王歡 霍萬學(xué) 烏仁圖雅

摘要 目的：檢測連翹-4味湯散不同溶劑提取物對臨床常見致病菌體外抗菌作用。方法：采用瓊脂平板稀釋法、微孔板TTC法，以連翹-4味湯散不同溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇、75%乙醇、水）提取物為實(shí)驗(yàn)藥物，選用臨床分離鑒定的，耐藥現(xiàn)象較普遍的11種常見致病菌株為供試菌，檢測實(shí)驗(yàn)藥物的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)所用6種藥物提取物，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、枯草芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、陰溝桿菌、白假絲酵母菌等11種供試菌種，表現(xiàn)出了較為普遍的抑菌作用和一定的殺菌作用。結(jié)論：體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)藥物表現(xiàn)出了較高的抗菌效能，連翹-4味湯散做為傳統(tǒng)方劑，具有一定的藥劑學(xué)和藥理學(xué)研發(fā)價(jià)值。

關(guān)鍵詞 連翹-4味湯散；不同溶劑提取物；臨床分離致病菌；抗菌作用

Abstract Objective：To test the antibacterial effects of four extracts of Lianqiao Siwei decoction on common clinical bacteria. Methods：Using agar plate dilution method and microwell plate TTC method and taking the extracts of Lianqiao Siwei decoction in different solvent （aether petrolei， chloroform， acetic ether， absolute ethanol， 75% ethanol and water） as experimental drugs， then selecting 11 common pathogenic strains which are isolated and identified in clinic. To detect the minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC） of them. Results：Six extracts used in the test showed universal inhibitory effects and certain bactericidal effects against 11 tested strains. They are Staphylococcus aureus， Staphylococcus epidermidis， enterococcus， bacillus subtilis， Bacillus anthracis， Escherichia coli， Klebsiella pneumonia， baumanii， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus levans， and Candida albicans. Conclusion：Different extracts of Lianqiao Siwei decoction have antibacterial effects. As a traditional formula， it worth to be further studied in pharmacodynamics and pharmacology.

Key Words Lianqiao Siwei decoction； Different solvent extracts； Isolated pathogenic bacteria from clinic； Antibacterial activity

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.048

隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用及臨床侵入性醫(yī)療操作項(xiàng)目的增多，感染菌對抗生素的耐藥現(xiàn)象逐漸增加，嚴(yán)重影響著相關(guān)疾病的治療，已經(jīng)成為全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題之一。因此，從天然藥物中研發(fā)不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌藥物，具有可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和重要的社會(huì)效益[1]。我們在本實(shí)驗(yàn)選擇的蒙藥“連翹-4味”湯散，是載入國家藥品標(biāo)準(zhǔn)的蒙醫(yī)傳統(tǒng)方劑，具有清腑熱的功能，主要用于腸熱、痢疾、腹瀉、腹痛等病癥[2]。現(xiàn)代研究表明，構(gòu)成本方劑的連翹[3]、拳參[4]、川木通[4]、麥冬[5]4種藥味分別具有較好的抗菌作用。我們以體外抗菌實(shí)驗(yàn)方法，比較蒙藥“連翹-4味湯散”不同溶劑提取物的抗菌作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討該方劑在臨床感染性疾病治療中應(yīng)用的藥效學(xué)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高壓滅菌器（施都凱儀器設(shè)備（上海）有限責(zé)任公司，MJ-78）、水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DK-600S）、生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，DONGL I ANHAER APPARATUS）、酶標(biāo)儀（Multiscan MK3）、細(xì)菌自動(dòng)鑒定及藥敏系統(tǒng)（DL-96，珠海迪爾生物儀器有限公司）、細(xì)菌比濁儀（珠海迪爾公司，DL-ZD1）、CO2培養(yǎng)箱（FORMA STERI-CYCLE CO2 Incubator）、干烤箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9076 A型）、移液器、移液器吸頭、無菌96孔微量培養(yǎng)板、V形加樣槽、注射針頭式濾器、無菌2 mLEP管、無菌刻度吸管、無菌三角燒瓶、比濁專用瓶、6 cm直徑滅菌平皿、10 mL無菌吸管、1 mL無菌吸管、接種細(xì)菌圖案等。

1.2 試劑 MH肉湯培養(yǎng)基（上海信裕生物科技有限公司）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇、滅菌純凈水、75%乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；二甲基亞砜（上海麥恪林生化科技有限公司）；苯扎溴銨溶液（山東利爾康科技股份有限公司）；蒙藥“連翹-4味”湯散（由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供）。

1.3 藥物提取與樣品制備 取30 g“連翹-4味”湯散放入圓底燒瓶中以藥物與試劑1∶20的比例加入石油醚，在水浴鍋上80～90 ℃加熱回流，先放入300 mL石油醚回流3 h，再加入300 mL繼續(xù)回流3 h，離心3 000 r/min，10 min，取上清液，回收石油醚。將黏在圓底燒瓶內(nèi)壁的石油醚提取物刮起，用所提取的液體沖洗出來，倒入稱量好的空蒸發(fā)皿內(nèi)晾干，備用；前面所剩藥渣晾干稱重，將此藥渣放入圓底燒瓶內(nèi)，仍以藥物與試劑1∶20的比例放入氯仿，在水浴鍋上加熱60～70 ℃回流，至6 h后過濾，取濾液回收，黏在圓底燒瓶內(nèi)壁的提取物刮起，備用；將前面所剩藥渣晾干稱重，按上述同樣的方法用乙酸乙酯、無水乙醇分別回流提取，將提取物刮起，晾干備用；另取30 g“連翹-4味”湯散放入圓底燒瓶中，以藥物與水1∶20的比例加入水，將300 mL水加入用調(diào)溫電熱套回流3 h，再加入300 mL水繼續(xù)回流3 h，離心3 000 r/min，10 min取上清液，回收水，將黏在圓底燒瓶內(nèi)壁的提取物刮起，用所提取的液體沖洗出來，倒入稱量好的空蒸發(fā)皿內(nèi)晾干，備用。取30 g連翹-4味湯散，按上述水提液的相同方法，用75%乙醇回流提取，提取物晾干，備用。取晾干的不同溶劑提取物，溶解于二甲基亞砜，根據(jù)溶解程度分別配制成不同濃度的藥液。氯仿提取物濃度3.6 mg/mL、無水乙醇提取物濃度1.1 mg/mL、75%乙醇提取物濃度22 mg/mL、水提取物提取物濃度43.9 mg/mL、乙酸乙酯提取物濃度9.2 mg/mL、石油醚提取物濃度20 mg/mL。便于過濾除菌的樣本，以0.45 μm孔徑濾器過濾除菌，不便于過濾除菌的樣本，以100 ℃、25 min加熱滅菌。

1.4 菌種 溶血葡萄球菌Staphylococcus heamolyticus；表皮葡萄球菌Staphyloccocus epidermidis；雞腸球菌Enterococcus galinarum；炭疽桿菌Bacillus anthraci；枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis；大腸埃希菌Escherichia coli；銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa；鮑曼不動(dòng)桿菌Acinetobacter baumannii；陰溝桿菌Enterobacter cloacae；肺炎克雷伯菌K.peneumoniae；白假絲酵母C.albicans等11個(gè)菌株，大多數(shù)菌株自臨床標(biāo)本分離鑒定，其中銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa（CV CC3359 Pa.1）和炭疽桿菌Bacillus anthraci（63001-7，A16R）是購買于中國藥品生物制品檢定所的教學(xué)實(shí)驗(yàn)菌株。各種菌培養(yǎng)16 h的菌苔用MH肉湯稀釋成1×105CFU/mL菌液備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 微孔板TTC法測定最低抑菌濃度（MIC）

2.1.1 標(biāo)記并加培養(yǎng)基 取出密封包裝的無菌96孔培養(yǎng)板，做好標(biāo)記（檢測藥品名稱或編號、菌名、日期等），以12通道或8通道移液器向每孔中加MH肉湯培養(yǎng)基100 μL。

2.1.2 加檢測藥 每排的第1孔的100 μL培養(yǎng)基中加入100 μL藥液，混合后吸取100 μL混合液加入第2孔，以此類推至第10孔混合后棄去100 μL混合液，即倍比稀釋法。第11孔加陽性對照藥液苯扎溴銨，做為陽性對照；第12孔不加藥液做為細(xì)菌生長對照，即陰性對照。（加入菌液步驟后，不同檢測藥對應(yīng)的第1孔中，藥物的終濃度分別是氯仿提取物0.9 mg/mL、無水乙醇提取物0.275 mg/mL、75%乙醇提取物5.5 mg/mL、水提取物10.975 mg/mL、乙酸乙酯提取物2.3 mg/mL、石油醚提取物5 mg/mL。在此基礎(chǔ)上分別形成10個(gè)倍比濃度梯度。）

2.1.3 加陽性對照藥 第11列各孔中加入陽性對照藥液，60 μg/100 μL的苯扎溴銨溶液100 μL，混合后棄去100 μL混合液，使藥液濃度為30 μg/100 μL（加入100 μL菌液步驟后，苯扎溴銨的終濃度為15 μg/100 μL）。

2.1.4 加菌液 以8通道或12通道移液器從V型加樣槽中吸取用MH肉湯稀釋的1×105菌液100 μL，自藥物的低濃度梯度向高濃度梯度的順序加入同一微孔板各孔。通常每個(gè)微孔板只加一種菌液可防止交叉污染。

2.1.5 加入0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液 以8通道或12通道移液器吸取TTC溶液，自藥物的低濃度梯度向高濃度梯度的順序，每孔中加入TTC液5 μL，用微孔板振蕩器或其他方法震蕩混勻。

2.1.6 培養(yǎng) 加蓋以密封膜封口（實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件好可不必密封），放濕盒內(nèi)（或培養(yǎng)箱底層放純凈水盤）35 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)1 h后每小時(shí)觀察并記錄結(jié)果1次，至明顯出現(xiàn)紫色為止。生長較快的細(xì)菌在培養(yǎng)16 h后觀察結(jié)果，生長較慢的細(xì)菌培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，白色假絲酵母菌培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。

2.1.7 判斷結(jié)果

2.1.7.1 目測法判斷 出現(xiàn)明顯紫色孔為有細(xì)菌生長的現(xiàn)象，即細(xì)菌的生長未受到抑制；顏色如陽性對照孔（依然是剛加完所有試劑時(shí)的顏色），為沒有細(xì)菌生長的現(xiàn)象，即該稀釋度的藥物抑制了細(xì)菌的生長，出現(xiàn)此現(xiàn)象的最高稀釋度即為MIC濃度。

2.1.7.2 酶標(biāo)儀測定法 以450 nm波長檢測OD值，以第11列孔OD值為陽性參考值，以第12列孔OD值為陰性參考值。某一實(shí)驗(yàn)孔的OD值等于或者接近陽性對照孔OD值，即為有效的抑菌現(xiàn)象，出現(xiàn)有效的抑菌現(xiàn)象的最高稀釋度即為MIC；排除較高濃度有色實(shí)驗(yàn)藥液的影響，連續(xù)3個(gè)實(shí)驗(yàn)孔的OD值順序增高時(shí)，且其中最高稀釋度孔（第3孔）的OD值比陰性對照孔的OD值減少0.25以上時(shí)，以第2個(gè)孔的稀釋度為MIC。

2.1.8 微孔板TTC法測定MIC結(jié)果

利用酶標(biāo)儀測定法結(jié)合目測法判斷結(jié)果，不同溶劑提取物MIC結(jié)果見表1。

2.2 瓊脂平板連續(xù)稀釋法測定MIC

2.2.1 配制不同溶劑提取物藥液 將不同溶劑提取物分別用二甲基亞砜配制成20 mg/mL濃度的溶液或混懸液，以倍比稀釋法配制9個(gè)濃度梯度。

2.2.2 制備含藥瓊脂培養(yǎng)基 在做好標(biāo)記的9 cm直徑滅菌平皿中，分別加入1.5 mL不同濃度梯度的藥液，隨之加入13.5 mL融化預(yù)溫的MH瓊脂培養(yǎng)基，充分混勻，平放待凝固。每一種藥物的不同濃度各制備2個(gè)平板備用。

2.2.3 接種細(xì)菌 將含藥瓊脂平板置于自制的細(xì)菌點(diǎn)種圖案上，以移液器吸取2 μL菌液（約104個(gè)細(xì)菌），按圖案對應(yīng)位置接種細(xì)菌，將菌液均勻攤開成5～8 mm2面積。點(diǎn)種位置見圖1。

2.2.4 培養(yǎng)與觀察結(jié)果：置35 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。培養(yǎng)生長現(xiàn)象見圖2。

2.2.5 判定結(jié)果方法 足夠濃度的藥物能抑制點(diǎn)種細(xì)菌的生長，否則有菌落或菌苔形成。完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度，為該藥物對供試菌的MIC（接種位置生長1～2個(gè)菌落時(shí)可以忽略不計(jì)）。瓊脂平板連續(xù)稀釋法測定MIC結(jié)果見表2。

2.3 瓊脂平板轉(zhuǎn)種法測定MAC

2.3.1 制備MH平板 根據(jù)表1中不同溶劑提取物對不同細(xì)菌分別出現(xiàn)MIC值的數(shù)量，制備MH平板。參考瓊脂平板連續(xù)稀釋法測定MIC時(shí)點(diǎn)種細(xì)菌的圖案，做好標(biāo)記。

2.3.2 轉(zhuǎn)種MH平板 根據(jù)表1，從判讀完MIC結(jié)果的微孔板孔中吸取培養(yǎng)液2 μL（參照2.2.3步驟）點(diǎn)種涂布到MH平板的標(biāo)記位置。原則是選擇吸取MIC濃度孔及其以上2～3個(gè)濃度孔中的培養(yǎng)液，因?yàn)椋挥兴幬餄舛鹊扔诨虼笥贛IC時(shí)才可能出現(xiàn)MBC結(jié)果。置35 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

2.3.3 觀察MBC結(jié)果 理論上MBC是指抗菌藥物能使活菌生長減少99%以上的最小濃度。平板上點(diǎn)種涂布培養(yǎng)液的標(biāo)記位置完全沒有細(xì)菌生長出的最低濃度為MBC（接種位置生長1～2個(gè)菌落時(shí)可以忽略不計(jì)）。不同提取物的MBC濃度見表3。

3 討論

我們采用微孔板液體稀釋法和瓊脂平板連續(xù)稀釋法測定MIC，2種方法互為驗(yàn)證，意在獲得較為確切的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，2種實(shí)驗(yàn)方法測得的MIC數(shù)據(jù)具有較好的一致性。結(jié)果證明蒙藥“連翹-4味”湯的氯仿、無水乙醇、乙酸乙酯、75%乙醇、石油醚等溶劑提取物，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、枯草桿菌、炭疽桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單細(xì)胞菌、陰溝桿菌、白色假絲酵母菌等11種菌均有不同程度的抑菌作用。微孔板液體稀釋法實(shí)驗(yàn)中，水浸提取物僅在較高濃度時(shí)對枯草芽胞桿菌和陰溝桿菌有一定的抑制生長作用。而在瓊脂平板連續(xù)稀釋法實(shí)驗(yàn)中，水浸提取物僅在較高濃度時(shí)對腸球菌和銅綠假單胞菌有一定的抑制生長作用。2種實(shí)驗(yàn)方法中，相同的藥物提取物對少數(shù)供試菌出現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因，除了實(shí)驗(yàn)條件的控制因素外，首先可能與不同的細(xì)菌在液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中的生長活力不同有關(guān)，其次可能與藥物在液體和固體培養(yǎng)基中保持和發(fā)揮活性的狀態(tài)不同有關(guān)。這種現(xiàn)象在本文中的MAC測定中同樣有所表現(xiàn)。

我們采用瓊脂平板轉(zhuǎn)種法測定MAC，結(jié)果證明蒙藥“連翹-4味”湯的氯仿、無水乙醇、75%乙醇、水、乙酸乙酯、石油醚等溶劑提取物，對多數(shù)供試菌有不同程度的殺菌作用。其中，醇提取物顯示了較為廣譜的殺菌作用；氯仿提取物和乙酸乙酯提取物，對革蘭陽性菌和真菌表現(xiàn)了明顯的殺菌作用；“連翹-4味”湯的6種提取物，綜合顯示了對腸球菌、枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等4種供試菌明顯的殺菌作用；葡萄球菌、炭疽芽胞桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單細(xì)胞菌和陰溝桿菌等供試菌，對“連翹-4味”湯的6種提取物顯示了較強(qiáng)的抗性。

傳統(tǒng)蒙藥連翹-4味湯散（別名：音達(dá)日西湯）由止瀉木、查干泵噶、拳參、川木通組成，涼性，有祛熱、止瀉功效，主治腸熱痢疾、腹痛、腹瀉作用[2]?，F(xiàn)代蒙醫(yī)臨床為提高療效等原因，止瀉木由連翹替代，查干泵噶由麥冬替代[6]。連翹的現(xiàn)代研究結(jié)果表明，抗病原微生物范圍非常廣，對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有抑制作用，所含齊墩果酸和熊果酸具有明顯的保肝作用[7]；川木通藥理研究結(jié)果表明具有強(qiáng)心作用[7]；麥冬含有甾體皂苷具有提高耐缺氧能力，抗心律失常、減少心肌耗氧量[8]；拳參含有鞣質(zhì)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有很好的抑菌作用。包云峰，富玉蘭等研究的“蒙藥音達(dá)日-西湯（即連翹-4味湯散）與八種抗菌藥物對志賀氏菌屬體外抗菌活性比較研究”[9]結(jié)果顯示蒙藥連翹-4味湯散的抗菌效果顯著。

金黃色葡糖球菌是目前臨床常見的致病菌之一，可引起皮膚軟組織感染及敗血癥及導(dǎo)管相關(guān)性感染等多種疾病[10]。表皮葡萄球菌是凝固酶陰性葡萄球菌中主要的致病性革蘭陽性球菌[11]?？梢鹑祟惖臄⊙Y、菌血癥、呼吸道感染、人工關(guān)節(jié)感染、骨髓感染、傷口感染等疾病[12]。腸球菌是寄殖于腸道內(nèi)的正常菌叢，是一種條件致病菌[13]，是醫(yī)院常見致病菌，可導(dǎo)致人體多臟器感染，病死率可達(dá)21%～27.5%[14]。炭疽桿菌是歷史上第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的炭疽病的病原體，致病性非常強(qiáng)[15]。大腸埃希菌是臨床最常見的致病菌，感染部位廣泛，耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重[16]。鮑曼不動(dòng)桿菌是常見的醫(yī)院內(nèi)感染非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，耐藥性強(qiáng)，治療藥物種類及其有限，導(dǎo)致的感染有呼吸道感染、敗血癥、傷口或術(shù)后感染、泌尿系統(tǒng)感染及繼發(fā)性腦膜炎等[17]。肺炎克雷伯菌是臨床常見的條件致病菌，也是呼吸道感染的重要病原菌之一。對抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重的菌類[18]。鮑曼不動(dòng)桿菌是廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境，是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，可引起呼吸機(jī)相關(guān)肺炎、尿路感染、敗血癥、創(chuàng)口感染及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等[19]。銅綠假單細(xì)胞菌，廣泛分布于自然界，也是一種條件致病菌。陰溝桿菌是臨床常見的條件致病菌，正常存在于人和動(dòng)物胃腸道和呼吸道，當(dāng)患者抵抗力低下或疾病狀態(tài)下，導(dǎo)致正常菌群失調(diào)而使人感染[20]。白色假絲酵母菌是正常人口腔、呼吸道、腸道及陰道粘膜表面的正常菌群，是院內(nèi)感染的條件致病菌之一，感染者病情大多嚴(yán)重，尤其是嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，年老體弱者感染致死率高達(dá)40%[21]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，近年來體內(nèi)外抗病原體研究方面頗有成效，例如食積通過影響機(jī)體lgM、Lfn-γ、Ll-4及TH1/TH2水平對流感病毒（FM1）小鼠的免疫失衡產(chǎn)生影響、陳麗萍等研究發(fā)現(xiàn)大承氣湯對大腸桿菌有良好的體外抑菌作用等。因此本次研究，對該方劑進(jìn)行的不同提取物的提取方法和系統(tǒng)的抗菌作用實(shí)驗(yàn)是初步的探索，為進(jìn)一步的研究打下了一定的基礎(chǔ)。其重要意義在于對臨床分離的多種耐藥菌株表現(xiàn)了良好的體外抗菌作用，預(yù)示了較高的研發(fā)價(jià)值。

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（2016-08-25收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）