李龍　司景磊　夏攀潔　綦文晶　龍開旭　夏利　何劍雄　吳敏　蘭干球

摘要：【目的】克隆廣西巴馬小型豬ANK1基因啟動子，確定其活性核心區(qū)，為研究ANK1基因啟動子與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性及構(gòu)建動物疾病模型打下基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^在線軟件對ANK1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行預(yù)測，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點設(shè)計特異引物擴增不同長度的ANK1基因啟動子片段，并利用雙熒光素酶試劑盒檢測其熒光值，以確定不同ANK1基因啟動子片段的活性?！窘Y(jié)果】發(fā)現(xiàn)ANK1基因啟動子存在1個轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）、2個CpG島和多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并以此作為ANK1基因啟動子的分段依據(jù)，將其分割為P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8個不同長度的目的片段。成功克隆獲得的8個ANK1基因啟動子片段經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切、T4真核表達載體連接、細胞轉(zhuǎn)染等方法構(gòu)建8個雙熒光素酶重組報告基因，雙熒光素酶試劑盒檢測結(jié)果顯示，廣西巴馬小型豬ANK1基因啟動子在P1796片段活性最強，與其他片段存在顯著差異（P<0.05）?！窘Y(jié)論】成功克隆獲得廣西巴馬小型豬ANK1基因啟動子的8個片段，且利用雙熒光素酶試劑盒檢測確定其核心啟動子區(qū)域出現(xiàn)在P1796片段。

關(guān)鍵詞： 廣西巴馬小型豬；錨蛋白（ANK）；ANK1基因；啟動子；活性分析

中圖分類號： S828.89 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）04-0716-05

Abstract：【Objective】In this study， ANK1 gene promoter of Guangxi Bama miniature pig was cloned， and its core activity areas were detected， so as to lay a foundation for researching correlation between ANK1 gene promoter and meat quality traits， and establishing animal disease model. 【Method】Transcription factor binding sites of ANK1 promoter were predicted with online software， ANK1 promoter fragments of different lengths were amplified by specific primers based on transcription factor binding sites. To determine the activity of different fragments， fluorescence values of different promoter regions were tested using dual luciferase kits. 【Result】One transcription starting sites（TSS）， two CpG islands and multiple transcription factor binding sites were found in ANK1 promoter. The results served as basis for segmentation of ANK1 gene promoter and it was devided into eight target fragments of different length， namely P638，P791，P1113，P1163，P1648，P1694，P1796 and P2074. The eight segments was cloned. Through KpnⅠand Hind Ⅲ double enzyme digestion， T4 eukaryotic expression vector linkage and cell transfection， eight dual luciferase kit recombination reporter genes were established. Based on dual luciferase detection， the activity of ANK1 gene promoter was the strongest in P1796 fragment， and the difference with others fragments was significant（P<0.05）. 【Conclusion】In this study， eight fragments of the ANK1 gene promoter from Guangxi Bama miniature pig are successfully cloned and the core region of the ANK1 gene promoter is identified as P1796 fragment by dual luciferase kits.

Key words： Guangxi Bama miniature pig； ankyrins（ANK）； ANK1 gene； promoter； activity analysis

0 引言

【研究意義】錨蛋白（Ankyrins，ANK）作為一種連接蛋白廣泛存在于各類組織細胞中，能將細胞內(nèi)的骨架蛋白和細胞膜上的跨膜蛋白連接起來，組成細胞內(nèi)的骨架系統(tǒng)，因此又稱為骨架蛋白（Rubtsov and Lopi-

na，2000），主要在紅細胞膜中表達。ANK家族在參與機體生長發(fā)育、蛋白轉(zhuǎn)運及細胞內(nèi)外信號的傳遞和維持細胞骨架方面發(fā)揮著重要作用（Sedgwick and Smerdon，1999；Bennett and Baines，2001；Michaely et al.，2002；Mohler et al.，2002），因此，加強ANK功能研究有助于闡明與其異常相關(guān)疾病的發(fā)病機制，為基因診斷和治療提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】ANK基因家族包括3個獨立基因，分別是ANK1、ANK2和ANK3。ANK1基因位于豬的第17號染色體上，在維持細胞結(jié)構(gòu)、肌內(nèi)脂肪和系水力方面發(fā)揮重要作用（Aslan et al.，2012）。ANK1蛋白具有膜結(jié)合域（Mem-

brane-binding domain）、血影蛋白結(jié)合域（Spectrin-

binding domain）、死亡調(diào)控域（Death domain）和碳末端（C-terminal domain），其中，死亡調(diào)控域和碳末端屬于調(diào)控區(qū)域（Cunha and Mohler，2006）。目前，有關(guān)ANK1的研究主要集中在人類醫(yī)學(xué)上。Delaunay（2007）、Ipsaro等（2009）研究表明，在遺傳性紅細胞球行增多癥（Hereditary spherocytosis，HS）中ANK1基因啟動子具有紅細胞ANK基因啟動子活性的片段，在啟動子區(qū)域堿基的突變能影響ANK合成，進而導(dǎo)致網(wǎng)狀紅細胞增多。Imamura等（2012）研究表明，ANK1基因是一個研究不同種族二型糖尿病的新候選易感基因。此外，有研究表明ANK存在于肌膜與肌原纖維之間（Nelson and Lazarides，1984；Gagelin et al.，2002），當(dāng)肌細胞中ANK發(fā)生水解將導(dǎo)致肌纖維、肌原纖維發(fā)生皺縮效應(yīng)，進而致使肌細胞的系水力降低，最終影響肉質(zhì)風(fēng)味（Melody et al.，2004；Huff-Lonergan and Lonergan，2005）。目前國內(nèi)關(guān)于ANK1基因啟動子的研究較少，主要針對遺傳性球形紅細胞增多癥和肉質(zhì)性狀進行的關(guān)聯(lián)性研究（陳海青等，2013；姜敏等，2016）?！颈狙芯壳腥朦c】有關(guān)ANK1基因啟動子在肉質(zhì)性狀方面的研究較多，但針對該啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究較少，且至今鮮見廣西巴馬小型豬ANK1基因啟動子活性核心區(qū)及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以廣西巴馬小型豬為研究對象，克隆其ANK1基因啟動子，并確定ANK1基因啟動子的活性核心區(qū)，為研究ANK1基因啟動子與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性及構(gòu)建動物疾病模型等打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

廣西巴馬小型豬血液采自廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣西巴馬小型豬飼養(yǎng)基地。Trans 5α感受態(tài)細胞和DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染的C2C12細胞及pGL3-Basic和pRL-TK質(zhì)粒均由廣西大學(xué)動物遺傳育種實驗室保存提供，高保真PCR擴增試劑盒、DNA連接酶和pMD18-T載體購自TaKaRa公司，細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清（FBS）和轉(zhuǎn)染試劑盒購自Life Technologies公司，胰蛋白酶購自Hyclone公司，雙熒光素酶試劑盒購自Promega公司。

1. 2 引物設(shè)計與合成

通過Ensembl（http：//ensemble.org/）數(shù)據(jù)庫獲得ANK1基因39號內(nèi)含子，并截取39號外顯子83 bp和上游1991 bp作為啟動子研究序列。采用CpGProD、SMS CpG、AliBaba 2.0、Promoter Scan、Promoter 2.0 Prediction Server等對啟動子轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點進行分析，ANK1基因啟動子的2074 bp分割為8個不同長度的目的片段，分別命名為P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074。利用Oligo 7.0設(shè)計8對特異引物（下劃線部分為酶切位點），其中，P-F-Total為共有上游引物（表1）。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 DNA提取

根據(jù)DNA提取試劑盒操作說明進行廣西巴馬小型豬血液基因組DNA提取，利用分光光度計檢測DNA濃度和純度，然后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 ANK1基因啟動子片段擴增

采用PCR兩步法擴增8個目的片段，第一步以不帶酶切位點的引物（S-2074F/S-2074R）擴增獲得ANK1基因啟動子片段，第二步將不同的啟動子片段加上酶切位點，兩步的PCR反應(yīng)體系一致。PCR反應(yīng)體系20.0 μL；2×Taq DNA酶Mix 10.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s（帶酶切位點的退火溫度62.5 ℃），72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的片段回收后進行相應(yīng)的連接。其中，pMD18-T連接體系：SolutionⅠ5.0 μL，pMD18-T載體1.0 μL，膠回收產(chǎn)物4.0 μL；T4連接體系：Ligation Buffer 1.0 μL，T4 Ligase 1.0 μL，pGL3-Basic載體質(zhì)粒膠回收產(chǎn)物3.0 μL，目的片段膠回收產(chǎn)物5.0 μL。獲得的P638-2074-pGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Trans 5α感受態(tài)細胞中，篩選出陽性克隆菌落，對其進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，然后將陽性克隆分別送至生工生物工程（上海）股份有限公司和深圳華大基因有限公司測序。

1. 5 細胞轉(zhuǎn)染與活性驗證

C2C12細胞復(fù)蘇后，用含10% FBS的DMEM為培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合率達60%～70%時更換無雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h再進行轉(zhuǎn)染工作。按轉(zhuǎn)染試劑盒說明，每孔2 μg重組質(zhì)粒+1/20或1/50 μg的pRL-TK質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞懸液，按雙熒光素酶試劑盒E2920操作說明進行活性驗證。

1. 6 數(shù)據(jù)分析

采用DNASTAR的SeqMman、Editseq、MegAlign對克隆序列的正確性進行分析，雙熒光素酶報告試驗數(shù)據(jù)使用Origin 8.0和SPSS 22.0進行分析，ANK1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點利用NNPP、AliBaba 2.0、Promo-

terScan、MethPrimer、Promoter 2.0 Prediction Server、TFSEARCH等在線軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析結(jié)果

由于ANK1基因啟動子序列中預(yù)測獲得的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點很多，需通過AliBaba 2.0、TFSEARCH篩選出比較重要或相關(guān)的結(jié)合位點，再以NNPP、Promo-

ter 2.0 Prediction Server篩選出轉(zhuǎn)錄啟示結(jié)合位點，采用MethPrimer尋找ANK1基因啟動子的CpG島（圖1）。結(jié)果從P638片段中挑選出4個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，分別是GATA-1、CEP-bind、SRF和ATA-1；在P791片段中存在一個CpG島；在P1113片段中挑選出4個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，分別是GR、SP1、SP1和SP；在P1163片段中預(yù)測出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄啟示結(jié)合序列；在P1648片段中挑選出4個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，分別是myogenin、SP1、GATA-1和SP1；在P1694片段中挑選出GR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；在P1796片段中存在一個CpG島；在P2074片段中挑選出5個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，分別是TATA box、AP-2alpha、MyoD、NFkppa和SP1。

2. 2 廣西巴馬小型豬ANK1基因啟動子克隆結(jié)果

以廣西巴馬小型豬血液DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳檢測結(jié)果如圖2所示。陽性克隆經(jīng)測序分析，發(fā)現(xiàn)8個克隆片段均與Ensemble數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的對應(yīng)堿基序列一致。以這些目的片段（P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074）為模板，采用雙酶切法與pGL3-Basic載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，獲得8個重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果見圖3。說明成功構(gòu)建了ANK1基因啟動子的雙熒光素酶報告基因載體。

2. 3 ANK1基因啟動子活性驗證結(jié)果

雙熒光素酶試劑盒檢測報告結(jié)果經(jīng)SPSS 22.0分析，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)P1796和P1694的熒光素酶檢測報告值與其他6個啟動子片段及pGL3-Basic空載體的檢測報告值存在顯著差異（P<0.05），其中又以P1976片段的活性最強。P638、P791、P1113、P1163、P1648和P2074片段的活性與pGL3-Basic空載體組間不存在顯著差異（P>0.05）。P1796和P1694兩個片段的活性較強，而其他片段活性較低，可能是ANK1基因啟動子片段中存在一些反式作用因子結(jié)合位點，或是因為轉(zhuǎn)染到C2C12細胞中而不是豬的肌細胞，導(dǎo)致不同片段的啟動子活性降低。

2. 4 P1796特有片段序列分析結(jié)果

ANK1基因啟動分析結(jié)果顯示，P1796片段的活性最強。利用在線軟件AliBaba 2.0對P1796片段特有堿基序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)AP-4、Sp1、MyoD、Adf-1、NRF-1、E1和c-Ets-1等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點存在于這段特有的堿基序列中。AliBaba 2.0對P1796片段序列進行預(yù)測分析的結(jié)果見圖5。

3 討論

ANK家族包含ANK1、ANK2和ANK3，其中ANK1作為細胞骨架蛋白，在細胞間的信號傳遞中發(fā)揮重要作用，同時參與細胞結(jié)構(gòu)維持、生物體蛋白運輸、機體生長等。ANK1基因在紅細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞、巨噬細胞中均有表達（Cunha and Mohler，2006；Hoock et al.，1997）。自ANK1被發(fā)現(xiàn)至今，其研究范圍逐漸擴大，主要體現(xiàn)在ANK1基因啟動子與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性及ANK1在紅細胞疾病和二型糖尿病中的作用。已有研究表明，在夏洛來牛、利木贊牛、安格斯牛的ANK1基因啟動子區(qū)存在5個SNP位點與肉質(zhì)的嫩度、大理石紋相關(guān)（Aslan et al.，2010），且其突變對各年齡段的耗牛肉質(zhì)具有一定影響（陳海青等，2013）。有關(guān)ANK1基因與豬肉質(zhì)性狀的研究也有報道，Byun等（2008）研究表明，在該基因3'UTR區(qū)域的一個SNP位點與豬肌肉剪切力、肌內(nèi)脂肪、肌肉系水力存在關(guān)聯(lián)性。

本研究通過在線軟件對ANK1基因啟動子區(qū)域的結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始位點、CpG島進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)ANK1基因啟動子區(qū)域存在1個轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）、2個CpG島和多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并以此作為ANK1基因啟動子的分段依據(jù)。通過克隆成功獲得8個帶有重要結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）及CpG島的片段，經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切、T4真核表達載體連接、細胞轉(zhuǎn)染等方法構(gòu)建8個雙熒光素酶重組報告基因，以雙熒光素酶試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)ANK1基因啟動子活性最強的區(qū)域在P1796片段，即確定該片段為ANK1基因啟動子的核心區(qū)域。利用AliBaba 2.0、Signal Scan和TFSEARCH等對P1796片段堿基序列進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)該序列中存在多個具有激活功能的轉(zhuǎn)錄位點，如AP-4、Sp1、MyoD、Adf-1、NRF-1、E1和c-Ets-1。本研究對ANK1基因啟動子進行活性驗證，其結(jié)果為后期開展ANK1基因啟動子在肉質(zhì)、疾病等方面的相關(guān)研究打下了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得廣西巴馬小型豬ANK1基因啟動子的8個片段，且利用雙熒光素酶試劑盒檢測確定其核心啟動子區(qū)域出現(xiàn)在P1796片段。

參考文獻：

陳海青，羅玉柱，胡江，王繼卿，劉秀，張麗. 2013. 甘南牦牛ANK1基因啟動子區(qū)突變與胴體質(zhì)量及肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，48（6）：6-12.

Chen H Q，Luo Y Z，Hu J，Wang J Q，Liu X，Zhang L. 2013. Association analysis of promoter polymorphism in ANK1 gene with carcass and meat quality traits in Gannan yak[J].Journal of Gansu Agricultural University，48（6）：6-12.

姜敏，魯潔，鐘雁，王亞娟，楊彩云. 2016. 新生兒遺傳性球形紅細胞增多癥ANK1基因新突變一例[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，33（1）：44-47.

Jiang M，Lu J，Zhong Y，Wang Y J，Yang C Y. 2016. Identification of a novel ANK1 gene mutation in newborn with heredi-

tary spherocytosis[J]. Chinese Journal of Medical Genetics，33（1）：44-47.

Aslan O，Hamill R M，Mullen A M，Davey G C，Gil M，Gladney C D，Sweeney T. 2012. Association between promoter poly-

morphisms in a key cytoskeletal gene（Ankyrin 1） and intramuscular fat and water-holding capacity in porcine muscle[J]. Molecular Biology Reports，39（4）：3903-3914.

Aslan O，Sweeney T，Mullen A M，Hamill R M. 2010. Regulatory polymorphisms in the bovine Ankyrin 1 gene promoter are associated with tenderness and intramuscular fat content[J]. Bmc Genetics，11（1）：10-15.

Bennett V，Baines A J. 2001. Spectrin and ankyrin-based pathways：Metazoan inventions for integrating cells into tissues[J]. Physiological Reviews，81（3）：1353-1392.

Byun S O， Zhou H， Forrest R H， Frampton C M， Hickford J G. 2008. Association of the ovine calpastatingene with birth weight and growth rate to weaning[J]. Animal Genetics，39（5）：572-573.

Cunha S R，Mohler P J. 2006. Cardiac ankyrins：Essential components for development and maintenance of excitable membrane domains in heart[J]. Cardiovascular Research，71（1）：22-29.

Delaunay J. 2007. The molecular basis of hereditary red cell membrane disorders[J]. Blood Reviews，21（1）：1-20.

Gagelin C，Constantin B，Deprette C，Ludosky M A，Recouvreur M，Cartaud J，Cognard C，Raymond G，Kordeli E. 2002. Identification of Ank（G107），a muscle-specific ankyrin-Gi-

soform[J]. Journal of Biological Chemistry，277（15）：12978-12987.

Hoock T C，Peters L L，Lux S E. 1997. Isoforms of ankyrin-3 that lack the NH2-terminal repeats associate with mouse macrophage lysosomes[J]. The Journal of Cell Biology，136（5）：1059-1070.

Huff-Lonergan E，Lonergan S M. 2005. Mechanisms of water-holding capacity of meat：The role of postmortem biochemical and structural changes[J]. Meat Science，71（1）：194-204.

Imamura M，Maeda S，Yamauchi T，Hara K，Yasuda K，Morizono T，Takahashi A，Horikoshi M，Nakamura M，F(xiàn)ujita H，Tsuno-

da T，Kubo M，Watada H，Maegawa H，Okada-Iwabu M，Iwabu M，Shojima N，Ohshige T，Omori S，Iwata M， Hirose H，Kaku K，Ito C，Tanaka Y， Tobe K， Kashiwagi A， Kawamori R，Kasuga M，Kamatani N，Nakamura Y，Kadowaki T. 2012. A single-nucleotide polymorphism in ANK1 is associated with susceptibility to type 2 diabetes in Japanese populations[J]. Human Molecular Genetics，21（13）：3042-3049.

Ipsaro J J，Huang L，Mondragón A. 2009. Structures of the spectrin-ankyrin interaction binding domains[J]. Blood，113（22）：5385-5393.

Melody J L， Lonergan S M， Rowe L J， Huiatt T W， Mayes M S， Huff-Lonergan E. 2004. Early postmortem biochemical factors influence tenderness and water-holding capacity of three porcine muscles[J]. Journal of Animal Science，82（4）：1195-1205.

Michaely P，Tomchick D R，Machius M，Anderson R G. 2002. Crystal structure of a 12 ANK repeat stack from human ankyrinR[J]. The EMBO Journal，21（23）：6387-6396.

Mohler P J，Gramolini A O，Bennett V. 2002. Ankyrins[J]. Journal of Cell Science，115（8）：1565-1566.

Nelson W J，Lazarides E. 1984. Goblin（ankyrin） in striated muscle：Identification of the potential membrane receptor for erythroid spectrin in muscle cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ameri-

ca，81（11）：3292-3296.

Rubtsov A M，Lopina O D. 2000. Ankyrins[J]. FEBS Letters，482（1-2）：1-5.

Sedgwick S G，Smerdon S J. 1999. The ankyrin repeat：A diversity of interactions on a common structural framework[J]. Trends in Biochemical Sciences，24（8）：311-316.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）