肖勇 雷新濤 王永 曹紅星 石鵬 金龍飛 夏薇

摘要[目的]克隆椰子的乙酰CoA羧化酶（ACC）基因。[方法]通過已發(fā)表的椰子轉錄組注釋結果，鑒定潛在的椰子ACC基因。分析ACC基因在椰子果肉和嫩葉混合樣轉錄組中的RPKM值，同時，采用實時定量PCR技術研究5個高RPKM值的ACC基因在椰子果肉發(fā)育的不同時期的表達情況。[結果]共獲得21個椰子的ACC基因，這21個ACC基因在椰子果肉和嫩葉混合樣品中有較高的表達量，4個ACC基因（Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1）在椰子果肉發(fā)育9個月時表達量最高。[結論]該研究為解析椰子脂肪酸積累的分子機制提供了前期工作基礎。

關鍵詞椰子；轉錄組；ACC基因；實時定量PCR

中圖分類號S667.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）35-0128-02

Abstract[Objective]To clone acetyl CoA carboxylase （ACC） genes in Cocos nucifera. [Method] Based on the coconut transcriptome data， to identify potential coconut ACC genes.We examined the RPKM value of ACC genes in coconut leaf and fruit transcriptome.Realtime quantitative RTPCR was applied to test expression level of 5 ACC genes in different developmental stages of coconut fruit， which had highest RPKM value in coconut fruit.[Result]A total of 21 coconut ACC genes were identified. The 21 ACC genes showed high expression level in a mixture sample from coconut pulp. 4 ACC genes（Unigene7806，Unigene47155，Unigene7847 and CL185.Contig1） showed the highest expression during the development of the coconut pulp for 9 months. [Conclusion]These study provided basic work for elucidating the molecular mechanism of fatty acid biosynthesis of coconut.

Key wordsCocos nucifera；Transcriptome；Acetyl CoA carboxylase；Realtime quantitative PCR

椰子是一種重要的熱帶油料和水果木本作物，椰子樹全身是寶，椰子水可以飲用，椰子肉含有豐富的脂肪酸，椰子可以榨油，此外，椰子富含纖維，常被用來制作床墊。椰子在熱帶地區(qū)又被稱為“生命之樹”。椰子油的脂肪酸成分非常特殊，以中低碳鏈脂肪酸為主，特別是12碳的月桂酸，大約占椰子脂肪酸總量的50%。

脂肪酸合成的前體為乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA為底物進行連續(xù)的聚合反應，進一步合成16～18碳的飽和脂肪酸。ACC脂肪酸生物合成的關鍵酶之一在自然界中有2種存在形式：一種為多功能酶，另一種為多酶復合體。前者含有3個功能結構域，催化乙酰CoA合成丙二酰CoA，被稱為真核生物的ACC酶，而另一種形式的ACC酶可分解為不同功能的酶蛋白，如生物素羧化酶（BC）、生物素羧基載體蛋白（BCCP）、羧基轉移酶（CT）及另一個未知功能的酶，被稱為原核形式的ACC酶 [1]。目前已從硅藻、擬南芥、苜蓿、小麥、玉米、油菜、小麥和水稻中分離出ACC基因，這些ACC基因都為真核形式，它們對除草劑非常敏感，植物中ACC酶受光和酰脂CoA調節(jié)，光可能通過改變基質pH、ATP、ADP和鎂離子等參與調節(jié)酶活性，增加葉片脂類形成，從而影響脂肪酸的合成 [2-3]。

該研究依據椰子的轉錄組數據，從中鑒定椰子的ACC基因序列，采用定時定量PCR技術研究這些ACC基因在椰子果肉發(fā)育不同時期的表達變化，并研究不同時期椰子果肉脂肪酸的積累。

1材料與方法

1.1椰子ACC基因的鑒定

椰子的轉錄組數據從NCBI（the National Center for Biotechnology Information）的TSA（Transcriptome Shotgun Assembly）數據庫中下載，而擬南芥的ACC基因從TAIR（the Arabidopsis Information Resource）網站上下載，為了鑒定椰子的ACC基因，用擬南芥的ACC基因序列與椰子的轉錄組序列進行比對，比對的E值得閾值為1e-10，用預測的椰子的ACC蛋白質序列與CDD（http：//www.ncbi.nlm.gov.cdd）和PFAM數據庫（http：//pfam.sanger.ac.uk）進行對比?；诓煌锓NACC基因的氨基酸序列，采用MEGA 5.0軟件分析不同物種ACC基因的聚類關系[4-5]。

1.2椰子果肉RNA的提取

海南當地高種授粉后8、9、10、11月，分別取果肉，并采用MRIP的方法提取果肉中的RNA。

1.3逆轉錄和熒光定量PCR

將5 μL的mRNA與1 μL的Oligo（dT）18混合，加入6 μL的ddH2O，將此混合液置于水浴鍋60 ℃變性5 min，然后迅速置于冰水混合物中5 min，接著在混合液中，加入4 μL的Buffer溶液、1 μL的逆轉錄酶、2 μL的10 mmol/L dNTP和1 μL的RNA酶抑制劑，42 ℃放置1 h，然后70 ℃滅活5 min。接著將逆轉錄的溶液稀釋10倍，按照以下配制定量體系：cDNA模板2 μL、左引物（10 μmol/L）1 μL、右引物（10 μmol/L）1 μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL和ddH2O 8.5 μL。熒光定量PCR的反應程序為95 ℃ 30 s，然后40個重復單元，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。

1.4RPKM值的測定

采用Trinity軟件[6]對椰子轉錄組的短序列進行拼接，RPKM值的計算參考Mortazavi等[7]的方法。

2結果與分析

2.1椰子ACC基因的鑒定

從TAIR網站上下載擬南芥的ACC基因，用這些基因比對椰子的轉錄組序列，閾值設置為1e-10，在椰子的轉錄組中，一共有21個Unigenes與擬南芥的ACC基因具有較高的同源性，分別是Unigene47794、Unigene51833、Unigene9101、Unigene5061、Unigene9100、Unigene20855、Unigene55201、Unigene2455、Unigene24212、Unigene47795、Unigene20854、Unigene44914、Unigene44815、Unigene43715、Unigene47497、Unigene44874、Unigene48396、Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1。這些Unigenes長度最短的為Unigene44914，其基因長度為212 bp，最長的為Unigene44815，其基因長度為7 375 bp，這些基因的平均長度為1 422 bp。

2.2ACC基因在轉錄組中RPKM值分析

對這些ACC基因的RPKM值進行計算，結果顯示：這些基因在椰子嫩葉和果肉轉錄組中都有較高的表達，其中8個Unigenes在椰子嫩葉和果肉轉錄組中的RPKM值低于10，包括Unigene47794（1.931 8）、Unigene51833（1.958 2）、Unigene9101（2.389 8）、Unigene5061（2.971 3）、Unigene9100（3.111 1）、Unigene20855（5.136 6）、Unigene55201（7.153 5）、Unigene2455（9.149 8），CL185.Contig1在椰子嫩葉和果肉轉錄組中的RPKM值最高，為102.115 2。這些ACC基因的平均RPKM值為25.176 0。

2.3ACC基因在椰子果肉發(fā)育不同階段的表達分析

在椰子授粉后8、9、10、11個月分別提取果肉中RNA，并研究5個RPKM值最高的Unigenes在這4個時期的表達變化，它們分別是Unigene48396、Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1，其RPKM值分別為36.192 0、45.136 2、58.956 8、66.631 3和102.115 2。由圖1可知，Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1在椰子果肉發(fā)育的不同時期表達模式較為一致，這4個基因在椰子果肉發(fā)育9個月時，表達量最高，然而Unigene48396在椰子果肉發(fā)

育到9個月時表達量最低，在椰子果肉發(fā)育到11個月時表達量最高。這些結果暗示椰子果肉發(fā)育9個月是椰子脂肪酸合成中起始底物大量積累的時候。

3討論

該研究應用擬南芥ACC基因的序列，與椰子的轉錄組序列進行比對，鑒定了21個與擬南芥ACC基因高度同源的椰子Unigenes，并依據椰子果肉與嫩葉混合樣的轉錄組數據，對這21個ACC基因RPKM值進行計算，結果顯示：這些ACC基因在椰子果肉和嫩葉的混合樣品中有較高的表達量，根據RPKM值，篩選了5個高表達的Unigenes，并研究了這5個Unigene在椰子果肉發(fā)育4個不同時期（椰子果肉發(fā)育8、9、10、11個月）的表達量。在這5個ACC基因中，有4個ACC基因在椰子果肉發(fā)育9個月時，表達量最高。

ACC酶能催化脂肪酸合成的第一步反應，Gengenbach等[8]發(fā)現(xiàn)在黃豆發(fā)育的中期和早期，高油黃豆中ACC基因的表達量為低油黃豆中的2倍多，可見，在黃豆發(fā)育的中期和早期，ACC基因的高表達對脂肪酸的積累和含油量的積累非常重要，同時過量表達ACC基因能顯著增加植物和種子中的含油量。Ohlrogge等[9]將油菜儲藏蛋白的啟動子連接到擬南芥的ACC基因，并將其轉化到油菜中能顯著增加油菜的含油量 。Sellword等[10]通過反義表達技術抑制油菜ACC基因的表達，對轉基因油菜和野生型油菜的含油量進行調查，轉基因油菜種子含油量顯著高于野生型油菜種子的含油量。該研究表明，ACC基因在椰子果肉中有高的表達量，尤其是在椰子果肉發(fā)育早期表達量最高。

參考文獻

[1] 李昌珠，李正茂.植物脂肪酸的生物合成及其生理功能的研究進展[J].湖南林業(yè)科技，2009，36（5）：45-49.

[2] ASHTON A R，JENKINS C L D.WHITFIELD P R.Molecular cloning of two different cDNAs for malize acetylCoA carboxyl laze [J].Plant Mol Biol，1994，24（1）：35-49.

[3] ALBAN C，BALDET P，DOUCE J.Localization and characterization of two structurally different forms of acetylCoA carboxylase in young pea leaves，of which one is sensitive to aryloxy phenoxy propionate herbicides [J].Biochem J，1994，300：557-565.

[4] LARKIN M A，BLACKSHIELDS G，BROWN N，et al.Clustal W and Clustal X version 2.0 [J].Bioinformatics，2007，23（21）：2947-2948.

[5] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods [J].Mol Biol Evol，2011，28（10）：2731-2739.

[6] GRABHERR M G，HASS B J，YASSOUR M，et al.Fulllength transcriptome assembly from RNAseq data without a reference genome[J].Nat Biotechnol.2011，29（7）：644-652.

[7] MORTAZAVI A，WILLIAMS B，MCCUE K，et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptome by RNAseq [J].Nat Methods，2008，5（7）：621-628.

[8] GENGENBACH B G，SOMERS D A，WYSE D L，et al.Transgenic plants expressing maize acetylCoA carboxylase gene and method of altering oil content：6222099[P].2001-04-24.

[9] OHLROGGE.Method of increasing oil content of seeds：5925805[P].1999-07-20.

[10] SELLWOOD C，SLABAS A，RAWSTHORNE S.Effects of manipulating expression of acetyplCoA carboxylasel in Brassica napus L.embryos [J].Biochemical society transactions，2000，28（6）：598-600.