趙秋芳　馬海洋　陳曙　陳宏良　賈利強(qiáng)

摘 要 泛素活化酶是蛋白泛素化所需的第一個(gè)酶，在泛素蛋白酶體途徑中發(fā)揮重要作用。本文利用生物信息學(xué)方法從番茄基因組中鑒定出2個(gè)泛素活化酶（ubiquitin activating enzyme，UBA）基因，命名為SlUBA1和 SlUBA2。序列分析表明SlUBA1和SlUBA2基因的CDS序列長(zhǎng)分別為3 060和3 255 bp，分別編碼1 019和1 084個(gè)氨基酸，編碼蛋白分子量為114.15和120.46 ku，分別位于第6和9染色體。2個(gè)基因均含有5個(gè)內(nèi)含子，編碼蛋白均為酸性、疏水性蛋白；對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)UBA蛋白均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)均定位于細(xì)胞核。序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析表明番茄UBA基因與其他物種UBA基因相似性高，進(jìn)化過(guò)程非常保守。番茄不同組織表達(dá)分析結(jié)果表明2個(gè)UBA基因在根系和花的表達(dá)量較高，果實(shí)成熟過(guò)程中的表達(dá)量相對(duì)較低。非生物脅迫試驗(yàn)結(jié)果表明：SlUBA1基因在低溫、干旱和鹽脅迫下均上調(diào)表達(dá)；而SlUBA2基因?qū)Ψ巧锩{迫沒(méi)有明顯響應(yīng)，這些結(jié)果表明SlUBA1基因可能參與番茄對(duì)低溫、干旱和鹽脅迫的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞 番茄；泛素活化酶基因；進(jìn)化分析；基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào) S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Ubiquitin activating enzyme is the first enzyme which combined with ubiquitin and protein， playing an important role in the ubiquitin-proteasome pathway（UPP）. In this study， we identified two ubiquitin activating enzyme（UBA）genes designated as SlUBA1 and SlUBA2 from tomato genome using bioinformatics methods. Sequence analysis of SlUBA1 and SlUBA2 revealed that the CDS lengths waere 3 060 and 3 255 bp respectively， encoding the proteins of 1 019 and 1 084 amino acids with predicted molecular weight of 114.15 and 120.46 ku， located on No.6 and 9 chromosome， separately. The two SlUBA genes both contained 5 introns， encoding acidic and hydrophobic protein. The predicted secondary structure suggested that the main structure of two proteins were alpha helix and random coil； The subcellular localization were predicted in the nucleus. Sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that the UBA genes of tomato had high similarity to the UBA genes in other species and indicated that the evolution process of the UBA family was very conservative. The expression of two SlUBA genes in different tissues were investigated， which were highly expressed in roots and flowers， while had low expression in fruit ripening stage. Abiotic stress treated results showed that the expression levels of SlUBA1 was upregulated under cold， drought and salt stress， while the gene of SlUBA2 had no significant change. These results indicated that SlUBA1 genes may be involved in the response of tomato to low temperature， drought and salt stresses.

Key words Tomato； ubiquitin activating enzyme（UBA）gene； phylogeny analysis； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.016

蛋白質(zhì)作為非常重要的生命大分子，在生命活動(dòng)的各個(gè)方面發(fā)揮著重要的作用。蛋白質(zhì)的合成和降解均影響著生命活動(dòng)的進(jìn)行。泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway）是真核生物蛋白高效專(zhuān)一降解的重要調(diào)控機(jī)制之一。蛋白泛素化過(guò)程主要通過(guò)3種酶來(lái)完成：首先泛素活化酶（E1）在ATP的幫助下催化泛素分子C末端甘氨酸（Gly）殘基與E1的半胱氨酸（Cys）殘基形成一個(gè)高能硫酯鍵，活化的泛素分子通過(guò)轉(zhuǎn)酯作用從E1轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶（E2）的Cys殘基上，形成E2-Ub復(fù)合物，E2-Ub復(fù)合物在 泛素連接酶（E3）協(xié)同作用下，把活化的泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白上[1]。泛素活化酶（E1）是泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第一個(gè)酶，在蛋白泛素化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。泛素活化酶（E1）的催化能力很強(qiáng)，在大部分物種中只需要一種E1酶就可以激活泛素化的整個(gè)過(guò)程[2]。

E1是一種廣泛表達(dá)的多肽，大約1 100個(gè)氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基。1991年首次發(fā)現(xiàn)人的泛素活化酶UBE1，并證實(shí)半胱氨酸殘基與泛素活化酶的活性功能相關(guān)[3]。目前，泛素活化酶基因己經(jīng)從多種生物中分離得到，包括兔、酵母、小鼠、擬南芥、小麥、煙草、茶樹(shù)等[4-10]。酵母基因組編碼單一的泛素活化酶，該基因缺失對(duì)酵母是致死的，說(shuō)明E1蛋白對(duì)于酵母細(xì)胞的生存是至關(guān)重要的[11]。在哺乳動(dòng)物中，泛素活化酶首次被定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，并存在2種亞型E1a和E1b[12-15]。在植物中存在多種類(lèi)型E1基因，在擬南芥中有2個(gè)基因編碼泛素活化酶，分別為AtUBA1和AtUBA2，2個(gè)基因編碼蛋白存在81%的相似氨基酸[7]。從小麥胚芽中分離到3種類(lèi)型的 E1蛋白，編碼基因命名為 TaUBA 1-3[8]，在煙草中分離出煙草泛素活化酶基因NtE1A和NtE1B[9]。研究表明植物與酵母和哺乳動(dòng)物的E1的序列高度保守[16-17]。目前，有關(guān)泛素活化酶的研究主要集中在擬南芥、小麥等模式植物中，番茄泛素活化酶的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。番茄是重要的蔬菜作物，同時(shí)也是研究果實(shí)成熟和植物逆境脅迫的模式植物。隨著番茄全基因組的測(cè)序成功，更多基因資源可供挖掘利用，也為鑒定番茄E1家族基因提供數(shù)據(jù)支持。本研究中，從番茄全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出2個(gè)番茄泛素活化酶（E1）基因，并對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)和進(jìn)化等生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)番茄泛素活化酶基因家族成員在不同組織和逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為后期番茄泛素活化酶的功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄品種為測(cè)序品種“Heinz 1706”，在番茄營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段取根、莖、 葉，在生殖生長(zhǎng)階段取花和各果實(shí)發(fā)育階段（包括小果、綠熟果、轉(zhuǎn)色果、紅熟果）樣品。脅迫處理試驗(yàn)：選取“Heinz 1706”生長(zhǎng)飽滿(mǎn)的種子，培養(yǎng)2周后，選取生長(zhǎng)一致幼苗各12株進(jìn)行脅迫處理. 低溫處理：將幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；干旱處理：將幼苗置于20% PEG-6000溶液中；鹽處理：將幼苗置于200 mmol/L NaCl 溶液中。樣品分別在處理0、1、6、24 h取樣，并用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 番茄泛素活化酶基因家族檢索和鑒定 在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Tair（https：//www.arabidopsis.org/）中搜索出已知的泛素活化酶（UBA）基因及其編碼的蛋白序列，根據(jù)擬南芥UBA的蛋白序列在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SOL（https：//solgenomics.net/）和Phytozome11.0（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）搜索番茄UBA候選基因，并利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)候選基因的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定，凡是含有UBA基因保守結(jié)構(gòu)域的蛋白即為番茄UBA成員。在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SOL中查出了所有UBA基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度、染色體位置、內(nèi)含子個(gè)數(shù)等基本信息；利用在線(xiàn)工具Expasy roteomics Server（http：//web.expasy.org）進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)分析；利用在線(xiàn)SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)候選蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用plant-mploc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）分析番茄UBA基因成員的亞細(xì)胞定位，利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線(xiàn)工具對(duì)基因外顯子-內(nèi)含子作圖。

1.2.2 番茄泛素活化酶序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析

利用Clustal X1.83對(duì)番茄、擬南芥、小麥的UBA家族氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并用MEGA 6.0構(gòu)建番茄、擬南芥、小麥、小鼠、酵母、人類(lèi)的UBA家族成員進(jìn)化樹(shù)，分析其進(jìn)化關(guān)系。進(jìn)化樹(shù)采用遺傳距離建樹(shù)法的相鄰連接法（Neighbor-Joining，NJ）建樹(shù)，對(duì)生成的樹(shù)進(jìn)行自檢，重復(fù)設(shè)定為1 000次。

1.2.3 番茄泛素活化酶基因表達(dá)分析 采用植物RNA提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品）提取番茄總RNA，樣品RNA經(jīng)檢測(cè)質(zhì)量和濃度后，利用M-MLV（Rnase H-）逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司）合成cDNA模板，稀釋備用。根據(jù)番茄UBA基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)定量引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列詳見(jiàn)表1。利用熒光實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒為SYBR Green Realtime PCR Master mix（TaKaRa公司），反應(yīng)體系為10 μL，SYBR Premix Ex TaqTmⅡ，5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，無(wú)菌雙蒸餾水2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算UBA基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄UBA家族基因鑒定及理化性質(zhì)分析

為鑒定番茄UBA家族基因，本研究采用擬南芥的氨基酸序列作為靶序列，利用BLASTP方法對(duì)番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和Phytozome11.0進(jìn)行檢索，并對(duì)候選基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域檢測(cè)，最終鑒定出2個(gè)番茄UBA基因，SGN編號(hào)為Solyc06g007320.2.1和Solyc09g018450.2.1，分別命名為SlUBA1和SlUBA2。番茄UBA基因家族的CDS長(zhǎng)度、氨基酸數(shù)目、內(nèi)含子個(gè)數(shù)、分子量以及等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、疏水性和脂肪系數(shù)等理化性質(zhì)均非常相似（表2、圖1）。

SlUBA1位于第6染色體，基因方向?yàn)榉聪?，CDS序列長(zhǎng)度3 060 bp，編碼1 091個(gè)氨基酸，5個(gè)內(nèi)含子，編碼蛋白分子量為114.15 ku，等電點(diǎn)為5.05，不穩(wěn)定指數(shù)為31.88，平均疏水性（GRAVY）-0.233， 脂肪系數(shù)（AI）86.15。SlUBA2位于第9染色體，基因方向?yàn)檎颍珻DS序列長(zhǎng)度3 255 bp，編碼1 084個(gè)氨基酸，5個(gè)內(nèi)含子，編碼蛋白分子量為120.46 ku，等電點(diǎn)為4.99，不穩(wěn)定指數(shù)為34.33，平均疏水性（GRAVY）-0.232，脂肪系數(shù)（AI）85.48（表2）。

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析（表3）表明：2個(gè)UBA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋，擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)則卷曲4種形式組成，且以α-螺旋所占比例最高，其次為無(wú)規(guī)則卷曲，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最小。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明2個(gè)番茄UBA蛋白均定位于細(xì)胞核中。

2.2 番茄UBA家族基因序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)不同物種中UBA蛋白序列進(jìn)行完全比對(duì)發(fā)現(xiàn)SlUBA1和SlUBA2與擬南芥、小麥中UBA蛋白的同源性非常高，而且具有非常保守的序列和結(jié)構(gòu)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)SlUBA1與AtUBA2、AtUBA1、TaUBA1、TaUBA3蛋白序列一致性分別為78%、80.6%、78.8%、74.6%；SlUBA2與AtUBA2、AtUBA1、TaUBA1、TaUBA3的一致性分別為74%、74.5%、76.1%、72.3%。SlUBA1和SlUBA2之間的一致性達(dá)80.3%（表4）。

為了更好的了解E1基因家族成員與其他真核生物E1基因間的進(jìn)化關(guān)系，利用已知的人類(lèi)、小鼠、酵母、擬南芥、小麥和番茄的UBA蛋白共10個(gè)序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中SlUBA1和SlUBA2與擬南芥和小麥UBA聚在一起，驗(yàn)證UBA基因進(jìn)化過(guò)程的保守性，且UBA基因的祖先在單雙子葉植物分離之前就已存在。另外發(fā)育樹(shù)植物、動(dòng)物和酵母等真核生物中的UBA基因大都聚集在一起，這也說(shuō)明UBA基因進(jìn)化過(guò)程具有很高的保守性。

2.3 番茄UBA家族基因在番茄不同組織中的表達(dá)模式分析

為了更好了解SlUBA基因的潛在功能，分析了SlUBA基因在不同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式，詳見(jiàn)圖3。SlUBA基因在番茄8種組織/器官中均有表達(dá)，但其表達(dá)模式有所差異。SlUBA1在根系中表達(dá)量最高，其次為花，在小果中表達(dá)量最低，表達(dá)量最高約為最低的3倍。SlUBA2在花中的表達(dá)量最高，其次為根，在綠熟果的表達(dá)量最低，表達(dá)量最高約為最低的4倍。

2.4 番茄UBA家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

圖4所示為番茄UBA家族基因在低溫、干旱和鹽脅迫下的表達(dá)量變化。4 ℃低溫脅迫處理下，SlUBA1基因表達(dá)量在1～6 h下降，24 h達(dá)到最高值，為對(duì)照處理的2.95倍；在干旱脅迫下，SlUBA1表達(dá)量在1 h迅速增加到最大值，為對(duì)照的2.45倍，隨后6～24 h表達(dá)水平逐漸下降；鹽脅迫處理SlUBA1呈逐漸上升的趨勢(shì)，24 h表達(dá)量最高，為對(duì)照的3.5倍。相對(duì)SlUBA1表達(dá)量的變化，SlUBA2在各脅迫處理下均未見(jiàn)顯著的表達(dá)量變化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SlUBA1可能響應(yīng)低溫、干旱和鹽脅迫，而SlUBA2對(duì)非生物脅迫沒(méi)有明顯響應(yīng)。

3 討論

泛素活化酶是泛素蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)中關(guān)鍵酶，目前已有多個(gè)真核生物中的泛素活化酶基因被鑒定出來(lái)，但是番茄中仍未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)生物信息學(xué)方法共鑒定2個(gè)SlUBA基因，其編碼氨基酸分別為1 019和1 084 aa，預(yù)測(cè)蛋白分子量為114.15和120.46 ku，與已知的擬南芥、小麥和煙草的UBA蛋白相似[7-9]，且2個(gè)SlUBA基因的內(nèi)含子數(shù)量和結(jié)構(gòu)也與擬南芥相一致[7]。已有研究表明擬南芥中NtE1A，NtE1B二者氨基酸序列相似度達(dá)81%，煙草NtUBA1和NtUBA2氨基酸序列相似度達(dá)98%，本研究中序列比對(duì)結(jié)果表明SlUBA1和SlUBA2氨基酸序列相似度達(dá)80.3%，與擬南芥和煙草的研究結(jié)果相一致。另外番茄與擬南芥和小麥的UBA氨基酸序列相似度在74%～80%之間，表明UBA基因在物種進(jìn)化過(guò)程非常保守，與其他真核生物的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果這證實(shí)了UBA基因進(jìn)化的保守性。

E1s可以激活泛素分子，是蛋白泛素化途徑中第一個(gè)起作用的酶，因此E1基因的表達(dá)模式有可能對(duì)植物的組織建成和生長(zhǎng)發(fā)育有一定的作用。擬南芥中UBA基因在不同組織中均有表達(dá)，且UBA在代謝較為活躍的組織細(xì)胞中表達(dá)量最高，包括維管束中的薄壁細(xì)胞、新葉、分生組織、花藥、子房和柱頭等[7]。番茄不同組織中UBA基因的表達(dá)模式分析結(jié)果表明：番茄UBA基因在不同組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)量存在差異，2個(gè)基因均在根和花中表達(dá)量較高，而在果實(shí)發(fā)育各個(gè)發(fā)育階段表達(dá)量相對(duì)較低，且在大多數(shù)組織中呈現(xiàn)共表達(dá)的模式，這與擬南芥中的研究結(jié)果一致[7]，該研究結(jié)果說(shuō)明在番茄根系和花的生長(zhǎng)發(fā)育需要泛素化途徑，而在果實(shí)發(fā)育各個(gè)時(shí)期需求較小。

研究發(fā)現(xiàn)，高等植物在應(yīng)對(duì)高溫、低溫、干旱等逆境時(shí)均會(huì)產(chǎn)生各種脅迫蛋白[18]，而泛素蛋白酶體途徑（UPP）可以高效且高度選擇性地對(duì)細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)進(jìn)行部分或完全降解，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種代謝過(guò)程的內(nèi)在生理調(diào)節(jié)[19]，在逆境條件下，泛素蛋白酶體降解途徑通過(guò)降解不正常的蛋白以維持植物體的氨基酸的數(shù)目；同時(shí)通過(guò)去除一些限速反應(yīng)酶和一些調(diào)節(jié)因子來(lái)精確調(diào)控生理平衡，以使植物適應(yīng)外界環(huán)境，抵御外界脅迫。煙草侵染煙草花葉病毒（TMV）和番茄花葉病毒（ToMV）后NtE1A和NtE1B基因上調(diào)表達(dá)，侵染黃瓜花葉病毒（CMV）并未上調(diào)表達(dá)，另外NtE1A和NtE1B基因在煙草受到機(jī)械傷害和水楊酸、茉莉酸、乙酸激素處理后均上調(diào)表達(dá)[9]。這一研究結(jié)果表明UBA作為泛素蛋白酶體降解途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，其在植物應(yīng)答逆境脅迫發(fā)揮作用。最新研究結(jié)果表明擬南芥超表達(dá)鹽土植物香雪球的LmVHA-E1基因可以顯著提高其耐旱和耐鹽能力[20]，這也證實(shí)E1基因響應(yīng)脅迫環(huán)境中的作用。本研究分析了番茄UBA基因在低溫，鹽和干旱脅迫下的表達(dá)差異，結(jié)果表明在低溫、鹽和干旱脅迫下SlUBA1基因均上調(diào)表達(dá)，而SlUBA2對(duì)低溫、、鹽和干旱等逆境脅迫沒(méi)有明顯響應(yīng)，表明SlUBA1基因表達(dá)受非生物脅迫誘導(dǎo)，可以推測(cè)在番茄的泛素蛋白酶體途徑中主要是由SlUBA1基因主要負(fù)責(zé)泛素活化作用。而在煙草中2個(gè)E1基因在響應(yīng)逆境脅迫和應(yīng)答激素處理時(shí)呈現(xiàn)共表達(dá)模式[9]，與本研究結(jié)果不一致，說(shuō)明不同作物的E1基因應(yīng)答逆境脅迫的模式并不完全相同。

本文通過(guò)對(duì)番茄UBA基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，共鑒定出2個(gè)候選SlUBA成員，并對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)分析了SlUBA在番茄不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)模式差異，結(jié)果表明SlUBA基因在根和花中表達(dá)量較高，在果實(shí)發(fā)育階段表達(dá)量相對(duì)較低；SlUBA1基因能夠被多種非生物脅迫（低溫、干旱、鹽）不同程度誘導(dǎo)表達(dá)，而SlUBA2基因表達(dá)未受非生物脅迫誘導(dǎo)，可以推測(cè)在蛋白泛素化過(guò)程中可能是SlUBA1起主要的泛素活化作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Glickman M H， Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway： destruction for the sake of construction[J]. Physiological Reviews， 2002， 82（2）： 373-428.

[2] Pickart C M. Mechanisms underlying ubiquitination[J]. Annual review of biochemistry， 2001， 70（1）： 503-533.

[3] Handley P M， Mueckler M， Siegel N R， et al. Molecular cloning， sequence， and tissue distribution of the human ubiquitin-activating enzyme E1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1991， 88（1）： 258-262.

[4] Sun B， Jeyaseelan K， Chung M C M， et al. Rabbit ubiquitin-activating enzyme E1： cDNA cloning， sequence and expression[J]. Gene， 1997， 196（1）： 19-23.

[5] Dohmen R J， Stappen R， McGrath J P， et al. An essential yeast gene encoding a homolog of ubiquitin-activating enzyme[J]. Journal of Biological Chemistry， 1995， 270（30）： 18 099-18 109.

[6] Mitchell M J， Woods D R， Tucker P K， et al. Homology of a candidate spermatogenic gene from the mouse Y chromosome to the ubiquitin-activating enzyme El[J]. Nature， 1991， 354（6 353）： 483-486.

[7] Hatfield P M， Gosink M M， Carpenter T B， et al. The ubiquitin-activating enzyme（E1） gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal， 1997， 11（2）： 213-226.

[8] Hatfield P M， Vierstra R D. Multiple forms of ubiquitin-activating enzyme E1 from wheat. Identification of an essential cysteine by in vitro mutagenesis[J]. Journal of Biological Chemistry， 1992， 267（21）： 14 799-14 803.

[9] Takizawa M， Goto A， Watanabe Y. The tobacco ubiquitin-activating enzymes NtE1A and NtE1B are induced by tobacco mosaic virus， wounding and stress hormones[J]. Molecules & Cells （Springer Science & Business Media BV）， 2005， 19（2）： 228-231.

[10] 鄧婷婷， 吳 揚(yáng)， 李 娟， 等. 茶樹(shù)泛素活化酶基因全長(zhǎng) cDNA克隆及序列分析[J]. 茶葉科學(xué)， 2012， 32（6）： 500-508.

[11] Glickman M H， Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway： destruction for the sake of construction[J]. Physiological reviews， 2002， 82（2）： 373-428.

[12] Stephen A G， Trausch-Azar J S， Handley-Gearhart P M， et al. Identification of a region within the ubiquitin-activating enzyme required for nuclear targeting and phosphorylation[J]. Journal of Biological Chemistry， 1997， 272（16）： 10 895-10 903.

[13] Cook J C， Chock P B. Isoforms of mammalian ubiquitin-activating enzyme[J]. Journal of Biological Chemistry， 1992， 267（34）： 24 315-24 321.

[14] Schwartz A L， Trausch J S， Ciechanover A， et al. Immunoelectron microscopic localization of the ubiquitin-activating enzyme E1 in HepG2 cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1992， 89（12）： 5 542-5 546.

[15] Trausch J S， Grenfell S J， Handley-Gearhart P M， et al. Immunofluorescent localization of the ubiquitin-activating enzyme， E1， to the nucleus and cytoskeleton[J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology， 1993， 264（1）： C93-C102.

[16] Callis J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system[M]. The Arabidopsis Book， 2014， 12： e0 174.

[17] 杜秋麗， 李 莉. 植物泛素化系統(tǒng)[J]. 濟(jì)寧學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011， 32（3）： 51-55.

[18] O'Mahony P J， Oliver M J. The involvement of ubiquitin in vegetative desiccation tolerance[J]. Plant Molecular Biology， 1999， 41（5）： 657-667.

[19] Sgourakis N G， Patel M M， Garcia A E， et al. Conformational dynamics and structural plasticity play critical roles in the ubiquitin recognition of a UIM domain[J]. Journal of molecular biology， 2010， 396（4）： 1 128-1 144.

[20] Dabbous A， Saad R B， Brini F， et al. Over-expression of a subunit E1 of a vacuolar H+-ATPase gene（Lm VHA-E1） cloned from the halophyte Lobularia maritima improves the tolerance of Arabidopsis thaliana to salt and osmotic stresses[J]. Environmental and Experimental Botany， 2017， 137（2）： 128-141.