張爽　童琳　許勇　李舜　葉紅

摘要[目的]采用鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames）對(duì)牡丹籽油軟膠囊進(jìn)行安全性毒理學(xué)試驗(yàn)。[方法]試驗(yàn)選用鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100和TA102菌株，將牡丹籽油軟膠囊配制成濃度為5.0、1.0、0.2、0.04 mg/皿4個(gè)劑量，和陽性對(duì)照組（疊氮鈉、2-氨基芴、敵克松）進(jìn)行比較，觀察各菌株的回變菌落數(shù)。[結(jié)果]牡丹籽油對(duì)4個(gè)菌株誘發(fā)的回變菌落數(shù)均未超過對(duì)照組2倍，為陰性結(jié)果。[結(jié)論]牡丹籽油對(duì)鼠傷寒沙門氏菌無直接致突變作用。

關(guān)鍵詞鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)； 致突變性； 誘變； 牡丹籽油

中圖分類號(hào)TS225.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）33-0079-02

Study on Reversion Mutation Test of Peony Seed Oil Soft Capsule

ZHANG Shuang， TONG Lin， XU Yong，YE Hong* et al

（Anhui Academy of Medical Sciences， Hefei， Anhui 230061）

Abstract[Objective ]To study the safe toxicology of Peony Seed Oil Soft Capsule by Salmonella typhimurium /Mammalian Microsomal Enzyme Test （Ames）. [Method]To use Peony Seed Oil and adopt Ames test，Salmonella typhimurium TA97， TA98， TA100 and TA102 strains were selected.Sodium azide，2aminofluorene，dexon was chosen as a mutagen，respectively add 5.0，1.0，0.2，0.04 mg /dish extract，and statisticalling revertant colonies.[Result]The number of revertant colonies was no more than twice of that of spontaneous colonies for each dosage group and there was no doseresponse relationship existed.[Conclusion]Peony seed oil had no mutagenicity in this test.

Key wordsSalmonella typhimurium /Mammalian microsomal enzyme test； Mutagenicity； Mutation； Peony seed oil

牡丹籽油是牡丹籽中提取的植物油，是我國(guó)特有的木本堅(jiān)果油。牡丹籽油具有很高的總營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，成分結(jié)構(gòu)合理，含有豐富的多不飽和脂肪酸，亞麻酸含量是橄欖油的200多倍，又不易氧化沉積在人體血管壁、心臟冠狀動(dòng)脈等部位，是非常理想的食用油[1]。筆者采用鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames）對(duì)牡丹籽油軟膠囊的致突變性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并同時(shí)對(duì)其抗突變作用及機(jī)理加以研究，為牡丹籽油保健食品的開發(fā)應(yīng)用提供了一定的科學(xué)參考[2]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品。牡丹籽油軟膠囊，褐色軟膠囊，規(guī)格：0.5 g/粒，60粒/瓶，批號(hào)20160310，常溫密閉干燥處保存。

1.1.2主要試劑。

誘變劑：二甲基亞砜，美國(guó)aladdin工業(yè)公司，批號(hào)L1503022；疊氮鈉，上海化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)Z4183；2-氨基芴，美國(guó)sigma公司，批號(hào)STBF2332V；敵克松，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，批號(hào)40709。

大鼠肝液10% S9Mix，美國(guó)MOLTOX公司，批號(hào)3601。

1.2方法

1.2.1菌株制備。由安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院購買并鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株藥片（TA97、TA98、TA100、TA102，美國(guó)MOLTOX公司），取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5 mL，將菌株藥片直接接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃振蕩（100次/min），菌液濃度不少于1×109～2×109 CFU/mL。代謝活化系統(tǒng)采用美國(guó)MOLTOX公司的大鼠肝液10% S9 Mix作為體外活化系統(tǒng)（間接致癌物測(cè)定其活性符合試驗(yàn)要求）。按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）第一部分毒理學(xué)評(píng)價(jià)檢驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶（AMES）試驗(yàn)方法。

1.2.2試驗(yàn)步驟。

在頂層培養(yǎng)基平板摻入法：在頂層培養(yǎng)基（45 ℃保溫）中依次加入增菌好的菌液0.1 mL，混勻；加樣品溶液0.1 mL（需活化時(shí)加入10% S9混合液0.5 mL），再混勻，迅速倒入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿均勻分布，平放固化，37 ℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。Ames試驗(yàn)中，受試物根據(jù)毒性測(cè)定結(jié)果，設(shè)5.0、1.0、0.2、0.04 mg/皿 4個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，包括陽性對(duì)照組（疊氮鈉、2-氨基芴、敵克松），溶劑對(duì)照組（二甲基亞砜、蒸餾水），未處理對(duì)照組（試驗(yàn)時(shí)只在培養(yǎng)基上加菌液，不加其他任何試劑），所有對(duì)照組均包括加S9和不加S9 2種情況。每劑量、每種系統(tǒng)均做3個(gè)平皿。37 ℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。整套試驗(yàn)在相同條件下重復(fù)1次。

1.2.3結(jié)果判定。以直接計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生長(zhǎng)良好條件下，受試物組回變菌落數(shù)增加1倍以上（即回變菌落數(shù)等于或大于2乘以未處理對(duì)照數(shù)），并有劑量反應(yīng)關(guān)系或至少某一測(cè)試點(diǎn)有可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽性反應(yīng)，即可認(rèn)為該受試物誘變?cè)囼?yàn)陽性。

2結(jié)果與分析

Ames試驗(yàn)檢測(cè)牡丹籽油軟膠囊致突變性結(jié)果，牡丹籽油各劑量組對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102誘發(fā)的回變菌落數(shù)見表1和表2。結(jié)果顯示，在加和不加S9條件下，牡丹籽油對(duì)4個(gè)菌株誘發(fā)的回變菌落數(shù)均未超過未處理對(duì)照組1倍以上，為陰性結(jié)果，表明牡丹籽油對(duì)鼠傷寒沙門氏菌無直接和間接致突變作用。

Ames試驗(yàn)是用來檢測(cè)致突變化學(xué)物的一種靈敏、快速方法。其原理主要為人工誘變鼠傷寒沙門氏菌菌株，形成組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株[3]。這種菌株不能合成組氨酸，因而在無組氨酸的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。在誘變劑的作用下，突變型沙門氏菌會(huì)回復(fù)為野生型，自行合成組氨酸，形成菌落[4]。表1和表2結(jié)果說明，在加和不加S9的系統(tǒng)下，陽性

誘變劑的菌落回變數(shù)明顯增加，試驗(yàn)重復(fù)性好，系統(tǒng)可信。

3討論

菌株制備對(duì)于試驗(yàn)非常重要。菌株制備該試驗(yàn)采用了過夜振動(dòng)搖晃與靜置培養(yǎng)2種方法。過夜振動(dòng)搖晃13～15 h后，菌株的濃度可以達(dá)到試驗(yàn)需要濃度1×109～2×109 CFU/mL，而靜置培養(yǎng)15 h的菌株濃度達(dá)不到試驗(yàn)要求，所以在試驗(yàn)中需要采用振動(dòng)搖晃的方式進(jìn)行菌株制備。在平板摻入法試驗(yàn)中，TA97菌株對(duì)于葡萄糖的濃度比較敏感。根據(jù)購買菌株的MOLTOX公司的指導(dǎo)意見，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基配方中，TA97的生長(zhǎng)往往會(huì)受到葡萄糖水平的抑制（2%的葡萄糖），在0.4%葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得更好。所以在配置底層培養(yǎng)基平皿時(shí)，分別制備了2.0%和0.4%2個(gè)葡萄糖濃度的平皿，但是試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)顯著差異。

牡丹籽油作為新興的油類保健食品，對(duì)于其的質(zhì)量控制非常關(guān)鍵[5]。TA97、TA98、TA100可用于檢測(cè)移碼突變，TA102可用于檢測(cè)堿基對(duì)置換，由于TA系的菌株回復(fù)突變的特異性高，所以有些致突變物可能難以檢出。通過對(duì)Ames試驗(yàn)的改進(jìn)，或?qū)で笠环N更加簡(jiǎn)便的方法用來檢測(cè)牡丹籽油保健食品的安全性是今后的研究目標(biāo)[6]。

參考文獻(xiàn)

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翟文婷，朱獻(xiàn)標(biāo)，李艷麗，等.牡丹籽油成分分析及其抗氧化活性研究[J]. 煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)與工程版），2013，26（2）：147-150.

[2] 王心如.毒理學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003.

[3] 錢星文，劉凡，彭菊，等.當(dāng)歸雙參蛤蟆油片的遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].光明中醫(yī)，2015（3）：499-500.

[4] 石愛華，李衛(wèi)東，翟鵬貴，等.西洋參提取物的毒理學(xué)試驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014（8）：2002-2004.

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[6] 張偉清，曹進(jìn)，丁宏，等.對(duì)保健食品理化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的思考[J].中國(guó)藥師，2016，19（7）：1352-1354.