王震　龐妃　顧彩彩　王露蓉　邢永秀　楊麗濤　李楊瑞

摘要：【目的】建立和優(yōu)化固氮鏈霉菌Streptomyces chartreusi WZS021（簡稱菌株WZS021，下同）的接合轉(zhuǎn)移體系，以豐富固氮鏈霉菌基因片段轉(zhuǎn)移技術(shù)。【方法】以大腸桿菌Escherichia coli ET12567（pUZ8002）為供體菌，攜帶整合型質(zhì)粒pSET152的菌株WZS021為受體菌，進(jìn)行菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移?！窘Y(jié)果】選擇高氏一號培養(yǎng)基為菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，50 ℃熱激10 min，供受比為1∶10，涂布20.0 mg/L安普霉素、接合轉(zhuǎn)移12 h后覆蓋抗生素，添加MgCl2終濃度為5.0 mmol/L時接合轉(zhuǎn)移效率最高，達(dá)3.24×10-6?！窘Y(jié)論】通過確定適用于菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移條件建立的菌株WZS021遺傳轉(zhuǎn)化體系，有助于今后插入標(biāo)記基因確定該菌的固氮定殖位點(diǎn)及導(dǎo)入外源基因的操作。

關(guān)鍵詞： 固氮鏈霉菌WZS021；接合轉(zhuǎn)移；優(yōu)化；pSET152

中圖分類號： Q939.113 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）04-0581-06

Abstract：【Objective】The present study was conducted to establish and optimize transconjugation system of Streptomyces chartreusis WZS021（hereinafter referred to as strain WZS021），in order to enrich strain WZS021 gene fragment transfer technology. 【Method】As donor strain，Escherichia coli ET12567（pUZ8002） contained integrative plasmid pSET152. Strain WZS021 was recipient. Transconjugation was conducted on strain WZS021. 【Result】The optimal conditions were as follows：Gauzes medium No.1 as the transconjugation medium， heat shock at 50 ℃ for 10 min， donor-recipient ratio 1∶10，20.0 mg/L apramycin coverage 12 h post transconjugation， and adding MgCl2 till final concentration of 5.0 mmol/L. Under these conditions，the transconjugation efficiency was the highest， which was up to 3.24×10-6. 【Conclusion】The suitable transconjugation conditions for strain WZS021 are ascertained， and an effective genetic transformation system for strain WZS021 is established based on it. It is helpful to insert marker genes to detect nitrogen fixation sites of the strain and exogenous gene transfer.

Key words： Streptomyces chartreusi WZS021； transconjugation； optimization； pSET152

0 引言

【研究意義】固氮微生物是近年來生物固氮研究的熱點(diǎn)，有效利用固氮微生物可減少化肥使用量，改善土壤和生態(tài)環(huán)境質(zhì)量，提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，有利于農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，提高經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會效益（李楊瑞，2010；李劍鋒等，2015）。鏈霉菌是一種放線菌，全世界約2/3的抗生素產(chǎn)自該菌屬（莫宏波等，2004），在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域均有突出地位。固氮鏈霉菌Streptomyces chartreusi WZS021（簡稱菌株WZS021，下同）是一株具有高固氮能力的鏈霉菌（Wang et al.，2016），目前對該菌種接合轉(zhuǎn)移研究方面鮮有報道，其接合轉(zhuǎn)移的具體條件尚不清楚。因此，掌握固氮微生物的生物技術(shù)，建立并優(yōu)化固氮鏈霉菌S. chartreusi WZS021的接合轉(zhuǎn)移體系，對今后開展菌株WZS021在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鏈霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化主要采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、接合轉(zhuǎn)移法和電轉(zhuǎn)化法等（Veal et al.，1992；Christensen et al.，1996；吳勝和夏煥章，2002）。赫衛(wèi)清和王以光（2006）研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌高度分化，遺傳背景復(fù)雜，不同菌株的接合轉(zhuǎn)移條件不完全相同。王航等（2014）研究表明，接合轉(zhuǎn)移法以其操作程序簡單、時間成本小、轉(zhuǎn)化效率可觀和能使外源DNA避開胞外核酸酶降解等優(yōu)點(diǎn)成為鏈霉菌轉(zhuǎn)化的主要遺傳技術(shù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對鏈霉菌屬的接合轉(zhuǎn)移研究主要集中在抗生素產(chǎn)生菌上，如產(chǎn)雷帕霉素的吸水鏈霉菌NRRL5491（楊旻和陶美鳳，2007）、產(chǎn)放線紫紅素的阿維鏈霉菌NRRL8165（余姣姣和陶美鳳，2010）和產(chǎn)達(dá)托霉素的玫瑰孢鏈霉菌NRRL11379（王航等，2014）等，而關(guān)于固氮功能型鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在不同培養(yǎng)基、熱激溫度、供受比、抗生素使用濃度和時間及Mg+濃度等條件下對菌株WZS021的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高效、便捷的接合轉(zhuǎn)移方法，以豐富菌株WZS021的基因片段轉(zhuǎn)移技術(shù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 培養(yǎng)基 LB和高氏一號培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司，MS、M10、YEME和2CM培養(yǎng)基參考Kieser等（2000）的方法使用，2×YT培養(yǎng)基參考Sambrook等（1989）的方法使用。

1. 1. 2 質(zhì)粒及菌種 質(zhì)粒pSET152（Bierman et al.，1992）、大腸桿菌Escherichia coli DH5α、E. coli ET12567（pUZ8002）和固氮鏈霉菌S. chartreusi WZS021（16S rRNA基因GenBank登錄號KX775948）均由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)和利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1. 1. 3 試劑及抗生素 所有抗生素均購自北京索萊寶科技有限公司，PCR相關(guān)產(chǎn)品購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，其余試劑購自國藥集團(tuán)。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 鏈霉菌培養(yǎng)及DNA提取 參照劉志恒和姜成林（2004）的方法進(jìn)行鏈霉菌培養(yǎng)及總DNA和質(zhì)粒提取。

1. 2. 2 抗生素最小抑菌濃度測定 制備含0～10.0 mg/L（梯度為1.0 mg/L）安普霉素的高氏一號培養(yǎng)基，將約108個菌株WZS021的孢子均勻涂布在每個培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)10 d，期間每天觀察，根據(jù)鏈霉菌的生長情況確定最小抑菌濃度為3.0 mg/L。

1. 2. 3 大腸桿菌與鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移 參照Flett等（1997）的方法進(jìn)行大腸桿菌與鏈霉菌屬間的接合轉(zhuǎn)移。將質(zhì)粒pSET152轉(zhuǎn)入大腸桿菌ET12567（pUZ8002），得到轉(zhuǎn)化子ET12567（pUZ8002/pSET152），菌株保存于-80 ℃冰箱。使用時將轉(zhuǎn)化子ET12567（pUZ8002/pSET152）取出培養(yǎng)過夜，再將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至新鮮的100.0 mL LB培養(yǎng)基（含50.0 mg/L卡那霉素、25.0 mg/L氯霉素和50.0 mg/L安普霉素）中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時收集菌體。用等體積的新鮮LB洗滌菌體兩次以去除抗生素，再以10.0 mL LB懸浮備用。取新鮮的鏈霉菌孢子，使其懸浮于5.0 mL 0.05 mol/L TES（pH=8.0）中，50 ℃水浴熱激10 min，冷卻至室溫后加入等體積2×YT培養(yǎng)基，37 ℃搖床分別培養(yǎng)2～3 h，離心收集孢子并重新懸浮于適量水或TES中，在振蕩器上打散孢子后與收集到的轉(zhuǎn)化子ET12567（pUZ8002/pSET152）混合并涂布，于28 ℃培養(yǎng)10～20 h，用適當(dāng)濃度的安普霉素和萘啶酮酸覆蓋，再于28 ℃培養(yǎng)6～8 d可得到接合轉(zhuǎn)移子。受體孢子數(shù)采用平板計數(shù)法（趙斌和何紹江，2002）計數(shù)，接合轉(zhuǎn)移頻率為接合子數(shù)目除以受體孢子數(shù)，取3次平行試驗(yàn)的平均值。

1. 2. 4 接合轉(zhuǎn)移子驗(yàn)證 將1.2.3獲得的接合轉(zhuǎn)移子在含安普霉素和萘啶酮酸的培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)幾次以驗(yàn)證接合轉(zhuǎn)移子的穩(wěn)定性，再轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基，2～3 d后收集菌體，提取總DNA作為PCR驗(yàn)證的模板。以pSET152質(zhì)粒DNA為陽性對照模板，野生型菌株WZS021 DNA為陰性對照。擴(kuò)增引物（楊旻等，2007）為Apr1（5′-CAGTTGACCCAGGGCTGTC-3′）和Apr2（5′-GCAATACGAATGGCGAAAA-3′）。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，擴(kuò)增出694 bp安普霉素抗性基因。

2 結(jié)果與分析

2. 1 培養(yǎng)基對菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移效率的影響

選用MS、2CM、M10、YEME和高氏一號等5種培養(yǎng)基為大腸桿菌與鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。從圖1可看出，高氏一號培養(yǎng)基的接合轉(zhuǎn)移效率為1.69×10-6，高于MS和2CM培養(yǎng)基的接合轉(zhuǎn)移效率，而使用M10和YEME培養(yǎng)基時接合轉(zhuǎn)移效率低至無法計算或得不到接合轉(zhuǎn)移子，因此對固氮放線菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移操作時選擇高氏一號培養(yǎng)基為接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。

2. 2 熱激溫度對菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移效率的影響

在鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移操作中，熱激溫度對不同鏈霉菌的孢子萌發(fā)效果不同，對鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移效率也有一定影響（孔會利等，2006）。本研究選取45、50和55 ℃3個熱激溫度對鏈霉菌孢子進(jìn)行熱激處理，每處理熱激10 min，結(jié)果（圖2）表明，熱激溫度為50 ℃時接合轉(zhuǎn)移效率高于45和55 ℃兩個處理，因此熱激溫度為50 ℃時孢子萌發(fā)情況更適于接合轉(zhuǎn)移操作要求。

2. 3 供體菌與受體菌比例對菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移效率的影響

在大腸桿菌與鏈霉菌屬間的接合轉(zhuǎn)移中，供體菌數(shù)量過多會造成供體菌與受體菌同時在培養(yǎng)基上生長，無法進(jìn)行下一步操作；受體菌數(shù)量過多則轉(zhuǎn)化子假陽性的概率會升高。因此，選擇適當(dāng)?shù)墓┦鼙仁墙雍限D(zhuǎn)移操作中的重要一步。本研究選擇供受比1000∶1、100∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶100和1∶1000進(jìn)行比較，結(jié)果（圖3）表明，供受比為1∶10時，接合轉(zhuǎn)移效率最高，供受比為10∶1、1∶1和1∶100時可長出少量轉(zhuǎn)化子，供受比為1000∶1、100∶1和1∶1000時出現(xiàn)大腸桿菌生長或無轉(zhuǎn)化子現(xiàn)象。

2. 4 抗生素濃度對菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移效率的影響

由表1可知，選用20.0和50.0 mg/L兩種濃度安普霉素和萘啶酮酸對接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行抗生素濃度篩選，當(dāng)培養(yǎng)基上萘啶酮酸濃度為20.0 mg/L時，20.0和50.0 mg/L安普霉素均無法抑制大腸桿菌生長，出現(xiàn)大腸桿菌與轉(zhuǎn)化子同時生長現(xiàn)象；當(dāng)萘啶酮酸濃度為50.0 mg/L時，20.0 mg/L安普霉素的接合轉(zhuǎn)移效率約為50.0 mg/L安普霉素接合轉(zhuǎn)移效率的3倍，為2.79×10-6。

2. 5 抗生素覆蓋時間對菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移效率的影響

通常情況下鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移過程中抗生素覆蓋時間為16～20 h，覆蓋時間過長，大腸桿菌生長出的菌落會與鏈霉菌混在一起，無法進(jìn)行下一步試驗(yàn)；時間過短則接合轉(zhuǎn)移不完全，效率低下。本研究分別在涂布大腸桿菌與鏈霉菌混合菌液10、12、14、16、18和20 h后覆蓋抗生素，以涂布混合菌液12 h后覆蓋抗生素的接合轉(zhuǎn)移效率最高，涂布混合菌液14 h后覆蓋抗生素也能獲得可觀數(shù)量的接合轉(zhuǎn)移子，涂布混合菌液10 和16 h后覆蓋抗生素僅獲得少量的轉(zhuǎn)移子，而在涂布混合菌液18和20 h后覆蓋抗生素?zé)o法抑制大腸桿菌生長（圖4）。

2. 6 MgCl2濃度對菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移效率的影響

在接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中加入適量的MgCl2可提高接合轉(zhuǎn)移效率。為確定接合轉(zhuǎn)移的最佳MgCl2濃度，本研究選取終濃度為0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mmol/L的培養(yǎng)基以觀察接合轉(zhuǎn)移子生長情況。觀察結(jié)果（圖5）表明，在終濃度為0～30.0 mmol/L的培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生數(shù)量可觀的接合轉(zhuǎn)移子，終濃度為50.0 mmol/L的培養(yǎng)基上未產(chǎn)生接合轉(zhuǎn)移子。其中，終濃度為5.0、10.0和20.0 mmol/L培養(yǎng)基上產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子的數(shù)量明顯多于其他濃度。

2. 7 甘氨酸對菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移效率的影響

在培養(yǎng)基中加入MgCl2使其終濃度為5.0 mmol/L的前提下，添加甘氨酸使培養(yǎng)基甘氨酸終濃度分別為0、1%、2%、3%、4%、5%和6%，以檢測甘氨酸對菌株WZS021接合轉(zhuǎn)移效率的影響。檢測結(jié)果（圖6）顯示，甘氨酸終濃度為0～3%時，接合轉(zhuǎn)移效率變化無明顯差異，其中添加1%甘氨酸接合轉(zhuǎn)移效率最高（3.24×10-6），甘氨酸濃度大于3%時接合轉(zhuǎn)移效率降低，說明不添加甘氨酸對接合轉(zhuǎn)移效率無影響。

2. 8 接合轉(zhuǎn)移子的穩(wěn)定性及PCR驗(yàn)證

將1.2.3獲得的接合轉(zhuǎn)移子轉(zhuǎn)接至無抗性的高氏一號培養(yǎng)基上，生長出菌落后再接種于含50.0 mg/L萘啶酮酸和20.0 mg/L安普霉素的高氏一號培養(yǎng)基上，傳代培養(yǎng)6～8次，隨機(jī)挑選4株單菌落分別置于YEME液體培養(yǎng)基中以提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增均獲得大小約700 bp的條帶（圖7），表明質(zhì)粒pSET152已轉(zhuǎn)入鏈霉菌中并在鏈霉菌中遺傳穩(wěn)定，而以野生型菌株WZS021的DNA為陰性對照未擴(kuò)增出條帶。將PCR產(chǎn)物膠回收送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得的測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對分析，證實(shí)其為目的基因片段。

3 討論

pSET152是一種基因整合型質(zhì)粒，只有整合到染色體上才能穩(wěn)定存在于受體菌中（朱云霞等，2012）。不同鏈霉菌種導(dǎo)入外源基因的方法不同，接合轉(zhuǎn)移效率差異也很明顯（劉雪嬌等，2012）。本研究結(jié)果表明，菌株WZS021可在M10和YEME培養(yǎng)基上生長，但在接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中無接合子出現(xiàn)，其具體機(jī)制尚不清楚，不排除其他培養(yǎng)基更適合該菌接合轉(zhuǎn)移操作的可能性，下一步研究應(yīng)選取更多培養(yǎng)基進(jìn)行檢測；選用的3個熱激溫度中，55 ℃促進(jìn)孢子預(yù)萌發(fā)的效率明顯低于45和50 ℃處理，與一般接合轉(zhuǎn)移操作（Kieser et al.，2000）中熱激溫度處理結(jié)果相同。王芬等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，供受比為10∶1時最適合Streptomyces griseochromogenes的接合轉(zhuǎn)移操作；楊卓等（2016）報道供受比為100∶1對肉色吸水鏈霉菌 SH121的接合轉(zhuǎn)移效率更高。在本研究中，菌株WZS021的接合轉(zhuǎn)移操作更適合在供受比1∶10條件下完成，說明不同鏈霉菌種在接合轉(zhuǎn)移操作中與大腸桿菌的競爭情況存在差異。在對安普霉素最小抑菌濃度的測定中發(fā)現(xiàn)，3.0 mg/L抗生素足以抑制鏈霉菌生長，但為了避免接合子出現(xiàn)菌落連成一片不利于驗(yàn)證的情況，本研究選擇50.0 mg/L萘啶酮酸和20.0 mg/L安普霉素進(jìn)行抗生素濃度篩選。抗生素覆蓋時間對接合轉(zhuǎn)移影響的研究結(jié)果表明，鏈霉菌在接合轉(zhuǎn)移操作中最佳抗生素覆蓋時間為12 h，抗生素覆蓋時間偏長會導(dǎo)致大腸桿菌出現(xiàn)，推測菌株WZS021的次生代謝產(chǎn)物中較少或沒有抑制大腸桿菌生長的物質(zhì)，有別于王航等（2014）對玫瑰孢鏈霉菌NRRL11379接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)研究中抗生素覆蓋時間最佳為20 h的結(jié)果。Mg2+是酶活中心的組成部分，大量研究（楊卓等，2016；張萬垚等，2012；朱云霞等，2012）表明，在一定范圍內(nèi)Mg2+濃度的增加能提高接合轉(zhuǎn)移效率。本研究中加入5.0～20.0 mmol/L MgCl2后可較大幅度提高接合轉(zhuǎn)移效率，但MgCl2濃度大于20.0 mmol/L后接合轉(zhuǎn)移效率并未隨之升高，推測與高氏一號培養(yǎng)基本身含有少量MgSO4有關(guān)，Mg2+濃度過高反而會影響孢子形成。有報道稱適量的甘氨酸可提高S. griseochromogenes（劉雪嬌等，2012）和S. pulveraceus（王芬等，2012）的接合轉(zhuǎn)移效率，本研究結(jié)果與其存在差異，0～3%甘氨酸未影響菌株WZS021的接合轉(zhuǎn)移效率，甘氨酸濃度大于3%時反而會降低接合轉(zhuǎn)移效率。

4 結(jié)論

本研究確定了適用于固氮鏈霉菌S. chartreusi WZS021的接合轉(zhuǎn)移條件，建立了一套行之有效的固氮鏈霉菌S. chartreusi WZS021遺傳轉(zhuǎn)化體系，有助于今后插入標(biāo)記基因確定該菌株的固氮定殖位點(diǎn)及導(dǎo)入外源基因的操作。

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（責(zé)任編輯 思利華）