22]鑒定了廣西壯族自治區(qū)9個(gè)地區(qū)中華按蚊的鈉離子通道1014位氨基酸的多樣性，結(jié)果表明除了野生型1014L外，百色市和南寧市只有1014S氨基酸突變位點(diǎn)；賀州市、貴港市和桂林市有1014F和1014C 2種突變位點(diǎn)；而玉林市、梧州市、柳州市和河池市有1014S、1014F和1014C 3種氨基酸突變位點(diǎn)，并且這些kdr位點(diǎn)的發(fā)生頻率逐年上升。另外，廣西壯族自治區(qū)桂平市的中華按蚊經(jīng)等位基因特異性PCR、PIRA-PCR、PIM-PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)L1014S、L1014F、L1014W和1個(gè)新的突變位點(diǎn)N1013S[23]。在其他國(guó)家也發(fā)現(xiàn)了這些kdr突變，例如在韓國(guó)中華按蚊中發(fā)現(xiàn)L1014F（TTT）、 L1014F（TTC）和L1014C（TGT）突變[24]；老撾、越南、哥倫比亞等地的中華按蚊中都發(fā)現(xiàn)了L1014S的突變位點(diǎn)[25]。

迄今為止，蚊子中與擬除蟲(chóng)菊酯抗性相關(guān)的kdr位點(diǎn)不如其他節(jié)肢動(dòng)物害蟲(chóng)多，埃及伊蚊中共發(fā)現(xiàn)10個(gè)kdr突變位點(diǎn)，分別是G923V、L982W、S989P、V1016G/I、I1011M/V、T1520I、F1534C和D1763Y，并且這些kdr突變位點(diǎn)常常是共同存在，且共同存在時(shí)抗性系數(shù)更高[26]，但在中華按蚊中還未檢測(cè)到類似現(xiàn)象。目前，從中華按蚊中只發(fā)現(xiàn)5個(gè)鈉離子通道突變位點(diǎn)：L1014F、L1014S、L1014W、L1014C和N1013S，所以需要大量的樣品采集，并進(jìn)行鈉離子通道的全長(zhǎng)分析，才能鑒定得到更多與擬除蟲(chóng)菊酯抗性相關(guān)的kdr突變位點(diǎn)。

5kdr突變的功能研究

抗性物種中鑒定得到的kdr突變，需要體外試驗(yàn)驗(yàn)證才能確定其是否真的使物種對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性。爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系和雙電極電壓鉗技術(shù)是研究擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑和鈉離子通道相互作用的有效手段，很多kdr突變位點(diǎn)經(jīng)該體系驗(yàn)證，表明其確實(shí)能夠降低擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑對(duì)鈉離子通道的結(jié)合力，從而導(dǎo)致擬除蟲(chóng)菊酯抗性的產(chǎn)生。L1014F位點(diǎn)最早發(fā)現(xiàn)于家蠅，之后在許多物種中均有發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)或者該位點(diǎn)的其他氨基酸突變，并且常被發(fā)現(xiàn)和其他kdr位點(diǎn)同時(shí)存在[8]。OReilly等[9]通過(guò)計(jì)算機(jī)建模，模擬鈉離子通道和擬除蟲(chóng)菊酯的結(jié)合，預(yù)測(cè)L1014位點(diǎn)位于擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑和鈉離子通道的結(jié)合位點(diǎn)。Burton等[26]將L1014F/L1014S/l1014H引入果蠅鈉離子通道，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)L1014F和L1014H使50%鈉離子通道的激活電壓往去極化方向分別移動(dòng)4和3 mV，L1014S不移動(dòng)50%鈉離子通道激活的電壓，但激活曲線的衰減卻明顯比野生型快。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三者都降低了果蠅鈉離子通道對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的敏感性，但是三者作用有差別，L1014F顯著降低果蠅鈉離子通道對(duì)氯菊酯和溴氰菊酯的敏感性；而L1014H降低果蠅鈉離子通道對(duì)溴氰菊酯的敏感性，對(duì)氯菊酯的作用則不如溴氰菊酯強(qiáng)；L1014S則對(duì)DDT產(chǎn)生很明顯的抗性。之后Du等[10-11]將L1014F/L1014S引入埃及伊蚊、德國(guó)小蠊鈉離子通道，發(fā)現(xiàn)兩者都降低了鈉離子通道對(duì)氯菊酯和溴氰菊酯的敏感性。不同物種鈉離子通道的電壓鉗試驗(yàn)都表明，L1014位點(diǎn)的突變都降低了鈉離子通道對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的敏感性，因此L1014突變被認(rèn)為是直接導(dǎo)致抗性的原因。而N1013S突變頻率很低，并且樣本少，所以對(duì)它的研究較少。

這些kdr突變?cè)诳剐晕锓N中以純合體或雜合體的形式存在，物種抗性產(chǎn)生程度也與突變位點(diǎn)的頻率有關(guān)，并且不同的氨基酸突變對(duì)殺蟲(chóng)劑的作用也有差別，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)L1014S突變頻率較低，對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑抗性影響不大，對(duì)DDT抗性影響較大；L1014C突變主要針對(duì)于溴氰菊酯而不針對(duì)于氯氰菊酯和DDT[27]。很多kdr突變并未確證是否參與抗性產(chǎn)生，因此，需要對(duì)大量突變類型的樣本進(jìn)行研究，并用電壓鉗試驗(yàn)進(jìn)行體外驗(yàn)證，結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬鈉離子通道突變體與擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的相互作用，初步揭示這些kdr突變的功能。清華大學(xué)最近發(fā)現(xiàn)第1個(gè)真核生物電壓門控鈉離子通道的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)[28]，若是以該鈉離子通道結(jié)構(gòu)模擬其與擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的結(jié)合，則能更精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)鈉離子通道和擬除蟲(chóng)菊酯的相互作用，為進(jìn)一步探索kdr突變和擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑抗性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

6結(jié)語(yǔ)

在殺蟲(chóng)劑的選擇壓力下，抗性品系的蚊子將會(huì)生存下來(lái)并繁殖出更多具有更高抗性的后代，對(duì)于殺蟲(chóng)劑特別是擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的抗性問(wèn)題，將會(huì)更加嚴(yán)重。在中華按蚊中發(fā)現(xiàn)的與抗性相關(guān)的kdr突變并不多，因此，需要收集更多的抗性按蚊，對(duì)整個(gè)鈉離子通道基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，而不只是對(duì)某一片段進(jìn)行檢測(cè)，從而發(fā)現(xiàn)新的kdr突變。按蚊kdr突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行功能驗(yàn)證將為人們研究擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的作用位點(diǎn)以及擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)理提供有力的分子水平上的依據(jù)。

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