劉清鈺　莫華　楊海波

摘要[目的]研究飽和CO2對亞心形扁藻生長及細胞內(nèi)、外碳酸酐酶活性的影響。[方法]在每個光周期的光照階段開始時通入CO2至飽和，在每個光周期的黑暗階段結(jié)束時取樣測定亞心形扁藻細胞的生物量、葉綠素含量及碳酸酐酶比活性。[結(jié)果]與未通入CO2的對照組相比，通入CO2至飽和時亞心形扁藻的適應(yīng)期縮短，進入生長期后生物量增加明顯，至培養(yǎng)結(jié)束時的生物量、葉綠素a和葉綠素b含量、細胞內(nèi)外碳酸酐酶、總碳酸酐酶比活性分別是對照組的1.19、1.75、1.66、1.32、1.26、1.43倍。[結(jié)論]在培養(yǎng)體系中通入CO2至飽和時，亞心形扁藻通過提高細胞內(nèi)、外碳酸酐酶的活性來保持高光合作用效率，促進自身生長繁殖。

關(guān)鍵詞CO2 ；亞心形扁藻；生長；碳酸酐酶

中圖分類號S963.21文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）31-0061-04

Abstract[Objective] To study the effects of saturated CO2 on the growth of Platymonus subcordiformis and the activities of intracellular and extracellular carbonic anhydrases. [Method] CO2 was bubbled to saturate at the beginning of light phase of every light cycle， and then， the biomass， the chlorophyll content and the carbonic anhydrase specific activity of P.subcordiformis were determined at the end of dark phase of every light cycle. [Result] Compared with the control group without bubbling CO2， the lag phase of growth shortened， and the biomass increased obviously during the fast growing period in the medium with bubbling CO2. meanwhile， the biomass of P. subcordiformis， the contents of chlorophyll a and b， and the activities of intracellular， extracellular and total carbonic anhydrases were 1.19， 1.75， 1.66， 1.32， 1.26 and 1.43 times of those in the medium without bubbling CO2， respectively. [Conclusion]When the medium was saturated by CO2， P.subcordiformis kept high photosynthetic efficiency to grow fast by increasing the activities of intracellular and extracellular carbonic anhydrases.

Key wordsCarbon dioxide；Platymonus subcordiformis；Growth；Carbonic anhydrase

化石燃料的大量使用不僅導(dǎo)致能源資源日漸枯竭，而且產(chǎn)生的大量溫室氣體導(dǎo)致全球氣候變暖、生態(tài)環(huán)境惡化，在我國，這種影響尤其嚴重。由于CO2占整個大氣溫室效應(yīng)氣體排放的 68%以上，對溫室效應(yīng)貢獻最大，因此，控制和降低CO2排放成為應(yīng)對全球氣候變暖的重要舉措，是當(dāng)前世界各國政府、企業(yè)界、學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點之一[1-2]。

海洋微藻光合效率高、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性強，直接利用光合作用捕捉和固定CO2形成自身有機物質(zhì)，同時產(chǎn)出高附加值的蛋白質(zhì)、淀粉、糖類和脂類等[3-4]。碳酸酐酶是一種含Zn的金屬酶，能夠促進CO2和HCO3-的相互轉(zhuǎn)化，在藻類光合固碳中起著重要作用。一方面，利用轉(zhuǎn)運子通過質(zhì)膜主動轉(zhuǎn)運HCO-3進入胞液，再通過細胞內(nèi)碳酸酐酶將HCO-3 轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2；另一方面胞外碳酸酐酶催化細胞表面的HCO-3 轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2， CO2以自由擴散方式進入細胞內(nèi)。 經(jīng)過胞內(nèi)和胞外碳酸酐酶的共同作用保持細胞內(nèi)有穩(wěn)定濃度的CO2供給核酮糖-1，5-二磷酸羧化/氧化酶活性位點， 以維持較高的光合作用效率[5-6]。

亞心型扁藻（Platymonus subcordiformis）是一種海產(chǎn)光合自養(yǎng)浮游微藻，對環(huán)境適應(yīng)性強，光合效率高，生長繁殖快，富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，是水產(chǎn)動物育苗過程中廣泛使用的優(yōu)質(zhì)餌料，并在醫(yī)藥保健和生物能源等方面有廣闊的開發(fā)潛力[7-8]。筆者研究飽和CO2對亞心形扁藻生長及細胞內(nèi)外碳酸酐酶活性的影響，分析亞心形扁藻對飽和CO2的吸收轉(zhuǎn)化能力，旨在為開發(fā)利用亞心形扁藻吸收轉(zhuǎn)化工業(yè)排放CO2的研究提供理論參考。

1材料與方法

1.1藻種來源

亞心型扁藻（Platymonus subcordiformis）藻種為大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院海洋微藻課題組保存。

1.2儀器和藥品

EL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，80-2離心沉淀機（上海榮泰生化工程有限公司），LD5-2A臺式離心機（北京醫(yī)用離心機廠），UV-5200型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），HH-S恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠），pHS-2C型精密酸度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；無水乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），巴比妥（上海篤瑪生物科技有限公司），巴比妥鈉（上海篤瑪生物科技有限公司），均為分析純。

1.3試驗方法

1.3.1微藻培養(yǎng)及CO2通入。

取5 L錐形瓶，分別加入2 700 mL滅菌海水（pH=8.12）和900 mL處在對數(shù)生長期的亞心形扁藻藻液（A650 nm=0.117），按1‰的比例加入2.7 mL康維方營養(yǎng)液[9]。在25 ℃、2 100 lx、光暗比為12∶12的條件下培養(yǎng)亞心形扁藻。每天光照階段開始和光照階段結(jié)束時各搖瓶1次。

根據(jù)亨利定律，常壓下25 ℃時CO2在純水中的溶解度為1.24×10-5 mol/L，pH=5.67[10]。為研究海水中CO2溶解量最大（CO2飽和）時亞心形扁藻生長及碳酸酐酶活性的變化，以此為依據(jù)向亞心形扁藻培養(yǎng)體系中通入CO2至pH恒定不變時（說明CO2飽和，此時pH= 6.02），停止通入。

每天在光照階段開始時向亞心形扁藻培養(yǎng)液中通入CO2至pH不變，開始12 h光照，再繼續(xù)12 h黑暗，如此反復(fù)，直至培養(yǎng)結(jié)束。以未通CO2的滅菌海水中接種的亞心形扁藻培養(yǎng)液為對照。每組試驗3個平行樣。

1.3.2測定指標。

為探究飽和CO2對亞心形扁藻生長和碳酸酐酶活性的影響，自亞心形扁藻接種培養(yǎng)開始，每24 h取培養(yǎng)液500 mL，用于測定生物量、pH、細胞葉綠素含量和細胞內(nèi)外的碳酸酐酶活性。

1.3.2.1生物量測定。預(yù)試驗中，用UV-5200型紫外可見分光光度計進行全波長掃描，確定亞心形扁藻培養(yǎng)液的最大吸收波長為650 nm。試驗過程中，從每次在所取的500 mL培養(yǎng)液中再取10 mL，于650 nm波長處測定藻液的吸光值，以間接反映亞心形扁藻細胞的生長情況，測完后的藻液放回所取的培養(yǎng)液中。平行測定3次。

1.3.2.2pH測定。從每次取的500 mL培養(yǎng)液中取出30 mL，用pHS-2C型精密酸度計測定pH，測完后的藻液仍放回所取的培養(yǎng)液中。平行3次。

1.3.2.3葉綠素含量的測定。參照文獻[8]的方法，將測完吸光度和pH的培養(yǎng)液（495 mL），于3 000 r/min離心3 min，棄上清液，收集藻泥，分成3份，1份用于測定葉綠素，另外2份用于測定細胞內(nèi)、外的碳酸酐酶活性。將用于測定葉綠素的藻泥用去離子水清洗3次后按質(zhì)量平均分成3份，用85%乙醇提取葉綠素，并測定提取液在波長649和665 nm處的吸光度值。按照公式（1）、（2）分別計算待測液中葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量濃度，按照公式（3）計算亞心形扁藻細胞內(nèi)的葉綠素含量。

Ca=13.95A665 nm=6.88A649 nm （1）

Cb=24.96A649 nm=7.32A665 nm （2）

式中，Ca、Cb分別為待測液中葉綠素a、葉綠素b的質(zhì)量濃度（mg/L）；A649、A665 nm分別為649、665 nm處的吸光度值。

葉綠素含量（濕質(zhì)量）（mg/g）=CV/m （3）

式中，C為葉綠素a或b的質(zhì)量濃度（mg/L）；V為提取液體積（L）；m為濕藻泥質(zhì)量（g）。

1.3.2.4細胞內(nèi)、外碳酸酐酶活性的測定。參照wilbur-Anderson法[11]測定碳酸酐酶活性。取上述操作中獲得的另外2份藻泥，首先將其中的1份按質(zhì)量平均分成3份，立即懸浮于pH為8.30的12 mL巴比妥-巴比妥鈉緩沖溶液中，再加入6 mL在4 ℃冷藏的CO2飽和蒸餾水，用pH計測量反應(yīng)體系的pH變化，記錄pH從8.30降至7.30時所需的時間t1，測定細胞外碳酸酐酶活性，取平均值。將另外一份藻泥凍融4次破碎細胞后，再按質(zhì)量平均分成3份，重復(fù)胞外碳酸酐酶活性的測定過程，用于測定細胞總的碳酸酐酶活性，取平均值。按照下式計算碳酸酐酶活性：

碳酸酐酶活性（濕質(zhì)量）（EU/g）=10×（t0/t1-1）/m （4）

式中，t0為反應(yīng)體系未加藻泥時pH下降所用的時間（min）；t1是反應(yīng)體系中加入藻泥后pH下降所用的時間（min）；m為濕藻泥質(zhì)量（g）。

細胞內(nèi)碳酸酐酶比活性（濕質(zhì)量）（EU/g）=細胞總碳酸酐酶比活性-細胞外碳酸酐酶比活性 （5）

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與方法

試驗數(shù)據(jù)用Excel進行統(tǒng)計及處理。在采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析的基礎(chǔ)上進行Duncan多重比較，顯著水平為P<0.05。

2結(jié)果與分析

2.1飽和CO2對亞心形扁藻培養(yǎng)液pH的影響

按照上述方法，在滅菌海水（pH=8.12）中接種處于對數(shù)生長期的亞心形扁藻藻液（A650 nm=0.117），從培養(yǎng)開始時計時每隔24 h測定培養(yǎng)液的pH，并與未通入CO2的對照組進行比較，結(jié)果見表1。

由表1可知，培養(yǎng)時間為0～144 h時，未通入CO2的亞心形扁藻培養(yǎng)液pH從8.12上升到8.26。自開始培養(yǎng)至24 h時pH有顯著差異（P<0.05），自培養(yǎng)24 h至試驗結(jié)束，pH差異不顯著（P>0.05），說明亞心形扁藻通過光合作用吸收的CO2和通過呼吸作用釋放的CO2基本處于平衡狀態(tài)；而在每日光照開始時通入CO2至飽和（pH=6.02）的亞心形扁藻培養(yǎng)液，自培養(yǎng)開始至結(jié)束，pH逐日升高，每日差異顯著（P<0.05），且顯著低于未通入CO2的亞心形扁藻培養(yǎng)液（P<0.05）。通入CO2至飽和的亞心形扁藻培養(yǎng)液，pH自開始時的6.02上升至結(jié)束時的7.65，明顯低于未通CO2的對照組（8.12～8.26）。這一方面說明通入CO2能降低培養(yǎng)體系的pH，另一方面說明適宜亞心形扁藻生長的pH范圍較寬。

光合作用包括光反應(yīng)和暗反應(yīng)2個過程。亞心形扁藻通過光反應(yīng)將光能轉(zhuǎn)化為生物能（ATP）和還原勢能（NADPH），再通過暗反應(yīng)利用所轉(zhuǎn)化的生物能（ATP）及還原勢能（NADPH）將已被固定的CO2最終轉(zhuǎn)化為碳水化合物等細胞組成物質(zhì)[12]。

在開始培養(yǎng)的24 h內(nèi)，亞心形扁藻的生物量增加少，光反應(yīng)弱，轉(zhuǎn)化的生物能和還原勢能少，導(dǎo)致暗反應(yīng)對CO2的利用少，進而培養(yǎng)液的pH上升緩慢。隨著培養(yǎng)時間的延長，生物量明顯增多，光反應(yīng)增強，為暗反應(yīng)提供了更多的生物能和還原勢能，使其對CO2的利用增強，導(dǎo)致pH明顯增加。

2.2飽和CO2對亞心形扁藻生長的影響

碳是構(gòu)成細胞骨架的重要元素，該試驗中所用的康維方營養(yǎng)鹽中不含碳元素，亞心形扁藻通過光合作用的暗反應(yīng)過程將外環(huán)境提供的CO2轉(zhuǎn)化為碳水化合物等細胞組成物質(zhì)，促進生長繁殖。以培養(yǎng)液吸光度A650 nm間接反映亞心形扁藻的生物量，圖1顯示了外加CO2至飽和時亞心形扁藻培養(yǎng)液的吸光度值隨培養(yǎng)時間的變化趨勢。由圖1可見，通入飽和CO2的亞心形扁藻培養(yǎng)液，在開始培養(yǎng)的24 h內(nèi)，培養(yǎng)液的吸光度值基本沒變，表明亞心形扁藻細胞處于生長的適應(yīng)期；從24～120 h，培養(yǎng)液的吸光度明顯增加，表明亞心形扁藻進入快速生長期；在培養(yǎng)最后的24 h，培養(yǎng)液的吸光度變化不大，表明生長進入靜止期。未通入CO2亞心形扁藻培養(yǎng)液的吸光度除適應(yīng)期延長24 h外，其他2個時期基本呈現(xiàn)與通入CO2相似的變化趨勢，但吸光度明顯低于通入CO2的亞心形扁藻培養(yǎng)液。至培養(yǎng)結(jié)束時，通入飽和CO2的亞心形扁藻培養(yǎng)液的吸光度是未通入CO2的1.19倍。

表1和圖1的結(jié)果顯示，通入飽和CO2后，降低了亞心形扁藻培養(yǎng)液的pH，但經(jīng)過24 h的適應(yīng)期后，亞心形扁藻進入了快速生長期。這說明亞心形扁藻能夠?qū)⑴囵B(yǎng)液中的飽和CO2轉(zhuǎn)化為細胞組分，促進細胞分裂和繁殖，增加生物量。

2.3飽和CO2對亞心形扁藻葉綠素含量的影響

葉綠素是光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起著核心作用，其含量高低反映微藻光合作用能力的強弱。試驗測定了亞心形扁藻中葉綠素含量隨培養(yǎng)時間的變化，結(jié)果見圖2。

亞心形扁藻中主要含有葉綠素a和葉綠素b[8]。從圖2可見，隨著培養(yǎng)時間的延長，通入CO2和未通入CO2的培養(yǎng)液中，亞心形扁藻細胞的葉綠素含量均逐漸增加，但通入CO2后的藻細胞中葉綠素a和葉綠素b含量分別顯著高于未通入CO2的藻細胞中葉綠素a、b的含量，與圖1中吸光度的變化趨勢一致。這說明CO2的通入能夠促進亞心形扁藻細胞產(chǎn)生更多的葉綠素進行光合作用轉(zhuǎn)化CO2，加速細胞生長。培養(yǎng)結(jié)束時通入飽和CO2的亞心形扁藻葉綠素a和葉綠素b的含量分別是未通入CO2的1.75和1.66倍。

2.4飽和CO2對亞心形扁藻碳酸酐酶活性的影響

天然海水中CO2濃度低，為了適應(yīng)海水中低CO2環(huán)境并保持較高的光合作用效率，大多數(shù)藻類通過自身的CO2濃縮機制提高所需CO2濃度[6]。碳酸酐酶作為CO2濃縮機制的關(guān)鍵酶之一，對藻類的光合作用起重要作用[5]。圖3顯示了通入飽和CO2對亞心形扁藻細胞內(nèi)、外碳酸酐酶活性的影響。圖3顯示，除未通入CO2的胞內(nèi)碳酸酐酶活性在培養(yǎng)過程中緩慢增加外，其他5組碳酸酐酶活性均隨培養(yǎng)時間的延長呈逐漸增大至最后基本不變的趨勢。但同一培養(yǎng)時間，通入飽和CO2后的細胞內(nèi)、外及總碳酸酐酶活性均明顯高于未通入CO2的相對應(yīng)的碳酸酐酶活性，而且2個體系的胞外碳酸酐酶活性均高于各自的胞內(nèi)碳酸酐酶活性。培養(yǎng)結(jié)束時通入飽和CO2的亞心形扁藻細胞內(nèi)、外碳酸酐酶和總碳酸酐酶比活性分別是未通入CO2的1.32、1.26和1.43倍。

碳酸酐酶是一種誘導(dǎo)酶， 在 CO2和 HCO-3 相互轉(zhuǎn)化的可逆反應(yīng)中起催化作用。其活性受多種環(huán)境因素的調(diào)控， 如 CO2濃度、光照、pH、溫度及金屬元素等[5]。CO2通入水后，一部分是溶解性的CO2氣體，一部分與水發(fā)生反應(yīng)，生成HCO-3和H+，各組分所占的比例與溶液的pH有關(guān)[13]。通入CO2至飽和的亞心形扁藻培養(yǎng)液中，CO2供應(yīng)量多，培養(yǎng)液的pH由初始的6.02上升至結(jié)束時的7.65。根據(jù)式（6）[13]可計算出HCO-3所占比例相應(yīng)地由0.310上升至0953，與亞心形扁藻的生物量、葉綠素含量、細胞內(nèi)外碳酸酐酶比活性的變化趨勢一致。這說明當(dāng)體系中CO2過量時，藻細胞將產(chǎn)生更多的細胞內(nèi)、外碳酸酐酶調(diào)節(jié)HCO-3 和CO2之間的轉(zhuǎn)化，以保證光合作用的正常進行，進而促進細胞生長和葉綠素的形成。

δHCO-3=[HCO-3]C總=[H+]Ka1[H+]2+[H+]Ka1+Ka1Ka2（6）

式中，Ka1=4.5×10-7，Ka2=4.7×10-11。

未通入CO2的對照組培養(yǎng)液的pH在8.12～8.26，此時HCO-3分布系數(shù)在0.98左右，少數(shù)HCO-3通過主動轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)，再經(jīng)過胞內(nèi)碳酸酐酶轉(zhuǎn)化為CO2，多數(shù)HCO-3 通過胞外碳酸酐酶轉(zhuǎn)化為CO2進入細胞內(nèi)，確保維持穩(wěn)定的CO2流匯聚在核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶的羧化位點。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞生物量增多，更多的細胞內(nèi)外碳酸酐酶參與到HCO-3 和CO2的轉(zhuǎn)化中。

3討論

CO2是微藻光合自養(yǎng)的唯一碳源，但不同微藻所需的最適CO2含量不同，改變其含量會影響微藻生長和細胞組分的變化[3]。 范金鳳等[14]研究表明，二形柵藻（S.dimorphus）在CO2含量為10%時生長最好，此時pH為6.0～7.0。該試驗中外加CO2至飽和時，培養(yǎng)液的pH從最初的6.02上升至培養(yǎng)結(jié)束時的7.65，與其pH接近，所得結(jié)果也一致，說明亞心形扁藻也能夠利用高濃度的CO2。

該試驗中通入CO2至飽和時亞心形扁藻生物量、葉綠素含量、細胞內(nèi)外碳酸酐酶及總碳酸酐酶活性均比未通入CO2時的高，且胞外碳酸酐酶活性比胞內(nèi)碳酸酐酶活性高，這與劉洪霞[15]和夏建榮等[16]的試驗結(jié)果一致。在亞心形扁藻培養(yǎng)液中通入CO2至飽和時，部分CO2通過自由擴散方式進入細胞內(nèi)，部分CO2與水發(fā)生質(zhì)子交換反應(yīng)生成HCO-3，其中少部分HCO-3 通過質(zhì)膜主動轉(zhuǎn)運進入胞液，在胞內(nèi)碳酸酐酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2，大部分HCO-3 通過胞外碳酸酐酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2，CO2再通過擴散作用進入細胞內(nèi)。姜加偉等[17]研究認為，HCO-3 通過主動轉(zhuǎn)運以及碳酸酐酶參與CO2和HCO-3 的轉(zhuǎn)化都需要消耗能量。該試驗中通入飽和CO2時，亞心形扁藻細胞可能以消耗自身部分能量的方式調(diào)節(jié)細胞內(nèi)、外碳酸酐酶活性以保證有穩(wěn)定的CO2流供給核酮糖-1，5-二磷酸羧化/氧化酶的活性位點，維持光合作用的高效進行，進而促進生物量和葉綠素含量的增加。因為這些能量的“意外消耗”，導(dǎo)致生物量和葉綠素并未成倍數(shù)增長，這可能也是亞心形扁藻適應(yīng)飽和CO2環(huán)境的一種機制。對此，是否可通過調(diào)整光照強度和光照時間來補償這些“意外消耗”的能量以促進生物量和葉綠素含量的成倍增長，需要進一步探究。

火電廠煙道氣中的CO2一般在10%～20%[18]，若能進一步明確亞心形扁藻對飽和CO2的轉(zhuǎn)化吸收能力，將煙道氣應(yīng)用到亞心型扁藻的培養(yǎng)工藝中，不僅會為降低大氣中CO2的含量提供有效的利用途徑，而且能產(chǎn)生更多的亞心形扁藻生物量用于水產(chǎn)餌料、醫(yī)療保健、食品添加劑、精細化工品和液體燃料等領(lǐng)域。

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