王微微　高麗麗　王小敏　徐運娥　周安

摘要[目的] 探討草魚腸道菌群與草魚個體大小之間的相關(guān)性。[方法] 采用DGGE方法對同一批孵化并在同一池塘中養(yǎng)殖的個體大小顯著差異的草魚腸道樣品進行分析。[結(jié)果] 無論大個體草魚還是小個體草魚，其腸道優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門和變形菌門，但2組草魚在其腸道菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性等方面存在差異。大個體草魚腸道中存在著更多比例的厚壁菌門以及具有纖維素降解能力的細菌，而小個體草魚腸道中存在較多的潛在致病菌。[結(jié)論] 草魚腸道微生物可以作為內(nèi)在因素影響草魚的生長性能，這一結(jié)果也為進一步開發(fā)可促進草魚生長性能的益生菌奠定了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞草魚；腸道微生物；個體大?。蛔冃蕴荻饶z電泳

中圖分類號S917文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）33-0153-05

Study on the Correlation in Grass Carp （Ctenopharyngodon idella） between Intestinal Microbiota and Body Size

WANG Weiwei，GAO Lili，WANG Xiaomin et al

（Teching and Research Office of Microbiology， Zunyi Medical University， Zunyi， Guizhou 563000）

Abstract[Objective] This study assessed the correlation in grass carp （Ctenopharyngodon idella） between intestinal microbiota and body size. [Method] The bacterial community structures in the intestinal content and mucosa of the two groups of grass carp with the different body size were revealed by PCRDGGE fingerprinting. [Result] The phyla Firmicutes and Proteobacteria were dominant in grass carp intestine independent of the body size. However， the DGGE profiles and sequence analysis of grass carp in fast growing group and slow growing group showed the differences in structure and diversity of intestinal bacterial communities between the two groups. The fast growing grass carp was associated with phylumlevel changes in the bacterial community. The relative proportion of Firmicutes was higher in fast growing ones， and more bacteria previously reported to degrade cellulose were only present in this group. Conversely， slow growing grass carp may have more population of potentially pathogenic bacteria， which might affect the growth performance of host. [Conclusion] These findings preliminarily demonstrated the intestinal microbiota could be an important internal factor affecting body size of grass carp. This research will facilitate the next step in investigating the beneficial bacteria which could improve the growth performance of grass carp.

Key wordsGrass carp （Ctenopharyngodon idella）；Intestinal microbiota；Body size；Denatured gradient gel electrophoresis （DGGE）

魚類的體表和體內(nèi)均有微生物的存在，消化道作為營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的場所，其中定殖了數(shù)量巨大、種類繁多的微生物。在長期的進化過程中，微生物、腸道與宿主三者之間建立了共生的關(guān)系，并且研究認為腸道微生物是宿主機體重要的“微生物器官”[1]。微生物在魚類腸道中從無到有的定殖是一個復(fù)雜的過程，其群落組成受到很多因素的影響，比如宿主種類、發(fā)育過程、餌料類型、環(huán)境因素等[2-5]，這些在魚類腸道中定殖的微生物能夠在宿主的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、病原防御和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。在促進宿主的營養(yǎng)代謝方面，腸道微生物既可以作為營養(yǎng)來源供宿主利用，也可以產(chǎn)生一些酶促進宿主對食物的消化，從而使宿主獲得有利于自身生長發(fā)育和維持健康所需的能量。由此可見，腸道微生物已成為影響宿主代謝、能量獲得以及生長性能等的一個重要因素[6]，可以通過分析具有生長性能差異的宿主腸道微生物組成特點，獲得更有益于宿主生長健康的微生物種類。

早期對小鼠和人的研究便已證實腸道微生物與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的腸道中擁有數(shù)量較多的厚壁菌門（Firmicutes）和較少的擬桿菌門（Bacteroidetes），并且肥胖個體的腸道菌群獲取能量的能力更強，從而有利于單糖的吸收和甘油三酯在脂肪細胞中儲存[7-8]。有關(guān)魚類的研究，早在20世紀90年代Ring等[9]就發(fā)現(xiàn)生長速度不一樣的北極紅點鮭腸道微生物組成具有差異性。Sun等[10]僅在生長快的斜帶石斑魚腸道中發(fā)現(xiàn)了對弧菌具有拮抗作用的幾種細菌，說明生長快的個體腸道中擁有更有益的微生物群。隨后的研究發(fā)現(xiàn)魚類腸道優(yōu)勢菌群擬桿菌門和厚壁菌門的豐度以及兩者組成比例也同樣會影響魚類生長速度和個體大小[11-13]。這些研究對于水產(chǎn)養(yǎng)殖特別是經(jīng)濟魚類的養(yǎng)殖十分重要，因為養(yǎng)殖過程中魚類出現(xiàn)較大的個體生長差異將會顯著地降低養(yǎng)殖產(chǎn)量，使魚類養(yǎng)殖業(yè)承受很大的負面影響[9]。

草魚（Ctenopharyngodon idella）是典型的草食性魚類，廣泛地分布于全國各地，因其易飼養(yǎng)、生長快、群體產(chǎn)量高，已成為淡水養(yǎng)殖的當家品種之一。草魚相關(guān)生物學參數(shù)的研究結(jié)果顯示，草魚腸道全長與體長的比值（比腸長）不高（僅為2.13），食物在草魚腸道內(nèi)停留時間為4～18 h[14-16]，表現(xiàn)出魚類自身消化道短且食物在其中停留時間短的特點，將會導(dǎo)致食物消化不完全，從而影響草魚對營養(yǎng)成分的充分吸收[17]。草魚腸道中微生物會促進宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，因而充分了解其腸道微生物群落組成顯得十分重要。已有研究發(fā)現(xiàn)草魚腸道優(yōu)勢菌群為變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門和擬桿菌門[18-19]。這些腸道微生物在草魚營養(yǎng)代謝方面發(fā)揮了重要的作用，如具有降解纖維素能力的弧菌屬（Vibrio）、芽胞桿菌屬（Bacillus）和腸桿菌屬（Enterobacter）等細菌[20-23]；此外，Wu等[18]發(fā)現(xiàn)草魚腸道中具有潛在多糖分解能力的厭氧芽胞桿菌（Anoxybacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium）等細菌。盡管有較多關(guān)于草魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，但是，草魚個體大小差異是否與腸道微生物組成有關(guān)的研究依然欠缺，而分析這些草魚個體的腸道微生物組成將為深入揭示腸道益生菌的作用機理、腸道微生物群落與草魚生長性能的關(guān)系等提供更為豐富的資料。

在草魚養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，同一養(yǎng)殖池塘中同批次的二齡草魚出現(xiàn)了大小分化的社會等級現(xiàn)象，同一池塘中既有個體大的草魚，也有個體小的草魚，且個體大小差異顯著。筆者擬采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）的方法研究同一養(yǎng)殖池塘中個體大小差異顯著的草魚腸道微生物，建立其腸道微生物的DGGE指紋圖譜，分析草魚腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，以期從腸道微生物的角度探討引起草魚生長差異的原因，旨在為開發(fā)促進草魚消化吸收的飼用微生物添加劑以及健康生態(tài)養(yǎng)殖等提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

該試驗所用草魚均來自湖北省石首市老河長江“四大家魚”國家級原種場。在同一養(yǎng)殖池塘中，對二齡草魚進行采樣，分別采集大個體草魚和小個體草魚各5尾。同時，采集草魚養(yǎng)殖池塘中水體的底泥樣品。

1.2試驗方法

按照無菌操作對草魚進行處理，使用75%乙醇對魚體表面消毒，并按無菌操作取每組5尾草魚的腸道，參照Ring等[24]的方法取草魚腸道的內(nèi)容物和腸道黏膜樣品，分別混合均勻。

1.2.1基因組DNA提取。

草魚腸道內(nèi)容物和腸道黏膜細菌總DNA的提取，采用細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（百泰克，北京），具體步驟完全參照試劑盒說明書。將提取后的總DNA用1%瓊脂糖檢測，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

水體微生物總DNA的提取，利用高速離心的方法富集樣品中細菌后，采用改良的CTAB法提取細菌基因組；底泥微生物總DNA的提取，主要參照Zhou等[25]基于SDS的土壤微生物總DNA提取的方法。水體和底泥樣品中微生物總DNA提取后，均放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.216S rDNA PCR擴增。

將草魚、水體和底泥各樣品的菌群基因組DNA進行巢式PCR[26]，即進行2輪PCR。第一輪PCR采用細菌16S rDNA的通用引物27F和1492R進行擴增，擴增產(chǎn)物稀釋100倍作為第二輪PCR的模板，第二輪PCR使用引物U968-GC和L1401擴增細菌16SrDNA的V6～V8可變區(qū)。該試驗所使用的引物序列見表1。

第二輪PCR反應(yīng)體系（終體積25 μL）：1 μL模板、0.2 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP、1×Ex Taq緩沖液、1.25 U Ex Taq DNA聚合酶，滅菌超純水補足到25 μL。PCR擴增在TC-512梯度PCR儀中進行，每個樣品做3個平行對照。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢驗，將每個樣品的3個平行PCR產(chǎn)物充分混合用于DGGE分析。

1.2.3變性梯度凝膠電泳（DGGE）及指紋圖譜分析。

DGGE圖譜構(gòu)建使用Bio-Rad Dcode突變檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，US）完成。具體方法：聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%，變性梯度范圍為40%～60%，電泳緩沖液為1×TAE。電泳條件：電泳溫度為60 ℃，130 V電壓預(yù)電泳10 min，80 V電壓電泳16 h。電泳結(jié)束后，銀染并使用白光投射儀對凝膠成像。DGGE凝膠圖譜使用Quantity One分析軟件（Quantity One 46.2，Bio-Rad）進行標化處理，并進行相似性分析。聚類分析使用XLSTAT 7.5.2軟件，并應(yīng)用UPGMA算法進行。此外，使用軟件Canoco for windows 4.5對各樣品進行PCA主成分分析。

45卷33期王微微等腸道菌群與草魚個體大小相關(guān)性研究

1.2.4DGGE凝膠條帶切膠回收和克隆測序。

將DGGE凝膠圖譜上的共性條帶和特異性條帶用滅菌的手術(shù)刀切割下來，條帶回收參照Brunvold等[27]的方法并略有修改，即將切下的條帶浸泡于100 μL的滅菌超純水，于30 ℃放置數(shù)小時后，4 ℃過夜。參考Sekiguchi等[28]的方法構(gòu)建DGGE凝膠回收條帶的隨機克隆文庫，取1 μL為模板，使用引物U968/L1401，按照“1.2.2”的PCR反應(yīng)體系和條件再次擴增16S rDNA的V6～V8可變區(qū)。每個條帶樣品做3個平行，并將其PCR產(chǎn)物混合和純化。PCR純化產(chǎn)物與pMD-18T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，用氨芐青霉素抗性平板隨機挑選陽性克隆并測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中對比分析。最后，在MEGA4.0軟件中，根據(jù)Kimura-two-parameter model遺傳距離模型[29]，使用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.12組草魚體長、體質(zhì)量基本信息

該試驗采集的2組草魚，大個體的5尾草魚體長平均為（31.7±1.1）cm，體質(zhì)量平均為（403.2±48.8）g；小個體的5尾草魚體長平均為（17.8±0.7）cm，體質(zhì)量平均為（62.2±18.6）g。T檢驗結(jié)果顯示，2組草魚樣本的體長和體質(zhì)量在統(tǒng)計學上均存在顯著性差異（P<0.001）。

2.2草魚腸道以及水體和底泥菌群的DGGE指紋圖譜

對大個體草魚和小個體草魚腸道的內(nèi)容物和黏膜微生物以及水體和底泥微生物的16S rDNA V6～V8可變區(qū)片段進行PCR擴增，構(gòu)建了菌群多樣性DGGE指紋圖譜，結(jié)果如圖1所示。指紋圖譜不同泳道的條帶數(shù)目和強度以及條帶的遷移率都表現(xiàn)出一定的差異性，說明各樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。條帶的位置不同代表不同的細菌；條帶的亮度反映了細菌相對生物量的多少；條帶的多少直觀地說明了樣品中細菌群落的多樣性。由DGGE指紋圖譜可以看出，除了在每個泳道中均存在的1個條帶之外，各樣品泳道呈現(xiàn)不同條帶，表現(xiàn)出菌群組成的差異（圖1A）。

2.3各樣品菌群的多樣性分析和聚類分析

草魚、水體和底泥各樣品DGGE條帶分析顯示，2組草魚腸道樣品的物種豐富度均不低于10，水體樣品的物種豐富度較高（21），而底泥樣品豐富度最低。Shannon指數(shù)H顯示，最高值為水體樣品，而2組草魚的腸道樣品高于2.28（表2）。

基于各樣品的DGGE指紋圖譜，根據(jù)各泳道條帶豐富度計算Dice相似性系數(shù)，對草魚腸道、水體和底泥樣品進行UPGMA分析后，結(jié)果顯示草魚的腸道內(nèi)容物樣品聚為一支，而草魚腸道黏膜樣品聚為一支（圖1B）。PCA主成分分析結(jié)果也顯示了大個體草魚和小個體草魚的腸道內(nèi)容物樣品聚在一起，2組草魚的腸道黏膜樣品聚在一起，說明草魚腸道黏膜和內(nèi)容物菌群組成有一定的差異性。此外，PCA主成分分析結(jié)果又顯示草魚腸道樣品各聚在一起，且都與環(huán)境樣品（底泥和水體）區(qū)分開，表明2組草魚的腸道微生物組成差異性可能是由底泥和水體環(huán)境之外的因素造成的（圖1C）。

2.4草魚腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)

使用RDP的Classifier工具對DGGE指紋圖譜中各樣品泳道割膠的25條條帶（圖1A）構(gòu)建的克隆文庫測序結(jié)果進行分析，并對草魚腸道樣品的DGGE條帶的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。大個體和小個體草魚的腸道菌群主要組成為變形桿菌門和厚壁菌門。同樣地，養(yǎng)殖環(huán)境水體（W）和底泥（S）的菌群也主要由這兩大類的細菌組成。其中，大個體草魚的腸道黏膜（BM）菌群包括變形菌門中的α-變形桿菌（5.26%）、β-變形桿菌（10.53%）、γ-變形桿菌（26.32%）和δ-變形桿菌（526%），以及厚壁菌門（36.84%）和疣微菌門（Verrucomicrobia）（15.79%）；大個體草魚的腸道內(nèi)容物（BC）菌群由變形菌門中α-變形桿菌（20%）和γ-變形桿菌（20%），以及放線菌門（Actinobacteria）（20%）和厚壁菌門（40%）組成；小個體草魚的腸道黏膜（SM）的細菌群落組成由γ-變形桿菌（60%）和厚壁菌門（30%），以及一類分類尚不明確的細菌（10%）構(gòu)成；小個體草魚的腸道內(nèi)容物（SC）菌群包括厚壁菌門（50%），梭桿菌門（Fusobacteria）（12.5%），疣微菌門（12.5%）和變形菌門（12.5%）和一類無法分類的細菌（125%）。進一步通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST工具對各樣品的DGGE切膠條帶的序列信息分析，結(jié)果顯示其中多數(shù)條帶的序列信息與已有數(shù)據(jù)庫中未經(jīng)分離純培養(yǎng)的細菌（uncultured bacterium）相似。

3討論

草魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，草魚腸道微生物的研究較多且主要集中在草魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)以及纖維素水解相關(guān)微生物分類培養(yǎng)、不同環(huán)境因素對草魚腸道微生物群落的影響等，但是缺少關(guān)于草魚個體大小與草魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)之間關(guān)系的研究[4，18，22，23，30]。在草魚池塘養(yǎng)殖過程中，發(fā)現(xiàn)同一池塘中草魚出現(xiàn)了大小個體分化的社會等級現(xiàn)象。通過DGGE方法對大個體和小個體2組草魚的腸道微生物分析后，發(fā)現(xiàn)2組草魚的腸道微生物組成存在一定的差異，且差異的產(chǎn)生與環(huán)境（水體和底泥）因素無關(guān)。

以往研究發(fā)現(xiàn)在投喂不同餌料、不同養(yǎng)殖環(huán)境和模式下的草魚腸道優(yōu)勢菌群都是變形菌門和厚壁菌門[18-19，31-32]，而且這2個細菌類群與宿主代謝因素有著重要的關(guān)系[11]。與這些研究相同的是，該研究的2組草魚腸道微生物群落由變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、放線桿菌門和疣微菌門組成，并且變形菌門和厚壁菌門也為2組草魚腸道的優(yōu)勢菌群，這一結(jié)果說明宿主遺傳結(jié)構(gòu)是腸道微生物形成和群落結(jié)構(gòu)組成的一個重要影響因素[3]。然而，基于DGGE指紋圖譜的UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，草魚腸道黏膜菌群和內(nèi)容物菌群在其結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出一定的差異性，其中草魚腸道黏膜菌群中超過80%的細菌屬于厚壁菌門和變形菌門，然而2門類的細菌在草魚腸道內(nèi)容物菌群中所占比例下降，這種差異性可能與腸道不同部位菌群發(fā)揮作用的差異性有關(guān)，如黏膜菌群更貼近于腸道上皮細胞，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的交換[33]。

該研究DGGE指紋圖譜的多樣性分析顯示，2組草魚腸道黏膜菌群的物種豐度和多樣性均存在差異，這種差異的產(chǎn)生可能與小個體草魚長期處于不同的社會等級以及受到環(huán)境脅迫和攝食壓力有關(guān)，因為規(guī)格較大的魚類個體往往會優(yōu)先搶占食物資源和更好的生活空間[34]。DGGE條帶測序結(jié)果顯示，大個體草魚的腸道黏膜菌群擁有更高比例的厚壁菌門，這可能與厚壁菌門的細菌能夠促進腸上皮細胞的吸收且涉及到宿主能量平衡有關(guān)[35]，同時該類細菌也具有高效的多糖發(fā)酵能力[11]。此外，在同一養(yǎng)殖池塘中，大個體草魚作為等級地位較高的優(yōu)勢者，可能會搶占食物資源并抑制小個體草魚攝食行為，這就可能造成小個體草魚營養(yǎng)攝入不足，從而導(dǎo)致小個體草魚腸道黏膜菌群中厚壁菌門比例減少[36]。

從2組草魚腸道黏膜和內(nèi)容物菌群的具體組成情況來看，放線菌僅存在于大個體草魚腸道中，由于放線菌是一類能夠在草魚腸道中起到分解纖維素作用的細菌[18]，因而大個體草魚會具有較強的纖維素消化降解能力，從而獲取更多的能量。相對于大個體草魚而言，小個體草魚腸道中存在著較多比例的氣單胞菌（Aeromonadaceae）和假單胞菌（Pseudomonadaceae）種類。氣單胞菌是一類常見的魚類潛在致病菌，可以引起魚類多種疾病的發(fā)生，影響魚類個體的生長發(fā)育[37]；而假單胞菌中的一些種類也可以引起魚類疾病，如草魚的赤皮病[38]。由此可見，小個體草魚的腸道中存在較多比例的潛在病原菌可能是造成其生長速率低的一個因素。

4結(jié)論

草魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)會因草魚個體大小差異而有所不同，說明在相同的養(yǎng)殖環(huán)境下腸道微生物作為內(nèi)在因素影響草魚的生長性能。該研究結(jié)果也從腸道微生物的角度說明草魚分級養(yǎng)殖和輪捕輪放模式既可以防止不同規(guī)格草魚搶食能力不同而導(dǎo)致生長速度的不同，又可以避免因長期處于饑餓脅迫引起魚類消化酶的降低[39-40]。此外，該研究結(jié)果顯示大個體草魚腸道中可能存在更多有助于其營養(yǎng)代謝的微生物，如果能夠從中分離到相關(guān)微生物并探討其在草魚腸道中發(fā)揮的功能，將有助于開發(fā)促進草魚消化吸收以及提高其生長性能的益生菌。

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